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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

健康脑-垂体切片对硬骨鱼类鱼垂体细胞电生理的研究

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

本文介绍了利用硬骨鱼类鱼鳉 (Oryzias latipes) 制作可行的脑-垂体组织切片的优化协议, 然后用膜片钳技术进行垂体细胞的电生理记录, 并穿孔补丁配置。

Abstract

垂体细胞的电生理研究已经在许多脊椎动物中进行, 但在硬骨鱼类鱼中很少。其中, 明显多数是在分离的主要细胞上进行的。为了提高我们对如何硬骨鱼类垂体细胞的理解, 在一个更具生物学意义的环境中表现, 这个协议显示了如何使用小淡水鱼鳉 (Oryzias latipes) 制备可行的脑垂体切片。将所有溶液的脑-垂体切片、pH 值和渗透压调整到生活在25到28摄氏度的淡水鱼体液中。在切片准备后, 该协议演示了如何使用穿孔的全细胞膜片钳技术进行电生理记录。膜片钳技术是一种功能强大的工具, 具有空前的时间分辨率和灵敏度, 允许从完整的整个细胞到单个离子通道的电性能进行调查。穿孔补丁是独一无二的, 因为它保持细胞内环境的完整性, 防止调节元素的细胞质被稀释的补丁吸管电极解决方案。相比之下, 在执行传统的全细胞记录时, 观察到鳉垂体细胞很快就失去了射击动作电位的能力。在现有的各种穿孔技术中, 本协议演示了如何使用杀菌剂两性霉素 B 实现修补膜穿孔。

Introduction

垂体是脊椎动物的主要内分泌器官, 位于下丘脑下和视神经交叉后。它产生和分泌六到八荷尔蒙从特定细胞类型。垂体激素是大脑和周围器官之间的一种中间体, 它推动了一系列重要的生理过程, 包括生长、繁殖和调节稳态。与神经元相似, 垂体内分泌细胞具有自发激发动作电位1的电兴奋能力。这些动作电位的作用是细胞依赖。在哺乳动物垂体的几种细胞类型中, 动作电位可以使细胞内钙含量提高2 以上, 以持续释放荷尔蒙2。此外, 垂体从大脑中得到刺激和抑制信息, 影响细胞3、4、5、6的细胞膜电位。通常情况下, 刺激输入会增加兴奋性, 并且经常涉及从胞内存储中释放 Ca2 +以及增加射击频率7。了解细胞如何利用离子通道组成, 并适应这些输入信号从大脑是了解激素合成和释放的关键。

二十世纪七十年代下旬, Sakmann 和内尔8、9、10和哈米尔11进一步改进了膜片钳技术, 并允许对细胞的电生理特性进行详细的研究。单离子通道。此外, 该技术还可用于研究电流和电压。今天, 贴片夹紧是衡量细胞电生理特性的金标准。四密密封贴片钳技术主要配置11;细胞连接, 内而外, 外出, 和整个细胞补丁。三第一种配置通常用于单离子通道调查。第四, 在细胞连接配置后, 细胞膜上的一个孔是利用亚大气压进行的。这种配置还允许对整个单元12的离子通道组成进行调查。然而, 这种技术的一个局限性是, 细胞质分子是稀释的膜片吸管溶液13 (图 1A), 从而影响的电学和生理反应的研究细胞。事实上, 其中一些分子可能在信号传导或不同离子通道的调节中扮演重要角色。为了避免这种情况, 林道和费尔南德斯14开发了一种方法, 将孔隙形成的化合物添加到贴片吸管中。根据细胞连接的配置, 该化合物将并入等离子膜下的补丁和慢慢穿孔的膜创建电接触细胞质 (图 1B)。几种不同的抗真菌药物, 如制霉菌素15和两性霉素 B 16, 或表面活性剂, 如皂苷β-七叶皂素17,18可以使用。这些化合物创造足够大的毛孔, 允许在细胞质和贴剂之间进行单价阳离子和 Cl 扩散, 同时保持大分子和更大的离子如 Ca2 + 15的胞浆水平, 16。

