Summary
ここでは、我々 は、スペアの中央運河ニッチ住宅内因性神経幹細胞 (NSCs) 大人のマウスの最小限の脊髄損傷モデルの性能を発揮します。Neurosphere アッセイを使用してアクティブ化および傷害に続く決定的な原始的な NSCs の移行を定量化する方法を紹介します。
Abstract
大人の哺乳類の脊髄における神経幹細胞 (NSCs) は、勉強できる体外neurosphere アッセイを用いた脳室周囲細胞の有糸分裂比較的静止人口です。このコロニー形成アッセイは NSCs の料理で外因性の要因に対する反応を研究するための強力なツールしかし、これも使える強みの適切な理解と分析の限界と生体内での操作の影響を検討します。臨床的関心の 1 つの操作は、活性化 NSC 内因性傷害の効果です。脊髄損傷の現在のモデルは、挫傷、圧縮、および断裂の一般的なモデルの重大度は、幹細胞が存在する傷害のサイトで NSC ニッチの破壊を引き起こすこの研究への挑戦を提供します。ここでは、成体マウスの脊髄 (T7/8) の下位胸椎レベルの表面的な背側表面でローカライズされた損傷を引き起こす最小損傷モデルをについて説明します。この損傷モデルは傷害のレベルで中心部の運河をスペアし、傷害に続く様々 な時点で病変のレベルで存在する NSCs の解析が可能します。ここで、NSCs プリミティブと決定的な NSCs 脊髄脳室周囲地域内に存在する 2 つの異なる、後月関連集団の活性化を研究する neurosphere アッセイを利用できる方法を紹介 (pNSCs と dNSCs、それぞれ)。我々 は分離し、傷害および白質傷害のサイトのレベルで脳室周囲領域からこれらの NSCs を文化をデモンストレーションします。私たち手術後脊髄の解剖は、pNSC とコントロール、けがを介して、活性化に話すと比較して負傷したコードの脳室周囲の地域から dNSC 由来神経幹細胞の数の増加を示します。さらに、外傷後に、dNSC 由来の神経幹細胞分離できます傷害のサイトから-彼らの脳室周囲のニッチから傷害のサイトに移行する NSCs の能力を示します。
Introduction
中枢神経系には、すべて異なる成熟した神経細胞の種類1,2,3,4に上昇を与える能力を持っている自己更新多能性幹細胞の集団が含まれています。これらの神経の幹細胞 (NSCs) は、脳や脊髄の専門にされたニッチに存在し、増殖、移行、および成熟神経細胞に分化する損傷アクティブすることができます。NSCs と彼らの子孫は、大脳皮質損傷モデル5,6傷害のサイトに移行する示されています。脳の側脳室から、グリア瘢痕形成7に貢献しているアストロ サイトに分化し、損傷部位に移行する NSCs を示されています。脊髄、ただし、いくつかの研究の脊髄損傷回復を促進するためこれらの同じ内因性 NSCs に利用できるかどうかを求めるに行われています。確かに、現在、脊髄における幹細胞のプールの活性化が中心管8を並べる脳室周囲ニッチの直接の物理的損傷を必要かどうかまたは脊髄へのダメージ コード (茎を残して実質のかどうかに議論は細胞ニッチそのまま) で内因性 NSCs9を有効にするに十分です。
脊髄損傷 (SCI) モデルの数は、急性および慢性の傷害の病態生理を研究に使用されています。これらのモデルは、神経保護、抗炎症、および開発細胞移植/交換戦略10、11,13SCI を治療するために潜在的な療法をテストする使用されています。現在のモデルには、コード14,15で大規模な機能障害と同様に広範な病変とキャビテーションが発生する圧縮および/または挫傷の傷害が含まれます。結果グリア瘢痕脊髄16の幅/円周の大半と共にいくつかの脊髄セグメントをまたがることができます。したがって、これらのモデルは臨床的に関連性の高い、彼らは損傷内因性 NSCs の応答を勉強する重要な課題を与えます。中央運河17を割くことができる傷害の穏やかな形態をさせるために適応することができます損傷の化学モデルがあります。しかし、これらのタイプの損傷の SCI に関連付けられている脱髄に焦点を当てるし、外傷性理に関連付けられている物理的および/または機械的損傷の臨床的に関連するモデルではないです。
現在の損傷モデルの制限に対処するため、我々 は針トラック最小限 SCI モデル、もともと、ラット9、成体マウス モデルのアプリケーションのために開発を適応しています。適応傷害モデルはマウスの脊髄の背外側領域の一貫した病変を作成でき、予備の損傷のレベルで中心街にある運河。このモデルの利点は、NSC の速度論の研究を許可する損傷部位への損傷とその潜在的な放射状の移住、次します。マウス モデルの使用は、内因性 NSCs と傷害に続く彼らの子孫の系譜追跡を許可するトランスジェニック マウスの使用もできます。NSCs のプロパティは、このプロトコルで導入された体外neurosphere アッセイの変更フォームを使用してさらに評価できます。
