Summary
Qui, noi dimostrare le prestazioni di un modello di lesione minima del midollo spinale in un topo adulto che risparmia la nicchia di canale centrale alloggiamento cellule staminali neurali endogene (NSC). Vi mostriamo come l'analisi di neurosphere può essere usata per quantificare l'attivazione e migrazione delle CSN definitivo e primitiva dopo la lesione.
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) nel midollo spinale adulto dei mammiferi sono una popolazione relativamente mitoticamente quiescente di periventricular celle che può essere studiato in vitro facendo uso dell'analisi di neurosphere. Questo saggio di formazione di colonie è un potente strumento per studiare la risposta di NSC a fattori esogeni in un piatto; Tuttavia, questo utilizzabile anche per studiare l'effetto delle manipolazioni in vivo con la corretta comprensione dei punti di forza e i limiti del dosaggio. Una manipolazione di interesse clinico è l'effetto della ferita sull'attivazione endogena di NSC. I modelli attuali di ferita del midollo spinale rappresentano una sfida di studiare questo come la gravità di modelli comuni di contusione, la compressione e il transection causano la distruzione della nicchia NSC presso il sito della ferita dove risiedono le cellule staminali. Qui, descriviamo un modello minima ferita che provoca danni localizzati sulla superficie dorsolateral superficiale del più basso livello toracico (T7/8) del midollo spinale di topo adulto. Questo modello di lesione Risparmia il canale centrale a livello della lesione e consente di analizzare il NSC che risiedono a livello della lesione a vari tempi dopo la lesione. Qui, ci mostrano come il saggio di neurosphere può essere utilizzato per studiare l'attivazione di due popolazioni distinte, lineally-correlati, di NSC che risiedono nella regione periventricular del midollo spinale - NSC primitiva e definitiva (pNSCs e dNSCs, rispettivamente). Dimostriamo come isolare e cultura questi NSCs dalla regione a livello della ferita e il sito di lesione della materia bianca periventricular. Nostro post-chirurgica del midollo spinale le dissezioni Visualizza numeri aumentati di pNSC e neurosfere dNSC-derivato dalla regione delle corde feriti rispetto ai controlli, parlando loro attivazione tramite lesioni periventricular. Inoltre, a seguito di infortunio, neurosfere dNSC-derivato può essere isolato dal sito di lesione — che dimostra la capacità di NSC per migrare da loro nicchia periventricular a siti della lesione.
Introduction
Il sistema nervoso centrale contiene una sottopopolazione di cellule staminali multipotenti, autorinnovabile che hanno la capacità di dare origine a tutte le diverse cellule neurali maturo tipi1,2,3,4. Queste cellule staminali neurali (NSC) risiedono in nicchie specializzate nel cervello e nel midollo spinale e può essere attivate a seguito di infortunio per proliferare, migrare e differenziarsi in cellule neurali mature. NSC e la loro progenie sono stati indicati a migrare verso il sito di lesione lesione corticale modelli5,6. Nel cervello, NSC sono state indicate per eseguire la migrazione da ventricoli laterali al sito della ferita dove si differenziano in astrociti che contribuiscono alla formazione di cicatrice gliale7. Nel midollo spinale, tuttavia, pochi studi sono stati fatti per chiedere se queste stesse NSC endogena può essere sfruttata per promuovere il recupero dopo la lesione del midollo spinale. Infatti, c'è attualmente un dibattito su se l'attivazione del pool di cellule staminali nel midollo spinale richiede un danno fisico diretto della nicchia periventricular fodera il canale centrale8 o se il danno al midollo spinale cavo di parenchima (lasciando il gambo nicchia delle cellule intatta) è sufficiente attivare endogeno NSCs9.
Un numero di modelli di lesione (sic) del midollo spinale è stato usato per studiare la fisiopatologia delle lesioni acute e croniche. Questi modelli sono stati utilizzati anche per testare potenziali terapie per il trattamento di SCI attraverso il neuroprotection, immunomodulazione e sviluppo delle cellule trapianto/sostituzione strategie10,11,13. Modelli correnti includono lesioni compressione e/o contusione, che causano i deficit funzionali su larga scala, nonché vaste lesioni e cavitazioni nel cavo14,15. Le cicatrici gliali risultante possono estendersi su diversi segmenti spinali insieme alla maggioranza della circonferenza/larghezza del midollo spinale16. Così, mentre questi modelli sono clinicamente rilevanti, permettersi sfide significative per studiare la risposta di NSC endogena dopo la lesione. Ci sono modelli chimici di lesioni che possono essere adattate per causare lievi forme di pregiudizio che può risparmiare il canale centrale17. Tuttavia, questi tipi di lesioni concentrano sul demyelination connesso con SCI e non sono modelli clinicamente rilevanti per il danno fisico e/o meccanico connesso con sci traumatico.