使用穿孔补丁的挑战是潜在的高串联电阻。串联电阻 (Rs) 或接触电阻是相对于地面的贴片吸管的联合电阻。在膜片钳录音中, rs将与膜电阻 (rm)平行。rm和 rs并行工作, 作为一个电压分配器。随着高 rs,电压将下降的 rs给错误的录音。随着更大的电流记录, 错误将变得更大。此外, 分压器还依赖于频率依赖性的创建低通滤波器, 从而影响时间分辨率。实际上, 穿孔补丁可能并不总是允许大和快速电流的记录, 如电压门控 Na+电流 (详细读数见参考19)。另外, Rs在补丁钳录音期间可能变化, 再导致记录的当前的变动。因此, 在药物应用过程中 R 变化的情况下, 可能发生误报。

安徒生实验室首先介绍了切片组织的电生理学, 以研究脑20中神经元的电生理特性。该技术为在更完整的环境中对单细胞以及细胞通讯和细胞电路的详细研究铺平了道路。1998年 Guérineau 了一种类似的制作垂体切片的技术. 21. 然而, 2005年之前, 脑-垂体切片制剂已成功用于硬骨鱼类22的膜片钳研究。在本研究中, 作者还报告了使用穿孔膜片钳录音。然而, 到目前为止, 大多数垂体细胞的电生理研究都是在哺乳动物中进行的, 只有少数其他脊椎动物, 包括硬骨鱼类鱼1,2,22,23.在硬骨鱼类, 几乎所有的研究都在主要的离解细胞24,25,26,27,28,29,30 进行.

本文概述了从模型鱼鳉中制备健康脑-垂体切片的优化方案。与原代分离细胞培养相比, 该方法具有多种优点。首先, 与分离细胞培养条件相比, 细胞在相对保存的环境中被记录下来。第二, 切片制剂使我们能够研究细胞通讯介导的间接通路22, 这在分离细胞培养条件下是不可能的。此外, 我们还演示了如何使用多孔全细胞膜片钳技术, 以两性霉素 B 为成孔剂, 对获得的组织切片进行电生理记录。

鳉是原产于亚洲的一条小型淡水鱼, 主要见于日本。鳉的生理、胚胎学和遗传学研究已有100年的31, 是许多实验室中常用的研究模式。本文特别重视硬骨鱼类鱼下丘脑-垂体复合体的形态学组织: 而在哺乳动物和鸟类中, 下丘脑神经元释放其调节垂体内分泌细胞的神经激素。进入中位隆起的门系统, 有一个直接的神经投射到下丘脑神经元的内分泌细胞的垂体在硬骨鱼类鱼32。因此, 仔细进行脑-垂体切片在鱼类中尤为重要, 使我们能够研究保存完好的脑-垂体网络中垂体细胞的电生理特性, 特别是垂体细胞如何控制他们的兴奋性, 从而 Ca2 +稳态。

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Protocol

所有动物处理都是根据挪威生命科学大学研究动物的护理和福利的建议进行的, 并在授权调查员的监督下进行。

1. 编写文书和解决办法

注意: 所有的解决方案都应该是无菌的。应认真注意所有溶液的 pH 值和渗透压 (osmol/千克水), 应仔细地适应所研究物种的胞外环境。ph 值和渗透率应与精密电子设备 (如 ph 表和冰点 osmometer) 进行调整。