Neurosphere アッセイは、生体外でコロニー形成試金マイトジェン存在 NSCs の隔離を可能にします。クローン メッキ密度個々 NSCs は NSCs の小さな個体の前駆細胞18,19の大半で構成される細胞の浮遊球コロニーを生じさせるのに増殖します。我々 のプロトコルで脊髄の脳室周囲の地域から 2 つの異なる、後月関連 NSCs の分離を示す — 基準条件と私たちの最小限の SCI のモデル。決定的な神経幹細胞 (dNSCs) 特急ネスチンとグリア線維性酸性蛋白 (GFAP) と上皮成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 (FGF) やヘパリン (EFH と呼ばれる一緒に)20存在下で栽培されています。これらの dNSCs は生体外で非常に少ない神経幹細胞に上昇を与える素朴な脊髄にまれです。ただし、次の脳室周囲地域21由来神経幹細胞の数を拡大して、最小限の SCI dNSCs をアクティブ化を示します。原始的な神経幹細胞 (pNSCs) は、神経幹細胞系列の dNSCs の上流。pNSCs 多能性マーカー Oct4、という極めてまれな、特急の低水準で、白血病の抑制的な要因 (LiF) 応答22。pNSCs は、成体マウス脊髄初代培養; ミエリン塩基性タンパク質 (MBP) の存在のためにから分離したときの神経幹細胞を形成しません。pNSC 神経幹細胞は、MBP 欠損マウスから分離することができ、その数は拡大続く傷害-dNSCs21に似ています。最後に、我々 は dNSC 由来の神経幹細胞を早く次の最小限の大回で損傷部位から分離することができます表示これらの結果は示して私たち損傷モデルと試金が増殖して損傷に応答を移行する能力などの脳室周囲 NSCs の活性化特性を評価できます。
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Protocol
「ガイド ケアと使用の実験動物」に従い、トロント大学で動物ケア委員会によって承認されたこのプロトコル (2ndエディション動物の世話、カナダ評議会 2017).
1. 最小限の脊髄傷害手術
注: 手術前にすべての手術器具と材料が (図 1 a) 適切な方法で滅菌されていることを確認してください。
- 4-5 正方形のガーゼを重ね、ガーゼの固定ロールを取得する途中でそれらを一緒にテーピングして呼吸器サポート アーチを構築します。
- 誘導チャンバーにマウスを置きし、5% イソフルレンで麻酔を開始します。プロシージャ全体だけでなく、前に、つま先ピンチ反射の有無を確認します。手術は、完了に 30 分以上かかることが、として最小限のイソフルラン暴露 (5% で 5 分) や 2-3% で残り時間を最適化します。
- 2-3% イソフルラン維持投与量で麻酔器に接続されている鼻の円錐形にマウスを転送します。バリカンを使用して、手術のため皮膚の広い長方形領域を公開する首/耳まで半ば後ろから動物の背から毛皮を削除します。
- 脳定位固定装置に添付のノーズコーンにその鼻を置き、イヤバーと頭蓋骨を安定させるマウスを転送します。マウスの脳定位固定装置で保護されて一度耳バーと 2-3% に戻って下の配置中にイソフルラン 5% を維持します。
- 術前鎮痛薬を腹腔内管理 — メロキシカム (2.0 mg/kg)。気前よく潤滑目麻酔と角膜の乾燥を防ぐためにオープン マウスの目に。
- 尾のベースを軽く引いてマウス体内と背骨を矯正しながらマウスの腹部の下に胸部サポート アーチを配置します。尾および星のような位置にすべての拡張の手足を保護するのにテープにラベル付け室を使用します。セキュリティで保護された、一度押して上部胸郭に向かってマウスの腹部からの呼吸器サポート アーチ吻方、-胸椎 (図 1 b) を支えるために。
- 70% エタノール、ポビドン ヨードに続いて手順 1.3 の準備毛皮クリップ皮膚領域を消毒して滅菌手術野を準備します。2 回繰り返します。広い滅菌フィールドを維持する滅菌手術用ドレープを適用します。
- #10 メス刃を使用して、縦切開は、胸椎の曲率を両方の肩甲骨の中間点から動物の長手方向の軸線に平行ください。軟部組織と脊柱輪郭線 (図 1) を公開するために皮膚を撤回します。
- (これは T4/5 椎体レベルを設定) 甲の脂肪パッドの下の境界を識別します。同じ #10 刃で慎重に、力、列から裏筋腱をデタッチする椎体骨 T5-T8/9 の両側に沿ってカットします。