Per risolvere le limitazioni degli attuali modelli di lesione, abbiamo adattato un ago pista SCI modello minimo, originariamente sviluppato nel ratto9, per l'applicazione in un modello di topo adulto. Il nostro modello adattato ferita può creare una lesione coerenza della regione dorsolateral del midollo spinale del mouse e il canale centrale presso i livelli della ferita di ricambio. Il vantaggio di questo modello è che consente lo studio della cinetica di NSC dopo lesioni e della loro potenziale espansione radiale al sito della ferita. L'uso di un modello del mouse consente anche l'utilizzo di topi transgenici che consentono il rilevamento di lignaggio di NSC endogena e la loro progenie dopo la lesione. Le proprietà di NSC possono essere valutate ulteriormente utilizzando una forma modificata del test in vitro neurosphere che è stato introdotto in questo protocollo.
Il dosaggio di neurosphere è un in vitro formanti colonie test che consente l'isolamento delle CSN in presenza di mitogeni. Alle densità clonale placcatura, NSC individuali proliferano per dare origine a colonie sferiche digalleggiante di cellule che sono costituite da una piccola sottopopolazione delle CSN e una stragrande maggioranza di progenitori18,19. Nel nostro protocollo, dimostriamo l'isolamento di due distinti, lineally senile NSCs dalla regione periventricular del midollo spinale — in condizioni basali e dopo il nostro modello SCI minimo. Definitivo neurale staminali nestina espressa in cellule (dNSCs) e la proteina silicea fibrillare glial (GFAP) e sono coltivate in presenza di fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita del fibroblasto (FGF) e l'eparina (insieme definito come EFH)20. Questi dNSCs sono rari nel midollo spinale ingenuo, dando vita a pochissimi neurosfere in vitro. Tuttavia, mostriamo che dNSCs sono attivati dopo SCI minimal, espandendo i numeri di neurosfere isolato dal regione periventricular21. Cellule staminali neurali primitive (pNSCs) sono a Monte del dNSCs del lignaggio delle cellule staminali neurali. pNSCs sono rapidi, eccessivamente rari bassi livelli del marcatore pluripotenza Oct4 e sono la leucemia fattore inibitorio (LiF) reattivo22. pNSCs non fanno neurosfere quando isolato dal midollo spinale di topo adulto a causa della presenza della proteina basica della mielina (MBP) in colture primarie; Tuttavia, pNSC neurosfere possono essere isolate da topi deficienti di MBP e i loro numeri sono estesa lesione seguente — simili a dNSCs21. Infine, mostrare che neurosfere dNSC-derivato può essere isolato dal sito della lesione a presto volte seguito minimo SCI. Questi risultati dimostrano che il nostro modello di lesione e saggi possono valutare le caratteristiche di attivazione di periventricular NSC come la loro capacità di proliferare e migrare in risposta alla lesione.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dal comitato di cura animale presso l'Università di Toronto ed è in conformità con la "Guida per la cura e uso di animali da esperimento" (2nd Edition, Consiglio canadese su Animal Care, 2017).
1. minima del midollo spinale lesioni chirurgia
Nota: Prima dell'intervento, assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti chirurgici sono sterilizzati con metodi appropriati (Figura 1A).
- Costruire un arco di supporto toracico di roll-up 4 – 5 quadrati di garza e taping loro insieme in mezzo per ottenere un fisso rotolo di garza.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione e avviare l'anestesia con isoflurano 5%. Verificare l'assenza di un riflesso di pizzico di punta prima di procedere, così come in tutta la procedura. Come la chirurgia può prendere verso l'alto di 30 min per completare, ottimizzare per l'esposizione minima isoflurano (5 min a 5%) e il tempo rimanente al 2 – 3%.
- Trasferire il mouse ad un cono di naso attaccato alla macchina anestetica a dose di mantenimento di 2 – 3% isoflurane. Utilizzare Tosatrici per rimuovere pelliccia dal dorso dell'animale da metà schiena fino al collo/orecchie per esporre un'area ampia rettangolare di pelle per la chirurgia.