  1. 使500毫升的额外细胞溶液没有 ca2 + (ca2 +自由 EC): 150 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 1.3 毫米氯化镁2, 4 毫米葡萄糖, 10 毫米 Hepes。
    1. 溶解 4.38 g 氯化钠, 186.37 毫克氯化钾, 61.89 毫克氯化镁2, 360.32 毫克葡萄糖和1.19 克 HEPES 在450毫升超纯 (0.055 美国/厘米在25°c, 电阻率18.2 毫欧) H2O 在玻璃烧杯使用磁力搅拌器。
    2. 用氢氧化钠将 pH 值调整为7.75。
    3. 将溶液转化为500毫升的容积烧瓶。用超纯 H2O 填充体积瓶, 直到500毫升。
    4. 在测量渗透压之前, 先把溶液搅拌好。用甘露醇调节 290–300 mOsm。过滤器用水真空系统和0.2 µm 过滤器消毒溶液。
  2. 使500毫升的额外细胞溶液 (EC): 150 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 2 毫米 CaCl2, 1.3 毫米氯化镁2, 4 毫米葡萄糖, 10 毫米 Hepes。
    1. 用磁力搅拌器在玻璃烧杯中溶解4.38 克氯化钠、186.37 毫克氯化钾、147.01 毫克 CaCl2、61.89 毫克氯化镁2、360.32 毫克葡萄糖和1.19 克 HEPES 在450毫升的超纯 H2O。
    2. 用氢氧化钠将 pH 值调整为7.75。
    3. 将溶液转化为500毫升的容积烧瓶。用超纯 H2O 填充体积瓶, 直到500毫升。
    4. 在测量渗透压之前, 先把溶液搅拌好。用甘露醇调节 290–300 mOsm。过滤器用水真空系统和0.2 µm 过滤器消毒溶液。
  3. 用0.1% 牛血清白蛋白 (EC 与 BSA) 制作500毫升的超细胞溶液: 150 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 2 毫米 CaCl2, 1.3 毫米氯化镁2, 4 毫米葡萄糖, 10 毫米 Hepes。
    1. 用磁力搅拌器在玻璃烧杯中溶解4.38 克氯化钠、186.37 毫克氯化钾、147.01 毫克 CaCl2、61.89 毫克氯化镁2、360.32 毫克葡萄糖和1.19 克 HEPES 在450毫升的超纯 H2O。
    2. 用氢氧化钠将 pH 值调整为7.75。
    3. 将溶液转化为500毫升的容积烧瓶。用超纯 H2O 填充体积瓶, 直到500毫升。
    4. 在测量渗透压之前, 先把溶液搅拌好。用甘露醇调节 290–300 mOsm。过滤器用水真空系统和0.2 µm 过滤器消毒溶液。添加50毫克 BSA。
  4. 使250毫升胞内溶液 (IC): 110 毫米 KOH, 20 毫米氯化钾, 10 毫米 Hepes, 20 毫米蔗糖。
    1. 用磁力搅拌器在玻璃烧杯中溶解1.54 克 KOH, 327.75 毫克氯化钾, 595.75 毫克 HEPES 和1.712 克蔗糖, 在450毫升的超纯 H2O 中。
    2. 用 (n-吗啉代) 乙烷磺酸 (MES) 将 pH 值调整为7.2。
    3. 将溶液转化为250毫升的容积烧瓶。用超纯 H2O 填充体积瓶, 直到250毫升。
    4. 在测量渗透压之前, 先把溶液搅拌好。调整到 280–290 mOsm (10 mOsm 低于 EC) 与蔗糖。过滤器用水真空系统和0.2 µm 过滤器消毒溶液。
  5. 在 ca2 +和 BSA 自由 ec (2 克低熔融琼脂糖在100毫升的钙2 +自由 ec) 制造100毫升2% 低熔融琼脂糖溶液。用微波炉溶解, 将融化的琼脂糖放在40摄氏度的水浴中。让它冷却下来, 直到它达到40°c 之前使用的组织。
    注: ec, Ca2 +免费 EC 可以储存在4摄氏度, 如果无菌和 IC 解决方案在-20 摄氏度, 几个月。琼脂糖可以储存一个星期在4°c, 可以重复使用3–5时间简要微波。过量再利用会导致琼脂糖的蒸发和改变, 盐的浓度和质量。
  6. 制作琼脂桥:
    1. 热7.5 毫米长的硼硅酸盐玻璃毛细血管与外径 (外径) 2 毫米和内径 (id) 1.16 毫米使用本生燃烧器在一个焦点约1/3 从一端直到玻璃开始弯曲。从火焰中取出玻璃, 并允许玻璃以大约120度的角度弯曲 (图 2A)。
    2. 在正常 EC 中, 用微波炉融化2% 琼脂, 而琼脂糖则是液体, 用毛细现象力将玻璃的一端放进液体中, 等待几分钟。商店桥梁, 直到使用4°c 在 EC 没有葡萄糖。
  7. 用合适的吸管拉吸管用灯丝贴片制备硼硅酸盐玻璃。请参阅吸管牵引器手册, 以获得所需的电极电阻。
    注: 吸管的锥度应尽可能短。采用第4-6 拉步法实现了短吸管锥度。电极电阻应介于2和 6 MΩ之间, 具体取决于细胞大小。
  8. 为了避免组织在膜片钳实验中的运动, 在硼酸盐缓冲器中涂上0.1% 聚乙烯亚胺 (裴) 的记录腔表面。
    1. 准备500毫升硼酸盐缓冲器 (25 毫米):
      1. 用磁力搅拌器在玻璃烧杯中溶解4.768 克 Na2B4o7/10H2o 的450毫升的超纯 H2o。
      2. 用 HCl 将 pH 值调整为8.4。
      3. 将溶液转化为500毫升的容积烧瓶。用超纯 H2O 填充体积瓶, 直到500毫升和0.2 µm 过滤器用水真空系统消毒溶液。
    2. 在25µL 的硼酸盐缓冲器中, 通过稀释0.1% µL 10 个库存溶液, 将1% 的裴 (1 毫升50% 裴至49毫升1% 毫米硼酸盐缓冲器) 和100裴稀释剂准备好, 最后使用。
    3. 在片架上的玻璃上添加2毫升0.1% 的裴, 让涂层孵化1分钟。然后用5毫升的超纯 H2O 简单地洗两次玻璃, 让空气干燥, 直到使用。
  9. 准备两性霉素 B 溶液。
    1. 60毫克/毫升的股票溶液溶解3毫克的两性霉素 B 粉在50µL 二甲基亚砜 (亚砜), 在1毫升管保护免受光。漩涡在最大速度三十年代和油脂实验15分钟到融汇。储存整除数到3–5管在摄氏-20 摄氏度和使用一个整除每天。
      注: 如果两性霉素 B 的股票溶液不清晰, 黄色, 但乳白色 (仍然黄色) 后 15–20 min 超声波做一个新的股票解决方案。
    2. 吹打2毫升的 ic, 使 ic 溶液与两性霉素 B 结合成一个干净的玻璃烧杯, 容量超过10毫升。在吸管溶液中加入8µL 的两性霉素 B 溶液, 并用吹打混合。用铝箔包裹烧杯, 放在冰上, 每3小时更换一次。