- 背骨の両側に切開サイトにリトラクターの歯を挿入します。露出を調整するには、十分に収縮の筋層 (図 1) にあまり負担をかけることがなく背骨を昇格するリトラクターを拡大します。
- 手術顕微鏡下で注意深く洗浄残留筋肉や他の軟部組織 (図 1E) の椎体の骨を公開する脊椎を覆います。脊椎が上下の歯の鉗子で椎骨の棘突起を握りしめると、わずかに移動することによって削除されますを識別します。
注: これは椎間関節を識別できるようにする必要があります、興味の脊椎骨の下に小さな開口部 (椎間孔) を公開します。 - 露出椎間孔を摘出する椎弓板に尾の両側に鈍化デカールバサミの 1 つのヘッドを挿入して、二国間接続椎間関節を切りなさい。
- 板を上方に持ち上げるし、分離し、骨を取り除くラミナの上部アタッチメントを断ちます。
注: これは、脊髄 (図 1 f) を含む無傷の硬膜嚢が公開されます。過剰な可能性があります影響を受ける領域の上に 1 cm × 1 cm のガーゼをプレカットや滅菌 PBS で洗浄出血を配置することによって制御できます。 - ランドマークとして背側正中静脈、正中線の両側に約 0.5 mm 外側で脊髄 (約 1 mm 深い) の背側表面に (針ベベルが上向き) で 30 G の針の先端の 45 ° 曲がったシャフトを挿入します。
- 針 〜 2 mm の尾側から吻側 (正中線に平行) に移動、針の傾斜面の全体の長さがコードに挿入されます。エントリ (図 1) のパスを介してが針を抜きます。
注: 必要があります出血、脊髄組織の腫脹は、この段階で見られるかもしれない。 - 傷を閉じるため、リトラクターを削除し、6-0 吸収性縫合糸を用いた正中線で一緒に傷害のいずれかの側に背中の筋肉を縫合します。その後穿刺部位の皮膚を閉じます 4-0 滅菌絹縫合糸を使用します。
- 綿棒の先端を用いた術後感染症を防ぐために表面的な縫合皮膚の上部に抗生物質軟膏を適用されます。0.1 mg/kg 皮下流体 (リンゲル液の 1 mL) と共にブプレノルフィンの術後鎮痛を管理します。
- イソフルラン気化器と酸素をオフにします。脳定位固定装置とない寝具で清潔なケージの場所から、マウスを削除します。
- 次の覚醒麻酔とモニターの動作から回復のための熱ランプから約 30 cm のケージにマウスを配置します。マウスは 5-10 分でウェイク アップさせる、可能な麻痺や覚醒時に尻尾の弱点と後肢の機能を持つ必要があります。
- 次の数日間マウスの動作を監視し、適切な術後ケアと鎮痛剤 (リンゲル液ソリューション液皮下、0.1 mg/kg ブプレノルフィン 2すなわちマッシュ、一日 2-3 日間で、適切な重量の監視のために皮下に毎日 x) 回復としてに従ってローカル動物施設規制し、個別に異なる場合があります。
2. Neurosphere アッセイ郭清
注: 全体で適切な無菌培養手順に従います。
- 酵素液調製法
- アルブミン オボムコイド阻害剤含有ガラス瓶と優しく渦溶解するまでに 32 mL のアールのバランスの取れた塩ソリューション (EBSS) を追加します。
- プリポーション パパインのバイアルに EBSS 5 mL を追加し、溶解する 37 ° C の水浴中に置きます。ソリューションになる (ソリューション 1) をオフにします。
- EBSS の 500 μ L を取るし、濃度が 1 mg/mL (ソリューション 2) のバイアル ガラス プリポーション DNase を追加します。前後のバイアルを傾けることによってとてもやさしく混ぜるし、ソリューション 1 にこの混合物を 250 μ L を追加します。
注: 作られたすべてのソリューション (ソリューション 1 と 2) は、組織の 2 つの部分の処理のために十分です。組織のより多くの部分を処理している場合は、詳細のソリューションの準備と対応します。
- ティッシュの準備と郭清
- 場所研究室ワイプはマウス ケージにイソフルランに浸し、完全にマウスを麻酔する蒸気の 2 〜 3 分を許可します。次のノックアウト マウスをケージから取り外し、つま先ピンチ反射の有無を確認します。
- (すなわち、金属ケージのカード) に動物を安楽死させる金属鈍器で頚部転位を実行します。スプレー 70% エタノールをたっぷりと半ばにその首から euthanized 動物。
- 頭蓋底で頭を切断し、破棄バイオの袋にはさみを使用します。正中切開は、皮膚筋や椎体骨の輪郭線 (図 2 a) を公開する背中の全体の長さに沿って。
- 各肩甲骨の内側面を持ち上げる (すなわち。、肩甲骨-脂肪質のパッドを覆うによって識別される) (肩甲骨・椎体間の軟部組織をカットするはさみを使用。基になる脊柱を公開する完全に独立した.