- Trasferire il mouse a uno strumento stereotassica mettendo il naso nel cono di naso associato e stabilizzando il cranio con le barre di orecchio. Una volta che il mouse è garantito nel dispositivo stereotassica, mantenere isoflurano 5% durante il posizionamento delle barre dell'orecchio e inferiore al 2 – 3%.
- Somministrare i farmaci analgesici preoperatori intraperitonealmente — Meloxicam (2,0 mg/kg). Applicare generosamente la lubrificazione dell'occhio sugli occhi aperti del mouse per evitare disidratazione corneale quando si è sotto anestesia.
- Posizionare l'arco di supporto toracico sotto l'addome del mouse mentre raddrizzare il corpo del mouse e la colonna vertebrale tirando leggermente la base della coda. Utilizzare laboratorio etichettatura nastro per fissare la coda e tutti gli arti estesi in una posizione di stella-come. Una volta sicuro, spingere l'arco di supporto toracico rostralmente, dall'addome del mouse verso il torace superiore — al fine di puntellare la spina dorsale toracica (Figura 1B).
- Preparare un campo operatorio sterile di disinfettare la zona di pelle pelliccia-ritagliato preparata al punto 1.3 con etanolo al 70%, seguita da povidone-iodio. Ripetere due volte. Applicare un telo chirurgico sterile per mantenere un campo ampio sterile.
- Utilizzando una lama per bisturi #10, praticare un'incisione verticale parallelo all'asse longitudinale dell'animale dal punto di equidistanza di entrambi scapole alla curvatura della spina dorsale toracica. Ritrarre la pelle per l'esposizione dei tessuti molli e il contorno della colonna vertebrale (Figura 1).
- Identificare il bordo inferiore del rilievo grasso suprascapular (questo delimita il livello vertebrale di T4/5). Con la stessa lama #10, con attenzione, ma con forza, tagliare lungo entrambi i lati dell'osso vertebrale 9 – T8/T5 per staccare i tendini di retro-muscolare dalla colonna.
- Inserire i denti dei riavvolgitori i siti di incisione su entrambi i lati della spina dorsale. Regolare l'esposizione espandendo Divaricatori per elevare sufficientemente la colonna vertebrale senza troppo sforzo per gli strati di muscolo retratto (Figura 1).
- Sotto il microscopio chirurgico, pulire accuratamente il residuo muscolo e altri tessuti molli che ricoprono la colonna vertebrale per esporre l'osso vertebrale (Figura 1E). Identificare le vertebre che verranno rimosso clasping le apofisi delle vertebre con forcipe dentato e spostandolo leggermente in alto e verso il basso.
Nota: Questo dovrebbe consentire l'identificazione delle articolazioni intervertebrali ed esporre le piccole aperture (forami intervertebrali) sotto le vertebre di interesse. - Inserire una testa delle forbici curve smussate in entrambi i lati del forame intervertebrale esposto, caudale alla lamina vertebrale essere asportata e tagliare le giunzioni di collegamento intervertebrale bilateralmente.
- Sollevare la lamina verso l'alto e tagliare l'attacco superiore della lamina per isolare e rimuovere l'osso.
Nota: Questo esporrà il sac dural intatto contenente il midollo spinale (Figura 1F). Ci potrebbe essere eccessivo sanguinamento che può essere controllato posizionando pretagliato garza di 1 x 1 cm sulle zone interessate e/o lavaggio con PBS sterile. - Con la vena dorsale del midline che serve come punto di riferimento, è necessario inserire un albero piegato di 45° di una punta ad ago 30g (con ago smusso rivolto verso l'alto) la superficie dorsolateral del midollo spinale (circa 1 mm di profondità) a circa 0,5 mm laterale su entrambi i lati della linea mediana.
- Spostare l'ago ~ 2 mm da caudale rostrale (parallelo alla linea mediana) in modo che l'intera lunghezza della smussatura dell'ago viene inserito il cavo. Rimuovere l'ago di ripercorrere attraverso il percorso di entrata (Figura 1).
Nota: non ci dovrebbe essere Nessun sanguinamento ma gonfiore del tessuto spinale può essere visto in questo passaggio. - Per chiudere la ferita, è necessario rimuovere il riavvolgitore e suturare i muscoli della schiena su entrambi i lati della ferita insieme nel midline usando una sutura riassorbibile 6-0. Utilizzare una sutura seta sterile 4-0 per chiudere successivamente la pelle sovrastante.
- Applicare pomata antibiotica sulla parte superiore della pelle superficiale suturata per prevenire l'infezione postoperatoria con la punta di un bastoncino di cotone. Somministrare un analgesico post-operatorio di 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea con fluidi (1 mL di soluzione di Ringer lattato).