2. Vibratome 的解剖和切片

  1. 解剖前准备解剖工具, 包括一个锋利的和一个强钳与剪刀。用乙醇清洁工具 (纸巾夹、刷子、镊子), 并确保它们仅用于解剖目的, 而不与固定组织接触。把它们放在一个单独的盒子里以避免污染。
  2. 弄死冰水中的鱼1分钟。
  3. 按照随后的步骤, 快速解剖鳉的大脑和垂体与锋利的钳 (使用不超过3分钟)。
    1. 用强钳抓鱼时, 用剪刀或尖钳把眼睛后面的两个视神经都严重。
    2. 将颅骨的背部从后向前侧打开, 用强钳一步步折断颅骨。
    3. 用坚固的镊子从一侧剥离头骨。
    4. 用剪刀或锋利的镊子把脊髓严重的。
    5. 轻轻地, 抓住脊髓与镊子, 翻转大脑从后到前, 并把它放入一个菜与冰冷 Ca2 +免费 EC。
  4. 用液体琼脂糖填充一个 1.5–2 cm3金属模子并且放置它在冰上。
  5. 就在琼脂糖凝固之前 (在25–30°c 附近), 用镊子轻轻地抓住大脑, 用一张细纸擦干镊子, 把纸巾放进琼脂糖里。快速混合琼脂糖, 稀释在组织周围留下的欧共体的痕迹, 并定位组织, 让模具在冰上几秒钟, 直到琼脂糖硬化。
    注意: 这一步必须快速。当金属模被冰冷却后, 琼脂糖很快就凝固了。
  6. 用手术刀刀片修剪含有组织的一方形琼脂糖, 并用手术 (无毒) 胶水将其粘在 vibratome 标本持有者身上。
  7. 填充试管的 vibratome 接受标本 (脑垂体) 持有人与冰冷的 Ca2 +免费 EC。
  8. 将标本持有者放入 vibratome 中, 并切开琼脂糖块, 使旁部分150µm, 使用高频和低速切片。收集选定的部分, 并将其放入膜片钳记录室与3毫升冰冷 Ca2 +免费 EC。
  9. 将网格竖琴 (图 2B) 放在组织部分。
    注: 竖琴将与涂层稳定的组织和防止它移动在补丁钳录音。
  10. 在竖琴到位后, 将 ca2 +免费 ec 培养基改为正常 ec 与 ca2 +和 BSA。让纸巾休息10分钟。