- 以下の脊柱の湾曲、上胸部開口部にはさみのペアを挿入し、リブ、筋肉、臓器 (図 2 b) を切り取ることで、脊柱を分離します。
- 尾椎孔・開口部にはさみを挿入し、ラミナ (背側表面) の両側に椎間関節をカットします。そのままケーブルを損傷しないように注意します。続きを所望のレベルおよび/またはコードの長さまで、このプロセスが公開されます。
- 通常人工髄液をシャーレに脊髄組織を転送する前にコードから横方向に伸びる spinal nerve(s) を慎重にカットします。(図 2) の氷のサンプルを保ちます。
- 解剖顕微鏡の下で ~ 2 mm 吻側と尾側に損傷部位を含むように脊髄組織を切断します。そっと背側と腹側の亀裂に沿って縦 2 等分にコードを分離する鉗子の 2 つのペアを使用して (図 2')。
- 刀、負傷した背白質をカットします。15 mL の円錐管に作品を配置します。
- 1 つを保持鉗子、ダウン脊髄の半分はいじめるし、白質の脊髄の rostrocaudal 範囲に沿って必要な脳室周囲領域を分離する微細鉗子の別のペアを使用してを削除します。脊髄の他の半分に繰り返します。
- 別の 15 mL の円錐管に脳室周囲組織の作品を配置します。刀を使用し、軽く円錐管の壁にティッシュをミンチします。
注: 組織解離変更、パパイン解離システム プロトコル23前述の組織準備手順24です。 - 組織サンプルに新ソリューション 1 (ステップ 2.1.3) の 2.5 mL を追加し、30 分の 37 ° C でロッカーに配置。
- そっとカップ刻んだ 1,000 μ L ピペット チップ ソリューションで組織。300 x g 5 分間室温で曇り細胞懸濁液を遠心分離します。
- アールの平衡塩類溶液, オボムコイド阻害剤ソリューション (ステップ 2.1.1) の 300 μ L 2.7 ml ソリューション 3 を準備と DNase の 150 μ L 私ソリューション (ステップ 2.1.3)。
- ステップ (ステップ 2.2.13) から上澄みを廃棄し、前の手順 (手順 2.2.14) からソリューション 3 の 1.5 mL で再懸濁します。
- レイヤーの ovoimucoid 阻害剤溶液 (ステップ 2.1.1) 不連続密度勾配を作成する新しい 15 mL の円錐管に 5 mL の上にこの新しいセル中断 (ステップ 2.2.15)。300 × gで遠心するルートで 5 分間
- 上澄みを廃棄し、neurobasal メディアの 2 mL で再懸濁します。300 × gで遠心する室温 3 分
- 上澄みを廃棄し、neurobasal メディアの 1 つの mL で再懸濁します。5 mL の容量のためのメディアの 4 mL に続いて 20 μ m の細胞ストレーナーを使用して懸濁液をフィルター処理します。
- めっき
- 表皮の成長因子 (20 ng/mL) と neurobasal メディアを補完 neurosphere 成長培地を準備/線維芽細胞増殖因子 (20 ng/mL)/ヘパリン (2 μ g/mL) [の決定的な NSCs] または [プリミティブ NSCs] の leukemina 抑制的な要因 (10 ng/mL)。25 mL の培養フラスコにいずれかのメディアの 10 mL を追加します。
- 検定とトリパン ブルー色素を使用して25(ステップ 2.2.18) から懸濁液中の細胞数を計算します。計算された、(ステップ 2.3.1) で作製した培養フラスコにセルを追加 24 h (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) のためのインキュベーターに追加されたセル 10 細胞/μ L と場所組織培養フラスコの栄養密度。
注: カウント手法の例のとおりです: 10 μ L トリパン ブルー色素の細胞懸濁液とミックスの取る 10 μ L。診断にこの混合物の 10 μ L を追加します。光学顕微鏡 X 10、[生きているセルの数をカウントし、内 4 x 4 象限の 4 カウントのすべてのセルを合計します。数式を使用して: 2 x 10 x 1,000 x 100,000/[(X cells/4)] クローン密度 (10 細胞/μ L) を確保するため各 25 mL の培養フラスコにめっきされる細胞を懸濁液の量を与える。 - 24 h 後優しくフラスコを旋回し、15 mL の円錐管に内容を注ぐ。300 × gで遠心するルートで 5 分間