- Spegnere il vaporizzatore isoflurano e ossigeno. Rimuovere il mouse dal dispositivo stereotassica e posto in una gabbia pulita con alcuna biancheria da letto.
- Posizionare il mouse nella gabbia circa 30 cm di distanza una lampada di calore per il recupero dall'anestesia e monitor un comportamento dopo il risveglio. Il mouse dovrebbe svegliarsi entro 5 – 10 min e hanno la funzione dell'arto posteriore con possibile paresi e/o debolezza di coda al risveglio.
- Monitorare il comportamento del mouse sopra i prossimi giorni e fornire adeguata assistenza post-operatoria e analgesici (cioè, poltiglia, lattato soluzione fluida sottocutanea, 0,1 mg/kg la buprenorfina di Ringer 2 volte al giorno per via sottocutanea per 2 – 3 giorni e il peso adeguato monitoraggio ) in conformità ai regolamenti di struttura animale locale e su base individuale come recupero possono variare.
2. Neurosphere Assay dissezione
Nota: Seguire le procedure di corretta sterili per coltura in tutto.
- Preparazione di una soluzione enzimatica
- Aggiungere 32 mL di Earle bilanciato sale soluzione (EBSS) alla bottiglia in vetro contenente albumina ovomucoide inibitore e delicatamente vortice fino a completa dissoluzione.
- Aggiungere 5 mL di EBSS un flaconcino di vetro pre-porzionate papaina e posto in un bagno di acqua di 37 ° C per sciogliere. La soluzione diventerà chiaro (soluzione 1).
- Prendere 500 µ l di EBSS e aggiungere la dnasi pre-porzionata di vetro I flacone per ottenere una concentrazione di 1 mg/mL (soluzione 2). Mescolare molto delicatamente inclinando il flaconcino di avanti e indietro e aggiungere 250 µ l di questa miscela alla soluzione 1.
Nota: Tutte le soluzioni realizzate (soluzione 1 e 2) sono sufficienti per l'elaborazione di due pezzi di tessuto. Se l'elaborazione di più pezzi di tessuto, accogliere con più preparazione di soluzione.
- Dissezione e preparazione tessuto
- Posto un wipe di laboratorio imbevuto di isoflurane nella gabbia del mouse e lasciare 2-3 min per vapori ad anestetizzare completamente del mouse. Knockout seguente, rimuovere il mouse dalla gabbia e confermare l'assenza di una reflex di punta-pizzico.
- Eseguire dislocazione cervicale con un oggetto metallico (cioè, gabbia metallica card) per eutanasia animale. Spruzzare generosamente l'animale eutanasizzato dal suo collo al centro dietro con etanolo al 70%.
- Alla base del cranio, usare le forbici per tagliare la testa e gettare in un sacchetto di bio. Fare un'incisione del midline nella pelle lungo tutta la lunghezza della parte posteriore per esporre il muscolo e contorno ossea vertebrale (Figura 2A).
- Sollevare il lato mediale della ogni scapola (cioè., scapola — identificato dal sovrastante rilievo grasso) e usare le forbici per tagliare i tessuti molli (tra le scapole e vertebre). Separata completamente per esporre la colonna vertebrale sottostante.
- Seguendo la curvatura della colonna vertebrale, inserire lo stesso paio di forbici il diaframma toracico superiore e isolare la colonna vertebrale di tagliando allegati nervature, muscoli e organi interni (Figura 2B).
- Inserire la caudale forame vertebrale/apertura di forbici e tagliare le articolazioni intervertebrali su entrambi i lati delle lamine (superficie dorsale). Prestare particolare attenzione a non danneggiare il cavo intatto. Continuare questo processo fino al livello desiderato e/o lunghezza del cavo è esposto.
- Tagliare con cura il spinal nerve(s) che si estende lateralmente dal cavo prima di trasferire il tessuto del midollo spinale in una capsula di Petri con liquido cerebrospinale artificiale regolare. Mantenere il campione sul ghiaccio (Figura 2).
- Sotto un microscopio di dissezione, tagliare il tessuto del midollo spinale per includere ~ 2 mm rostrale e caudale al sito di lesione. Utilizzare due paia di pinze per separare delicatamente il cavo in 2 metà longitudinalmente lungo le fessure dorsali e ventrali (Figura 2').
- Con microforbici, tagliare fuori la questione di bianco dorsolateral ferita. Posizionare il pezzo in una provetta conica da 15 mL.