3. 穿孔膜片钳和电生理记录

  1. 在开始实验之前, 氯化银线电极由以下步骤: 首先, 使用细砂纸 (p180) 清洁银线电极。第二, 用2毫升, 70% 乙醇冲洗。第三, 将导线浸在2毫升, 2–5% 氯为10分钟。最后, 用2毫升, 超纯 H2O 冲洗。
  2. 将记录室与脑垂体切片放置在显微镜阶段, 用10X 目标定位目标区域 (垂体), 并使用40X 目标对细胞进行检查。
    注意: 如果准备工作成功, 则很少有圆形细胞可见。这些圆形细胞通常被损坏的细胞从组织中分离出来。
  3. 将接地电极通过2% 琼脂桥进入欧共体浴。
  4. 使用40X 目标定位健康细胞。
    注意: 一个健康的细胞应该牢固地附着在组织切片上, 而不是从切片中向上和分离。
  5. 在电压钳中设置放大器 (VC;图 4A点 1) 模式。打开密封测试窗口并按下浴缸配置 (图 4B点1和2。使用 5 mV 脉冲监测吸管阻力 (图 4B点 3)。
  6. 用微填料注射器在用两性霉素 B 添加 ic 溶液之前, 用无真菌的 ic 溶液将贴片吸管的尖端回填 (见图 3)。
  7. 使用1毫升注射器在贴片吸管中添加轻微的正气压。
    注意: 这使得一个小的液体流动的补丁吸管, 避免污染的尖端。
  8. 一旦在浴缸中, 评估贴片阻力, 并确保没有颗粒附着在吸管的尖端 (图 4C)。
    注意: 将一小块磁带连接到显示器上, 显示视频录制形式的视野。这使得当目标不专注于细胞时, 贴片吸管相对于细胞更容易定位。
  9. 使用并联将贴片吸管向下引导至细胞。
    注意: 通过寻找可能附着在吸管尖端的小颗粒来确保吸管是干净的。阻力的突然变化也可能是在吸管尖端的粒子卡住的结果。
  10. 调整吸管, 当几个微米以上的细胞, 使吸管的尖端将接触细胞1/3 从细胞中间, 如图 5所示。当触摸细胞, 释放压力, 并应用温和的吸力, 使印章。
    注: 从贴片吸管进入浴缸的时间应尽可能保持短。不超过1–1.5 分钟, 以避免两性霉素 B 到达吸管的尖端和泄漏到浴缸。
  11. 立即切换到修补程序窗口中的补丁钳软件 (图 4D点 1), 并有一个持有的潜力在-50 和-60 mV (图 4D点 2)。零出的快速电容由玻璃吸管 (图 4D点 3)。
  12. 切换到补丁钳软件中的单元格窗口 (图 4E点1和 2), 并开始监视访问电阻, Ra, 显示在窗口上。将放大器软件中的膜电容降至零 (图 4E点 3) 经过足够的访问。
    注意: 足够的访问可能需要10到30分钟 (图 4E点 2)。对当前钳位记录的良好访问应低于 20 m。
  13. 切换到电流钳, IC, 放大器软件窗口 (图 4F点 1)。调整放大器软件的I 钳窗口中的快速电容电流 (图 4F点2和 3), 与3.12 中的值相同。检查膜电位 (图 4F点 1)。
    注意: 重要的是, 如果膜电位很浅 (典型的在-35 mV 以上), 细胞可能会受损。取消录制并查找新单元格。
  14. 在找到一个健康的细胞 (牢固地附着在膜电位低于-40 mV 的组织), 开始实验记录, 详细的制造商的协议33,34。