- 上澄みを廃棄し、新鮮な neurobasal メディアの 1-2 mL のセルを再度中断します。
- 2.3.2 補われるそれぞれのマイトジェン メディア (決定的な NSC 成長 EFH) と原始的な NSC 成長の LIF の 500 μ を含む 24 ウェル培養プレートのクローンの密度で懸濁液とプレートのセルのセルの数をカウントする手順を繰り返します。
注: 2 x 10 x 1,000 x 適応式 (5,000/[セル/4 X) を使用して) よく 500 μ L のメディアを含む各メッキに細胞懸濁液の体積を計算します。 - 7 日間 (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) 成長するインキュベーター内のセルを含んでいる版を配置します。
- カウント
- 次の 7 日間培養プレートを削除し、光学顕微鏡で見る。球状のコロニーをカウントすることによって神経幹細胞を定量化する > dNSCs 文化の直径約 80 μ m と > 50 μ m 径 pNSCs 文化。
注: 必要な場合、神経幹細胞は継代26さらにすることができます。 または差別化します。セルが必要なくなった場合は、培地の色が黄色に変わり、20 分間 (約 1 mL) の井戸に加速の過酸化水素を追加することによって処分します。破棄します。
- 次の 7 日間培養プレートを削除し、光学顕微鏡で見る。球状のコロニーをカウントすることによって神経幹細胞を定量化する > dNSCs 文化の直径約 80 μ m と > 50 μ m 径 pNSCs 文化。
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Representative Results
術後では、マウス尾と 24 h までの可能な限りの後肢麻痺を含む最小限の運動障害を体験してください。この後、マウスを体験する後肢麻痺麻痺や歩行の変化は最小限。
図 3は、最小限の脊髄損傷後 5 日 neurosphere アッセイから代表的な結果を示しています。(EFH 産) dNSC 由来神経幹細胞の絶対数が傷害の後 (LIF 産) pNSC 由来神経幹細胞の数より大きい (図 3 a 3 b、それぞれ)。決定的な neurosphere (図 3) とプリミティブ neurosphere (図 3 D) の高い電源画像直径 (≥80 μ m)、通常より大きいされている決定的な神経幹細胞とこれらの異なるコロニーの外観の違いを明らかにします。大規模な暗い中心を有する。原始的な細胞が小さいサイズ (: 50 μ m)、細胞はより密集します。負傷したコードのさまざまな部分から生じる細胞の代表番号は、図 3E (国宝)、 3階(プリミティブ) で見られます。最小限の SCI は、神経幹細胞傷害のレベルで中心管から成長が大幅に増加図 3Eのショーに比べて吻側非負傷したコードで比較的緩やかな増加。
興味深いことに、決定的な神経幹細胞は、椎弓切除術単独でマウスの neurosphere 形成細胞が含まれていない領域病変のサイトから生成できます。図 3 fは、病変のサイトで pNSC を神経幹細胞を除いて pNSCs ポスト傷害の同じような増加を示しています。したがって、のみ dNSCs、この時間コースのポスト傷害傷害のサイトに移行することができます。
図 1: 外科プロシージャ。(A) すべてのレイアウトは、参照番号が必要があります。伸ばした体、脊椎と四肢の固定デバイスのマウスの (B) の画像と広がって胸部サポート アーチの下に置かれたと共に録音。筋層と脊柱輪郭を公開する縦皮膚切開でマウスの (C) の画像。筋肉の切開と露出とリトラクターで脊椎の分離後マウス体内の (D) の画像。涙の欠如とピンと張った筋層に注意してください。マウス単離脊椎椎体 (3 セグメント) の骨の表面を示す削除、筋層を (E) の写真です。これは椎間関節と削除する椎骨の中間の板ではおそらく、棘突起も示しています。目に見える脊髄後椎弓切除術の (F) の画像。ラベルは、背側正中静脈です。