本文展示了在成年小鼠中建立的一种保留中央管微环境（该微环境容纳内源性神经干细胞（NSCs））的最小化脊髓损伤模型的操作方法。我们介绍了如何利用神经球形成实验来定量分析损伤后确定性神经干细胞和原始神经干细胞的激活与迁移情况。
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摘要
摘要
成年哺乳动物脊髓中的神经干细胞（NSCs）是一类相对处于有丝分裂静息状态的室管膜周围细胞，可对其进行研究 体外 使用神经球实验。该集落形成实验是研究神经干细胞（NSCs）在体外对外源性因素反应的有力工具；然而，它也可用于研究外源性因素对 体内 在充分理解该检测方法的优势与局限性的基础上进行操作。一个具有临床意义的操作是研究损伤对内源性神经干细胞（NSC）激活的影响。目前的脊髓损伤模型在研究这一问题时存在挑战，因为常见的挫伤、压迫和横断模型造成的损伤程度较重，会导致位于损伤部位的NSC生态位被破坏，而该区域正是干细胞所处的位置。本文介绍一种微小损伤模型，可在成年小鼠胸段下部（T7/8）脊髓的背外侧浅表区域造成局部损伤。该损伤模型保留了损伤节段的中央管结构，从而允许在损伤后的不同时间点对位于损伤节段的NSCs进行分析。本文展示了如何利用神经球形成实验（neurosphere assay）来研究脊髓脑室周围区域中两种不同的、谱系相关的NSC群体——原始神经干细胞（pNSCs）和定型神经干细胞（dNSCs）——的激活情况。我们阐述了如何从损伤节段的脑室周围区域以及白质损伤部位分离并培养这些NSCs。术后脊髓解剖结果显示，与对照组相比，损伤组脑室周围区域中pNSC和dNSC来源的神经球数量增加，表明这些细胞因损伤而被激活。此外，损伤后可在损伤部位分离出dNSC来源的神经球，证明NSCs能够从其脑室周围生态位迁移至损伤部位。
引言
中枢神经系统包含一群能够自我更新的多能干细胞，这类细胞具有分化为所有不同类型成熟神经细胞的潜能1,2,3,4这些神经干细胞（NSCs）存在于脑和脊髓中的特化微环境中，并可在损伤后被激活 损伤后增殖、迁移并分化为成熟的神经细胞。在皮质损伤模型中，已证实神经干细胞（NSCs）及其子代细胞能够迁移至损伤部位。5,6在脑内，神经干细胞（NSCs）已被证实可从侧脑室迁移至损伤部位，并分化为星形胶质细胞，参与胶质瘢痕的形成7然而，在脊髓中，关于这些内源性神经干细胞是否能够被利用以促进脊髓损伤后的恢复，相关研究仍十分有限。事实上，目前尚存争议：脊髓中干细胞池的激活是否需要对中央管周围室管膜下区这一微环境造成直接的物理性损伤。8 或者脊髓实质受损（干细胞微环境保持完整）的程度是否足以激活内源性神经干细胞9.
已采用多种脊髓损伤（SCI）模型来研究急性和慢性损伤的病理生理学....
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方案
本方案已获多伦多大学动物护理委员会批准，并符合 "实验动物护理与使用指南" (2nd 版本，加拿大动物护理委员会，2017。
1. 脊髓损伤的微创手术
注意：手术前，请确保所有手术器械和材料均已通过适当方法灭菌（图1A）。
- 通过卷起4至5块纱布方块，并用胶带在中间将它们固定在一起，制成一个固定的纱布卷，作为胸部支撑弓。
- 将小鼠放入诱导室，使用5%异氟烷开始麻醉。在开始操作前及整个手术过程中，需确认小鼠无足趾夹捏反射。由于手术可能需要30分钟以上才能完成，应优化异氟烷暴露剂量（先以5%浓度麻醉5分钟，其余时间调整为2–3%）。
- 将小鼠转移至连接麻醉机的鼻罩，以2–3%异氟烷维持剂量进行麻醉。使用毛发剪从动物背部中段向上至颈部/耳部区域去除背侧毛发，以暴露用于手术的较大矩形皮肤区域。
- 将小鼠转移至立体定位仪，将其鼻子放入附带的鼻锥中，并用耳杆固定颅骨。安装耳杆时维持异氟烷浓度为5%，待小鼠在立体定位仪中固定后，将其浓度降至2–3%。
- 术前经腹腔注射镇痛药物——美洛昔康（2.0 mg/kg）。在麻醉期间，于小鼠睁开的眼部充分涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。
- 将胸椎支撑弓置于小鼠腹部下方，同时轻轻牵拉尾根部以伸....
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结果
术后，小鼠应仅有轻微的运动功能障碍，可能包括尾巴和后肢短暂性轻瘫，持续时间不超过24小时。此后，小鼠不应出现后肢瘫痪和/或轻瘫，步态也仅有轻微改变。
图3展示了脊髓轻微损伤后5天神经球实验的代表性结果。损伤后，来源于dNSC的神经球（在EFH中培养）的绝对数量多于来源于pNSC的神经球（在LIF中培养）的数量（分别为图3A和3B）。高倍镜下观察明确神经球（图3C）和原始神经球（图3D）的图像显示了这两类不同克隆在形态上的差异：明确神经球直径较大（≥80 µm），通常具有较大的深色中心；而原始神经球体积较小（≥50 µm），细胞排列更为紧密。图.......