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Representative Results

该协议演示了如何通过鳉转基因线 [Tg (lhb-hrGfpII)] 在目标细胞 (Lh 产生的 gonadotropes) 中实现可靠的电生理记录, 从垂体 (gonadotrope) 细胞中获得可靠性的一步一步的协议。被标记为绿色荧光蛋白 (GFP)。

初步采用全细胞构型进行电生理研究。然而, 任何研究的细胞都没有观察到自发动作电位。在细胞的子集中, 动作电位可以通过小电流注入 (5-9 pA) 从-50 和-60 mV 之间的静止电位中触发 (图 6)。这些动作电位有一个快速的断开, 并在大约第4-6 分钟触发动作电位不再可能。被观察的特别快速的概要可能由小细胞大小解释。一般来说, 垂体细胞比神经元小30。例如, gonadotrope 细胞的平均膜电容范围介于4和 10 pF 3、30、35之间。与这些发现类似的是, 鳉 gonadotrope 细胞的平均膜电容为 (平均 D) 3.4, 0.9 pF (n = 67)。

使用两性霉素 B 切换到穿孔补丁配置, 观察到50% 的记录细胞自发动作电位 (图 7A, n = 63 细胞从21动物)。此外, 即使在长时间的录音之后 (最多1小时), 也可以在95% 个细胞中触发动作电位, 而不会有明显的断开。重要的是, 为了实现可靠和高质量的录音, 必须先用无抗真菌的 IC 解决方案来填充尖端。如果少量的抗真菌药物在制造 gigaseal 之前逃脱了吸管尖端, 它会破坏目标细胞以及周围细胞。

为了测试穿孔补丁配置中的细胞是否能够对其主要释放激素作出反应, 我们应用了1µM Gnrh1 喷出在靶细胞上。在目前的夹具中进行了实验, 使我们能够监测电压的变化。这些实验揭示了双向反应 (图 7B)。第一个阶段是极化, 从内部存储中释放 ca2 +激活 ca2 +激活的 K+通道导致极化。第一个阶段是其次是极化和增加行动电位频率从3赫兹。在某些记录中, 第二个相位具有伪高原电位, 在复极化前观察到2或3小峰值。