- Tenere in mano una metà del midollo spinale verso il basso con il forcipe, stuzzicare e rimuovere utilizzando un altro paio di una pinzetta lungo nella misura rostrocaudal del midollo spinale per isolare la regione desiderata periventricular della materia bianca. Ripetere per l'altra metà del midollo spinale.
- Inserire pezzi di tessuto periventricular in un provette coniche da 15ml separato. Utilizzare microforbici e tritare delicatamente il tessuto contro le pareti dei tubi conici.
Nota: Le modifiche di dissociazione del tessuto sono da papaina dissociazione sistema protocollo23 e tessuto precedentemente descritto preparazione procedure24. - Aggiungere 2,5 mL della nuova soluzione 1 (punto 2.1.3) per il campione di tessuto e posizionare su un rocker a 37 ° C per 30 min.
- Triturare delicatamente il tessuto nella soluzione con una punta di pipetta 1.000 µ l. Centrifugare la sospensione cellulare nuvoloso a 300 x g per 5 minuti a TA.
- Preparare soluzione 3 con 2,7 mL di soluzione salina di Earle bilanciato, 300 µ l di soluzione di inibitore ovomucoide (punto 2.1.1) e 150 µ l della dnasi ho soluzione (punto 2.1.3).
- Scartare il surnatante da passaggio (passaggio 2.2.13) e risospendere in 1,5 mL di soluzione 3 dal passaggio precedente (passaggio 2.2.14).
- Strato di questa nuova sospensione cellulare (passo 2.2.15) in cima a 5 mL di soluzione di inibitore di ovoimucoid (punto 2.1.1) in un tubo conico di 15 mL nuovo per creare un gradiente di densità discontinua. Centrifugare a 300 x g per 5 min a RT.
- Eliminare il surnatante e risospendere in 2 mL di terreno neurobasal. Centrifugare a 300 x g per 3 min a RT.
- Eliminare il surnatante e risospendere in 1 mL di neurobasal media. Filtrare la sospensione utilizzando un colino di cella di 20 µm seguito da 4 mL di media per un volume totale di 5 mL.
- Placcatura
- Preparare terreni di coltura per la crescita neurosphere completando neurobasal media con fattore di crescita epidermico (20 ng/mL) / fattore di crescita del fibroblasto (20 ng/mL) / eparina (2 µ g/mL) [per NSC definitiva] o leukemina fattore inibitorio (10 ng/mL) [per primitiva NSC]. Aggiungere 10 mL di entrambi media in un matraccio di cultura del tessuto da 25 mL.
- Utilizzare un emocitometro e colorante Trypan blu per calcolare il numero di cellule in sospensione da (passo 2.2.18)25. Una volta calcolato, è possibile aggiungere celle alla coltura del tessuto boccette preparate al (punto 2.3.1) ad una densità clonale di 10 cellule / µ l e luogo matraccio di cultura del tessuto con celle aggiunte in incubatrice per 24 h (37 ° C, umidità 95%, 5% CO2).
Nota: Un esempio della tecnica del conteggio è il seguente: prendete 10 µ l della sospensione cellulare e mix con 10 µ l di colorante blu di Trypan. Aggiungere 10 µ l di questa miscela in un emocitometro. Sotto un microscopio ottico di 10x, contare il numero di cellule vive e sommare tutte le celle conteggiate in 4 dei 4x4 quadranti. Utilizzare la formula: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] per dare il volume della sospensione di cellule piastrate in ciascuna beuta di coltura del tessuto 25 mL per garantire densità clonale (10 cellule / µ l). - Dopo 24 h, delicatamente la boccetta di turbinio e versare il contenuto in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 min a RT.
- Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 – 2 mL di terreno neurobasal fresco.
- Ripetere il punto 2.3.2 per contare il numero di cellule in sospensione e piastra cellule clonali densità in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti contenenti 500 µ l di loro mezzi rispettivi mitogene completate (EFH per definitiva crescita NSC) e LIF per crescita di NSC primitivo.
Nota: Utilizzare la formula adattata (5.000 / [X cellule/4) x 2 x 10 x 1.000) per calcolare il volume della sospensione delle cellule per essere placcato in ciascuna contenente ben 500 µ l di media. - Posizionare le piastre contenenti cellule nell'incubatrice (37 ° C, umidità 95%, 5% CO2) a crescere per 7 giorni.
- Conteggio
- Dopo 7 giorni nella cultura, rimuovere le piastre e mostra sotto un microscopio chiaro. Quantificare neurosfere contando colonie sferiche che sono > 80 µm di diametro per culture dNSCs e > 50 µm di diametro per culture pNSCs.