背側正中静脈のどちら側の両側の針トラック損傷マウスの (G) の画像。30 G 針の 45 ° 曲がったシャフトのクローズ アップの挿入があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 脊髄の解剖します。背中の筋肉と吻側と尾側方向を示す孤立した脊柱の椎体骨輪郭 (B) の写真を公開する正中皮膚切開と首のないマウスの (A) の画像。2 番目の図は、コードの分離と 3 シャーレで脊髄分離を示しています。(C) A 脊髄、異なるセグメント (脳室周囲、損傷領域) を削除され、養殖のために分離の細かい解剖のグラフィカル表現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: neurosphere アッセイ最小限の脊髄損傷に起因する代表です。(A) dNSC 由来神経幹細胞 (EFH 産)、脊髄損傷から培養の番号が等しい密度でめっきするとき (B) pNSC 由来神経幹細胞 (で栽培 LIF) の数より大きい。(C、 D)(D) pNSC (C) dNSC 文化文化の「典型的な」神経幹細胞の高電力のイメージ。(E) 最低限針管傷害傷害に吻側中央運河と同様、傷害のレベルで中心管傷害のサイトから dNSC 由来の神経幹細胞数の有意な増加で起因します。(F) pNSC 由来の神経幹細胞は無傷のコードから分離することはできませんが、次の傷害 (傷害の吻側中央運河からレベル) の中央運河から分離することができます。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
手術中に、研究者が最適な結果を取得し、動物間のばらつきを最小限に抑えるのために特に注意を払う必要がありますいくつかの重要なステップがあります。注意が必要 (イソフルラン) 吸入麻酔と手術中に麻酔が長時間27神経保護効果が示されていると。したがって、損傷脊髄の再生能力を学習の際の努力として迅速かつ効率的に交絡変数を防ぐために可能な限り手術を行うこと。マウスあたり同じイソフルラン暴露時間を維持すると、変動が少なくなります。マウスの呼吸率は手術中で監視し、遅くはならない (より小さい 1 息すべて 2-3 s) または重く苦しい (すなわち、あえぎ)。麻酔の維持の線量は低い投与を受けたマウスのノートと長時間の麻酔による死亡を防ぐために 2-3% から下げることができます。
脊柱の両側に筋肉の切開の際、手術中に余分な注意してください。カットが深く、刃のエッジは、筋肉切開中骨の椎体に対して平らになるように刃は内側に曲がることを確認します。刃が外側に傾いて、血管から余分な出血の可能性があります。研究者は、深い釣りはさみ、脊髄を損傷を避けるために椎弓切除術を実行するとき余分な注意も払うべき不要な組織の損傷や機能障害を引き起こしています。これらの実験に適したコントロールは NSCs 椎弓切除術のみに起因するのではなく針トラック損傷に起因する活性化の比較を可能にする「椎のみ」グループ (傷害)、です。我々 結果によるその椎こと NSC 活性化とはいえ些細な小さな増加 neurosphere 数字21病変のレベルで脳室周囲の地域からの増加によって明らかにされました。椎弓切除術だけを発生させない増加 neurosphere 数字で吻側あるいは尾側脳室周囲の地域から、椎弓切除術と、椎弓切除術のレベルで分離した白質の培養神経幹細胞が見つからない。さらに、椎弓切除術を実行すると、コードの広い露出を許可する 1 つの作品背板を削除注意を取る。これは (1) 背側脊髄の最小針トラック損傷を実行する十分なアクセス権を許可し、(2) から取り残されるとマウスの閉鎖や回復後の動きに続く二次災害を引き起こして骨のセグメントを防ぐ。全体の板がいない 1 つの作品としてか、椎の両側に突き出ている鋭い骨のセグメントが観察される、縫合する前にこれらの断片を削除する (歯の鉗子や曲線はさみ) などの楽器を使用します。