Figure 1
图 1:膜片钳技术的全细胞 (A) 与穿孔贴片 (B) 的区别。在全细胞构型 (A) 中, 在 gigaseal 到位后, 通过将小的负压注入到膜片吸管中, 在膜中制造一个孔。在这种配置中, 重要的胞内分子, 如信号分子可以稀释成贴片吸管溶液, 从而影响细胞的电学和生理反应。这种现象在小细胞, 如垂体细胞中更为重要。相比之下, 在穿孔补丁配置 (B), 继 gigaseal 后, 电接触之间的细胞质和贴片吸管是由抗真菌药物或表面活性剂。在修补前, 将抗菌剂或表面活性剂装入贴片吸管中, 并将其纳入膜下的等离子膜中, 从而慢慢地穿透细胞膜, 只允许像单价离子这样的小分子通过。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 在议定书中使用的琼脂桥 (A) 和竖琴 (B) 的图片。在 mm 中缩放.请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3: 填充片式吸管.(A) 抗真菌游离 IC 溶液 (蓝色液体) 是回填的毛细管力, 由于在吸管内的灯丝。(B) 在用抗真菌游离 IC 填充吸管尖端后, 吸管的后部用注射器针 (微填料) 填充含有两性霉素 B (黄色液体) 的 IC 溶液。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4A
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Figure 4B
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Figure 4C
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Figure 4D
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Figure 4E
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Figure 4F
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图 4: 软件截图.(A) 显示放大器软件窗口。1. 亮点 (红色圆圈) 允许在电压钳 (VC) 之间切换的模式区域, 没有任何电流注入的电流钳 (I=0) 和电流钳 (IC)。2亮点 (红圈) 电压钳中快速电容电流调整的区域以及全电池电容电流调整。(B) 显示膜片钳软件, 并打开膜测试窗口。1. 亮点 (红圆) 膜测试按钮。2. 亮点 (红圈) 不同的脉冲配置, 浴缸, 补丁, 和细胞。3. 亮点 (红圈) 脉冲配置振幅和频率。(C) 显示了膜片钳软件 (左) 和放大器 (右) 软件的组合寡妇。(C) 突出 (红色圆圈) 的阻力时, 吸管是在浴缸和适当的接地使用琼脂桥 (在浴缸模式)。(D) 1。突出显示 (红色圆圈) gigaseal 后切换到修补程序模式。2. 亮点 (红圈) 脉冲配置 (10 mv 脉冲) 和保持电位调整为-60 mV。3. 亮点 (红色圆圈) 在千兆封印之后纠正或调零快速电容电流的窗口。(E) 1。突出显示 (红色圆圈) 用于监视访问电阻的单元模式。2亮点 (红圈) 细胞参数, 膜电容 (Cm), 密封质量 (Rm), 访问电阻 (Ra), 时间常数 (头) 和保持电流 (保持)。3. 亮点 (红圈) 纠正膜电容电流的按钮。(F) 1。亮点 (红色圆圈) 用于监控膜电位的 IC 模式。2. 亮点 (红圈) 按钮切换到当前钳位调整 (I 钳)。3. 亮点 (红圈) 纠正快速电容电流的窗口。

Figure 5
图 5: 使用穿孔补丁配置的垂体细胞上的膜片钳记录的显微图像.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 目前使用正常全细胞构型的注射用 GFP 标记的 Lh 生成细胞的当前钳位记录.细胞保持在-50 和-60 mV 之间。典型动作电位可以在细胞的子集中触发, 使用 5–10 pA 电流注射后立即进入细胞 (黑色痕迹)。1–3分钟后, 动作电位振幅开始减小, 典型的断开 (青色迹) 标志。在第4-6 分钟以后行动潜力振幅几乎完全地消失了 (洋红踪影)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 当前钳位录音从 GFP 标记的 Lh 生产的细胞使用穿孔的补丁配置, 跟随刺激与促性腺激素释放荷尔蒙 Gnrh1.(a) 目前的钳位记录, 显示了 Lh 产生 gonadotrope 细胞的自发动作电位。(B) 一种双相反应, 十年代 Gnrh1 刺激首先诱发细胞膜的极化, 然后在先前发射的细胞中, 将动作电位从3赫兹的放电频率增加 (从赫赫兹到-hz)。自发动作电位。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

用膜片钳技术进行脑-垂体切片的电生理记录需要仔细的优化。在硬骨鱼类中专门进行活细胞调查的优化协议是有限的, 大多数出版物都使用基于哺乳动物系统的协议。在这方面, 重要的是要知道, 一些生理参数, 如 pH 值和渗透系数不仅是物种依赖, 而且很大程度上取决于有关有机体是否生活在陆地上或在水中。对鱼类而言, 如果它们生活在海洋或淡水环境中, 也必须考虑到这一点。例如, 在鱼类中, CO2分压比哺乳动物有更低的水平, 从 1.7–3.4 mmHg2的鱼和 40–46 mmHg2在哺乳动物36。在此基础上, 我们在当前协议中使用的所有解决方案中调整 pH 值为 7.75 37、38、39和40 。我们也使用 HEPES 缓冲区, 因为它已被证明具有良好的缓冲能力在 pH 值区域的 7.4–7.8 41。对于渗透压, 我们使用 290–300 mOsm, 这是测量的细胞外环境下的鳉42。根据鱼的环境选择了电生理记录中使用的温度。事实上, 鳉生活在温度范围很宽的水域 (从4到40摄氏度), 而在我们的实验室里, 它们是在26–28°c 的受控环境中长大的。在此基础上, 我们在室温下 (大约25摄氏度) 进行了我们的录音, 不同于哺乳动物组织 (37 °c) 或冷水鱼种类 (如大西洋鳕鱼 (12 °c) 18) 的使用情况。