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讨论
在手术过程中，研究人员需特别关注若干关键步骤，以获得最佳结果并尽量减少动物间的个体差异。手术期间需谨慎使用吸入式麻醉剂（异氟烷），因为已有研究表明，长时间暴露于该麻醉剂会产生神经保护作用27。因此，在研究脊髓损伤后的再生能力时，应尽可能快速高效地完成手术，以避免混杂因素的干扰。保持每只小鼠接受的异氟烷暴露时间一致，可降低实验变异性。整个手术过程中应持续监测小鼠的呼吸频率，避免呼吸过慢（每2–3秒少于1次）或严重费力（i.e.，喘息）。可根据接受较低剂量麻醉的小鼠情况，将麻醉维持剂量从2–3%适当下调，以防止因长时间麻醉导致死亡。
手术过程中，在脊柱两侧进行肌肉切口时需格外小心。确保切口足够深，并将刀片向内侧倾斜，使刀片边缘在肌肉切开时紧贴椎骨表面。若刀片向外倾斜，可能导致血管损伤而引起过度出血。研究人员在进行椎板切除时也应特别注意，避免剪刀过度深入，否则会损伤脊髓，造成不必要的组织损伤和功能缺陷。本实验的适当对照组应为仅进行"椎板切除"的组别（无损伤），以便比较神经干细胞（NSC）的激活是由针道损伤引.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由克伦比尔基金会（运营资助 CMM）资助。WX 获得了卡尔顿·玛格丽特·史密斯学生奖。NL 获得了安大略省研究生奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 阿基米德拉钩 | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff弹簧剪（弯型） | Fine Science Tools | 15370-50 | 订购时定制为钝头尖端 |
| Graefe镊子（直型，1×2齿） | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| 超细Graefe镊子（弯型，带齿） | Fine Science Tools | 11152-10 | 或任何其他适用于缝合的镊子 |
| Hartman止血钳（直型） | Fine Science Tools | 13002-10 | 或任何其他适用于缝合的器械 |
| 手术刀柄 #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | 或任何其他适用型号 |
| 毛发修剪器 | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | 或任何其他适用型号 |
| 立体定位仪 | Stoeling | 51500 | 或任何其他适用型号 |
| 布托啡诺 | 或动物护理机构批准的任何其他适当药物 | ||
| 美洛昔康 | 或动物护理机构批准的任何其他适当药物 | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | 或任何其他适用产品 |
| 异氟烷 | Baxter International Inc | DIN 02225875 | 或任何其他适用于麻醉的药物 |
| 棉签 | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| 棉质纱布 | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G针头 | Becton Dickinson | 305106 | 用于损伤造模 |
| 25G针头 | Becton Dickinson | 305122 | 用于药物注射 |
| 1 mL注射器 | Becton Dickinson | 3090659 | 用于药物注射 |
| 3 mL注射器 | Becton Dickinson | 309657 | 用于液体注射 |
| 4-0缝线 | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | 用于皮肤缝合 |
| 6-0缝线 | uoftmedstore.com | VS889 | 用于肌肉缝合 |
| Polysporin软膏 | amazon.ca | 102051 | |
| 异氟烷挥发器 | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL锥形管 | ThermoFisher | 任何适用型号 | |
| 培养皿 | ThermoFisher | 任何适用型号 | |
| 台盼蓝 | ThermoFisher | 任意 | |
| 血细胞计数板 | ThermoFisher | 任何适用型号 | |
| 离心机 | ThermoFisher | 任何适用型号 | |
| 标准解剖工具 | Fine Science Tools | ||
| 解剖显微镜 | Zeiss | Stemi 2000 | |
| 计数显微镜 | Olympus | CKX41 | |
| 神经基础培养基A | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30%葡萄糖 | Sigma | G6152 | 1 M，9.01 g溶于100 mL dH2O |
| 1 M葡萄糖 | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM，1.30 g溶于100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g溶于100 mL dH2O |
| 脱铁转铁蛋白 | R&D Systems | 3188-AT | |
| 腐胺 | Sigma | P7505 | |
| 胰岛素 | Sigma | I5500 | |
| 硒 | Sigma | S9133 | |
| 孕酮 | Sigma | P6149 | |
| 木瓜蛋白酶解离系统 | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 每瓶木瓜蛋白酶可用于2个样本 |
| 表皮生长因子 | Invitrogen | PMG8041 | 粉末用1 mL激素混合液重悬，分装为20 μL/管，冻存 |
| 成纤维细胞生长因子 | Invitrogen | PHG0226 | 粉末用0.5 mL激素混合液重悬，分装为20 μL/管，冻存 |
| 肝素 | Sigma | H3149 | |
| 白血病抑制因子 | 本实验室制备 | ||
| 台盼蓝 | |||
| 血细胞计数板 | |||
| 24孔板 | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g溶于100 mL dH2O |
| 1 M KCl | Sigma | P5405 | 7.46 g溶于100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g溶于100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g溶于100 mL dH2O |
参考文献
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H.
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