Nota: Se lo si desidera, neurosfere può essere ulteriormente i26 o differenziato. Se le cellule non sono più necessari, smaltire aggiungendo accelerato perossido di idrogeno ai pozzetti (circa 1 mL) per 20 min, in modo che il colore del mezzo diventa giallo. Poi scartare.
- Dopo 7 giorni nella cultura, rimuovere le piastre e mostra sotto un microscopio chiaro. Quantificare neurosfere contando colonie sferiche che sono > 80 µm di diametro per culture dNSCs e > 50 µm di diametro per culture pNSCs.
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Representative Results
A seguito della chirurgia, i topi dovrebbero sperimentare minimo deficit motori, che possono includere coda e possibile paresi dell'arto posteriore per fino a 24 h. Dopo questo tempo, i topi non dovrebbero verificarsi nessuna paralisi dell'arto posteriore e/o paresi e cambiamenti minimi nell'andatura.
La figura 3 Mostra i risultati rappresentativi del dosaggio di neurosphere 5 giorni che seguono la ferita minima del midollo spinale. I numeri assoluti di neurosfere dNSC-derivato (coltivate in EFH) sono maggiori dei numeri di neurosfere pNSC-derivato (coltivate in LIF) dopo la lesione (Figura 3A e 3B, rispettivamente). Immagini di potenza superiore di un neurosphere definitivo (Figura 3) e un neurosphere primitivo (Figura 3D) rivelano differenze nell'aspetto di queste colonie distinte con definitiva neurosfere essendo più grandi di diametro (≥ 80 µm) e di solito avendo un grande centro scuro. Neurosfere primitivi sono più piccole dimensioni (≥ 50 µm) e le cellule sono più strette. Un numero rappresentativo di neurosfere derivanti da diverse parti del midollo danneggiato si vedono in Figura 3E (ordinari) e 3F (primitive). Figura 3E spettacoli che SCI minimo provoca un significativo aumento in neurosfere cresciuta dal canale centrale a livello della lesione rispetto ad un incremento relativamente modesto il cavo di alimentazione non-ferito rostrale.
È interessante notare che, neurosfere definitivo può essere generato dal sito di lesione, una regione che non contiene cellule formanti neurosphere in topi da sola laminectomia. 3F di figura viene illustrato un simile aumento in pNSCs post-infortunio con l'eccezione di pNSC neurosfere al luogo della lesione. Quindi, solo dNSCs sono in grado di migrare al sito della ferita nel corso di questa tempo corso di alberino-ferita.
Figura 1: procedura chirurgica. (A), il layout di tutto il necessario, numerati per riferimento. (B) una foto del mouse in un dispositivo stereotassica con un corpo raddrizzato, colonna vertebrale e degli arti sparsi e registrato insieme ad arco di supporto toracico posizionato di sotto. (C), A immagine del mouse con un'incisione verticale pelle esponendo lo strato muscolare e il contorno della colonna vertebrale. (D) una foto del corpo del mouse dopo incisioni muscolare e l'esposizione e l'isolamento della spina dorsale con divaricatori. Nota strati di muscolo teso con una mancanza di strappo. (E), A immagine della spina dorsale del mouse isolato con strati muscolari rimosso, mostrando la superficie ossea della vertebra (3 segmenti). Questo dimostra anche il processo spinous e possibilmente l'articolazione intervertebrale e la lamina della vertebra centrale per essere rimosso. (F) una foto della post-laminectomia visibile del midollo spinale. Con l'etichetta è la vena dorsale del midline. (G), A immagine del mouse con le lesioni bilaterali dell'ago pista su entrambi i lati della vena dorsale del midline. C'è un inserto di primo piano dell'albero curvo 45° di ago 30g. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: la dissezione del midollo spinale. (A), A immagine del mouse decapitato con l'incisione cutanea del midline per esporre il muscolo posteriore e l'immagine (B), un contorno ossea vertebrale della colonna vertebrale isolata, mostrando orientamento rostrale e caudale. La seconda immagine mostra l'isolamento del cavo e la terza mostra del midollo isolato in una capsula di Petri. (C), A rappresentazione grafica della dissezione bene del midollo spinale, dove diversi segmenti (periventricolare, zona ferita) vengono rimossi e separati per la coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rappresentante deriva dall'analisi neurosphere che segue ferita minima del midollo spinale. (A) i numeri di neurosfere dNSC-derivato (coltivate in EFH) coltivato dal midollo spinale danneggiato sono maggiori di (B) il numero di neurosfere pNSC-derivato (coltivato in LIF) quando placcato densità uguale. (C, D) Immagini di potenza superiore di neurosfere "tipici" culture dNSC (C) e (D) pNSC culture. (E) ago minimo tratto ferita provoca un aumento significativo del numero di neurosfere dNSC-derivato dal canale centrale a livello della ferita così come il canale centrale rostral al pregiudizio e dal sito di lesione. Neurosfere pNSC-derivato (F) non può essere isolato dal cavo di illeso ma può essere isolato a seguito di lesioni dal canale centrale (a livello della ferita e dal canale centrale rostrale). Barre di errore rappresentano errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Durante la procedura chirurgica, ci sono pochi passaggi critici dove il ricercatore dovrebbe prestare particolare attenzione al fine di ottenere i risultati ottimali e ridurre al minimo la variabilità tra gli animali. Cura deve essere presa con l'anestesia per inalazione (isoflurano) durante la chirurgia come l'anestetico ha dimostrato di avere effetti neuroprotective con esposizione prolungata27. Di conseguenza, quando si studia la capacità rigenerativa del midollo spinale dopo la ferita, fare uno sforzo per eseguire l'intervento in modo più rapido ed efficiente possibile per evitare che le variabili di confusione. Mantenere il tempo di esposizione di isoflurane stesso per topo ridurrà la variabilità. Il tasso di respirazione del mouse dovrebbe essere monitorato per tutta la chirurgia e non dovrebbe essere troppo lento (meno di 1 respiro ogni 2 – 3 s) o pesantemente affannoso (cioè, senza fiato). La dose di mantenimento dell'anestesia può essere abbassata da 2 – 3% per impedire la morte a causa di anestesia prolungata con la nota di topi che hanno ricevuto il dosaggio più basso.
Durante l'intervento chirurgico, è necessario prestare particolare attenzione quando si eseguono incisioni muscolare su entrambi i lati della colonna vertebrale. Assicurarsi che i tagli sono profondi, e la lama è angolata medialmente in modo che il bordo della lama sia appoggiata contro le vertebre ossee durante l'incisione muscolare. Se la lama è inclinata verso l'esterno, c'è la possibilità di sanguinamento eccessivo da tagli vascolare. Il ricercatore deve anche prestare particolare attenzione quando si esegue la laminectomia per evitare la pesca profonda delle forbici che possono danneggiare il midollo spinale, causando danni ai tessuti indesiderati e i deficit funzionali. Il controllo appropriato per questi esperimenti è un gruppo di "laminectomia solo" (nessuna ferita), che consentirà un confronto dell'attivazione di NSC attribuito per la ferita di pista dell'ago invece di quella che può derivare da laminectomia solo. Abbiamo dimostrato che laminectomy da solo può risultare in un aumento piccolo, anche se insignificante nell'attivazione di NSC come rivelato da un aumento nei numeri neurosphere dalla regione periventricolare a livello della lesione21. Laminectomy da solo non causa aumenti nei numeri neurosphere dalla regione periventricular rostrale o caudale a laminectomia e nessun neurosfere si trovano nelle culture della materia bianca isolato a livello della laminectomia. Inoltre, quando si esegue la laminectomia, fare attenzione a rimuovere la lamina dorsale in un unico pezzo per consentire ampia esposizione del midollo. Questo (1) consentirà l'accesso sufficiente per eseguire il pregiudizio di traccia minima dell'ago del midollo spinale dorsolateral e (2) impedire segmenti dell'osso di essere lasciati indietro e causando danni secondari seguendo il movimento di chiusura e post-ripristino del mouse. Se la lamina intera non è considerata come un unico pezzo, o segmenti di ossee sporgenti ai lati della laminectomia sono osservati, è possibile utilizzare strumenti (quali forcipe dentato e forbici curve) per rimuovere questi frammenti prima della sutura.