为了能够修补垂体细胞, 生成健康的组织切片是至关重要的。必须使用干净的工具 (组织持有人, 刷子, 钳等), 只有接触活体组织 (不护)。快速解剖脑和垂体, 并保持组织在低温 (4 °c), 而解剖和切片是其他关键因素提供可行的部分。在组织嵌入时, 还应特别注意琼脂糖的温度。太热的琼脂糖可能会损伤组织, 而太冷的琼脂糖不会让你的时间来定位组织的正确切片。此外, 切片应该做与 EC 解决方案没有 Ca2 + , 以避免受损的细胞后切片进入细胞凋亡。起泡是没有必要的, 但组织切片应立即收集后切片。将切片保持在15分钟以下, 以便在修补之前让细胞休息一下。

硬骨鱼类鱼是研究垂体细胞电生理特性的优良模型。事实上, 与哺乳动物和鸟类相反, 鱼没有一个中位隆起, 这意味着控制脑垂体的下丘脑神经元直接投射到他们的靶细胞32。因此, 在脑垂体切片中, 垂体细胞在一个更完整的环境中维持, 与最初的垂体细胞培养相比, 细胞是用化学和机械治疗分离出来的。有趣的是, 使用鳉的脑-垂体切片, 我们可以观察到, 在 Gnrh1 激活后, Lh 细胞的动作电位发射频率增加 (图 5)。这些观察与我们自己实验室29的垂体细胞培养研究报告中所报道的一致, 表明使用主垂体细胞培养物仍然与表征垂体细胞的细胞膜特性有关。然而, 脑垂体切片允许我们也研究不同化合物的间接效应以及细胞间的相互作用, 因为它维持着在原垂体细胞培养中丢失的结构连接。此外, 与分离的原代细胞培养相比, 切片制剂的制备速度更快, 在解剖后30分钟内电生理记录可以进行。这意味着, 与主要细胞培养相反, 昼夜节律可以用有意义的方式来处理, 使用新鲜制备的切片。

由于鱼的垂体细胞体积小 (膜电容约 3-10 pF), 我们自己的观察表明, gonadotrope 细胞失去了射击动作电位的能力 (图 3), 因而失去了响应的能力。在全细胞构型的记录中释放荷尔蒙时, 我们决定使用并提出在这里的穿孔补丁技术。事实上, 它已经表明, 全细胞配置可能导致扩散的重要细胞质分子, 从而改变电生理细胞属性13。改用用两性霉素 B 穿孔的补丁配置, 将细胞膜穿孔到贴片吸管中, 只有小孔才允许小离子通过15、16、43,44、我们可以避免这种稀释, 并记录细胞的电活动时间延长。

在穿孔贴片技术中, 一个重要的问题是先用无抗真菌药物的 IC 溶液填充吸管, 以避免将抗真菌药物释放到介质中, 并在与贴片吸管接触时损害切片的所有细胞。事实上, 由于在接近组织时对贴片吸管施加的正压, 一些液体通过贴片吸管泄漏, 直到贴片被制成。这一流动有助于保持尖端清洁, 直到你到达靶细胞, 但如果在培养基上释放抗菌剂之前, 它可以穿孔所有细胞膜的所有细胞, 大大改变细胞膜的渗透性特性, 从而其电性能。

对鳉 gonadotrope 细胞的电活动进行了优化和成功的研究。此外, 该议定书可用于研究在鳉和其他硬骨鱼类鱼类的垂体中发现的所有 (内分泌) 细胞类型。请记住, 所有溶液的渗透和 pH 值必须调整到所涉物种体液中。

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Disclosures

作者没有什么可透露的

Acknowledgments

我们感谢 LourdesCarreon 女士帮助维护鳉设施和安东尼. 珀尔为例证数字。这项工作由 NMBU 和挪威研究理事会资助, 赠款244461号 (水产养殖项目) 和 248828 (数字生活挪威计划)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

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Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

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