研究者は外科的閉鎖中に筋層に縫合糸を適用するときに非常に注意する必要があります。(二重結び目) 1 つの縫合されるべきである尾椎弓切除術/傷害のレベルに、縫合糸はそのまま椎体骨の上にあります。これはマウスから離すとリカバリ後露出のコードと接触している筋肉の縫合から生じる二次損傷を防ぐためです。さらに、椎弓切除術/傷害に尾筋の縫合は、SCI が実行された分析のため脊髄を隔離するときのランドマークとして機能します。それは解剖顕微鏡の下で細かい解剖中に認識可能な残ることができるように、負傷した領域の構造を損なうことを避けるために、脊髄損傷領域に切り裂く場合注意をすべき。Neurosphere アッセイについて細胞死を増やすことができます空気の泡の生産を避けるに優しく細胞ペレットの機械製粉を行うことが重要です。pNSC 由来の神経幹細胞、破片重い、成長条件にさらにもっと敏感な-過剰な製粉と酵素溶液中長時間-dNSC 文化を基準にして。派生 pNSC 球が dNSCs よりも小さくコンパクト。PNSCs の希少性を考えると、1 サンプルあたり少なくとも 240,000 細胞を分離することをお勧めします。
最小限の科学モデルが機能障害の研究を許さない (内因性 NSCs の活性化) など損傷細胞イベントの勉強に最適です。針トラックの負傷から回復マウスに永続化顕著な行動の赤字経験ない前述したようとマウスを機能的転帰を改善するために設計された治療上の介在の有効性の評価できないなど。再生医療の 1 つの重要な側面は、治療する必要がありますいないだけ促進する (neurosphere アッセイ、トレースする血統および免疫組織染色/免疫蛍光との組み合わせでこのモデルを使用して評価可能) な組織修復がまた該当する行動パラダイムを使用して関連の機能改善を示す必要があります。足故障テストなど通奏低音、ビーティー、Breshnan (BBB) オープン フィールドの運動スケール28傷害の胸部モデルの機能的帰結をテストに使用される行動のタスク数が十分に敏感な私たちの最小の測定可能な赤字を検出するにはSCI のモデル。この欠点を克服するために 1 つを作ることができますの最小検出可能性があります、歩行分析を含む総体および良い後肢の歩行パラメーターの複数のパラメーターを測定するより敏感なデジタル採点システム (例えばキャットウォーク) の使用最小限の損傷に起因する赤字はモデル29をです。
このメソッドは、脊髄損傷モデルにおける潜在的な療法としての内因性の NSC 活性化を研究に適応することができます。頸部の SCI は最も臨床的に関連するモデルと提案する高い椎骨セグメントにこの損傷モデルの適応かどうかの洞察を提供する NSCs とその子孫 (動力学、移行の応答の地域バリエーションがあります分化) 病変がより深遠で測定可能な機能的な赤字になるかどうかと。(離断、クリップ圧縮挫傷など) 現在使用しているマウスの頸髄損傷モデルでは、手動で膀胱を表現、マウスの呼吸を常に監視する必要性を含む集中的な手術後のケアを必要とします。頚髄損傷を最小限の損傷モデルを適応させるが死亡率, 罹患率と術後ケア他頸部損傷モデルに関連付けられていると同様減らす薬/小分子および/またはリハビリテーションの有効性を確認する 1 つを許可神経回復の成果。損傷モデルは、合わせてコード (すなわち、背側または外側の列) および/またはより深い浸透のより大きい傷害のさまざまな部分および/またはより大きい大きさで分類された針 (小さいゲージ) を使用最小限の損傷を作成することができます。これにより、制御/操作タイプと、病変の大きさとこうしてそれに応じて携帯電話と機能・行動回復を評価する研究者。
マウスで最小限の損傷モデルは、トランスジェニック動物モデルの使用を許可します。マウス モデルは、内因性の幹細胞や前駆細胞損傷前のラベリングを有効にします。これにより、研究者は傷害に続くこれらのあらかじめ標識細胞の運命を追跡し、神経系前駆細胞の増殖、移行、および分化損傷評価-潜在的神経修復に貢献。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は Krembil 財団 (営業許可 CMM) によって資金を供給します。WX はカールトン マルグリット スミス学生賞の受信者です。NL は、オンタリオ州大学院奨学金を受け取った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
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