Il ricercatore dovrebbe essere estremamente attento quando si applicano punti di sutura a strato muscolare durante la chiusura chirurgica. Una sutura (doppio annodato) deve essere collocata caudale al livello della laminectomia/ferita così che la sutura è ubicato sopra l'osso vertebrale intatto. Questo serve a prevenire eventuali danni secondari che possono derivare dalla sutura muscolare essendo a contatto con il cavo esposto quando il mouse viene spostato dopo il recupero. Inoltre, la sutura muscolare caudale alla laminectomia/ferita agisce come un punto di riferimento per cui SIC è stato eseguito quando il midollo spinale per l'analisi di isolamento. Prestare particolare attenzione dovrebbe essere di dissezione fuori della zona di midollo spinale danneggiato per evitare di compromettere la struttura della regione ferita affinché possa rimanere riconoscibile durante la dissezione bene sotto il microscopio per dissezione. Per quanto riguarda il dosaggio di neurosphere, è importante eseguire la triturazione meccanica delle palline delle cellule delicatamente per evitare la produzione di bolle d'aria che può aumentare la morte delle cellule. neurosfere pNSC-derivati sono ancora più sensibili alle condizioni di crescita pesante, detriti — triturazione eccessiva e prolungata esposizione a soluzioni enzimatiche — relativo dNSC culture. pNSC derivato sfere sono più compatti e più piccolo di dNSCs. Data la rarità della pNSCs, si consiglia di isolare almeno 240.000 cellule per campione.
Il modello SCI minimo è ideale per studiare gli eventi cellulari che segue ferita (quali l'attivazione di NSC endogena) ma non permette lo studio di problemi di funzionamento. Come notato in precedenza, topi che recupero dall'infortunio alla pista dell'ago non esperienza nessun notevole deficit comportamento che persistono e come tale, i topi non possono essere valutati per l'efficacia degli interventi terapeutici volti a migliorare i risultati funzionali. Un aspetto importante della medicina rigenerativa è che un trattamento non dovrebbe solo promuovere la riparazione tissutale (che può essere valutato utilizzando questo modello, in combinazione con il dosaggio neurosphere, traccia di lignaggio e immunohistochemistry/immunofluorescenza) ma dovrebbe anche dimostrare il miglioramento funzionale pertinente utilizzando paradigmi comportamentali, se applicabile. Un numero di attività comportamentali utilizzate per testare i risultati funzionali in toraciche modelli di danno quali la prova del difetto di piede e il Basso, Beattie, Breshnan (BBB) aperto campo locomotore scala28, non è abbastanza sensibile per rilevare i deficit misurabili in nostro minimo Modello SCI. Per ovviare a questo inconveniente, si può fare uso di più sensibili sistemi di Punteggio digitali (ad es., passerella) che misura più parametri dei parametri lordo e fine locomozione dell'arto incluse le analisi di andatura, che potrebbero rilevare la minima deficit dovuti a lesioni minime modello29.
Questo metodo potrebbe anche essere adattato per studiare l'attivazione endogena di NSC come terapia potenziale in modelli di ferita del midollo spinale cervicale. SCI cervicale è il modello più clinicamente rilevante e proponiamo che adattare questo modello di lesioni ai segmenti vertebrali superiori sarebbe fornire approfondimenti se ci sono variazioni regionali nella risposta di NSC e la loro progenie (cinetica, migrazione, differenziazione) e se la lesione si tradurrebbe in deficit funzionali più profondo e misurabili. I modelli di lesione cervicale murino attualmente in uso (ad esempio il transection, clip compressione e/o contusione) richiedono intensiva post-operatoria compresa la necessità di esprimere manualmente vesciche e monitorare costantemente la respirazione del mouse. Adattando il modello minima lesione al midollo spinale cervicale può ridurre la mortalità, morbilità e cure post-operatorie connesso con altri modelli SCI cervicale così come permettono di esaminare l'efficacia di molecole di farmaci/piccoli e/o riabilitazione risultati sul recupero neurale. Il nostro modello di lesione può anche essere adattato per creare una ferita minima in diverse parti del cavo (cioè, colonne dorsale o laterale) e/o più grandi lesioni con penetrazione più profonda e/o l'uso di aghi di dimensioni più grandi (più piccolo calibro). Questo consente al ricercatore di controllo/modificare il tipo e la dimensione della lesione e perciò valutare di conseguenza recupero funzionale/comportamentale e cellulare.
Il modello di lesione minima nei topi consente l'utilizzo di modelli animali transgenici. I modelli del mouse attivare etichettatura di cellule staminali endogene e/o progenitori prima l'infortunio. Questo può consentire al ricercatore di traccia il destino di queste cellule pre-etichettate che segue ferita e valutare la proliferazione delle cellule precursori neurali, migrazione e differenziazione che segue ferita — potenzialmente contribuire alla riparazione neurale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione Krembil (sovvenzione di funzionamento CMM). WX è stato il destinatario del premio studente Carlton Marguerite Smith. NL ha ricevuto una borsa di studio laureato di Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
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