Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

המאמר מתאר פרוטוקול ממוטב עבור ביצוע פרוסות קיימא רקמת המוח, יותרת המוח, תוך שימוש medaka של דג teleost (Oryzias latipes), ואחריו אלקטרופיזיולוגיות הקלטות של יותרת המוח תאים בטכניקה תיקון-קלאמפ עם תצורת תיקון מחורר.

Abstract

חקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח נערכו זנים חוליות רבים, אבל מעט מאוד דגים teleost. בין אלה, רוב ברור בוצעו על חלופה מועדפת תאים הראשי. כדי לשפר את ההבנה שלנו של מה teleost תאים יותרת המוח, להתנהג בסביבה יותר ביולוגית רלוונטית, פרוטוקול זה מראה כיצד להכין פרוסות המוח, יותרת המוח קיימא באמצעות medaka של דגים מים מתוקים קטנים (Oryzias latipes). עושה את פרוסות המוח, יותרת המוח, pH ו osmolality של כל הפתרונות הותאמו הערכים שנמצאו נוזלי גופו של דגי תיה 25-28 מעלות צלזיוס. בעקבות הכנה פרוסה, הפרוטוקול מדגים כיצד לערוך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בטכניקה תיקון שלם-תא מחורר-קלאמפ.... טכניקת תיקון-קלאמפ היא כלי רב עוצמה חסרת תקדים רזולוציה טמפורלית ורגישות, המאפשר חקירת תכונות חשמליות מתאי כל שלם אל תעלות יונים יחיד. תיקון מחורר הוא ייחודי בכך. זה שומר על הסביבה תאיים ללא פגע מונע גורמים רגולטוריים ציטוזול להיות מדולל לפי הפתרון אלקטרודה פיפטה תיקון. לעומת זאת, בעת ביצוע הקלטות שלם-תא המסורתי, זה היה ציין כי תאים יותרת המוח medaka במהירות מאבדות את יכולתן לפטר את פוטנציאל פעולה. בין ניקוב טכניקות שונות זמינים, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ניקוב של קרום תוקנו באמצעות ונעביר b. שהוא גוסס

Introduction

בלוטת יותרת המוח הוא איבר האנדוקרינית המפתח גולגולת ממוקם מתחת להיפותלמוס, אחורי הצנטר. הוא מייצר, מפריש הורמונים שישה עד שמונה סוגים תאים מסוים. הורמוני יותרת המוח מהווים ביניים בין המוח לבין איברים היקפיים ולנסוע מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים חיוניים כולל גדילה, רבייה של ההסדרה של הומאוסטזיס. בדומה נוירונים, תאי האנדוקרינית של ההיפופיזה נמצאים חשמלית להתרגש עם היכולת לירות פוטנציאל פעולה באופן ספונטני 1. תפקידם של אלה פוטנציאל פעולה הוא תא התלויים. מספר סוגי תאים של יונקים ההיפופיזה, פוטנציאל פעולה יכול לרומם את תאיים Ca2 + מספיק לשחרור מתמשכת של הורמון 2. בנוסף, בלוטת יותרת המוח מקבל מידע מופחתים והן מעכבות המוח המשפיעה על פוטנציאל הממברנה של התאים 3,4,5,6. בדרך כלל, קלט מופחתים מגביר את רגישות לעתים קרובות כרוך על שחרורו של Ca2 + מחנויות תאיים וכן גדל ירי תדירות 7. הבנת איך התא מנצל את ההרכב ערוץ יון ומתאים אלה אותות מהמוח, היא המפתח להבנה הורמון סינתזה ושחרור.

הטכניקה תיקון-קלאמפ היה פותח בסוף שנות ה-70 על ידי Sakmann, Neher 8,9,10 , משופרת נוספת על ידי האמיל 11, ומאפשר חקירות מפורטת של מאפייני אלקטרופיזיולוגיות של תאים אל תעלות יונים יחיד. יתר על כן, הטכניקה ניתן ללמוד זרם ומתח. היום, מחבר תיקון-חובק למעקה הוא תקן הזהב למדידת תכונות אלקטרופיזיולוגיות של התא. ארבע הגדולות תצורות לשיטת תיקון-קלאמפ חותם חזק היה מפותח 11; את התא צמוד-את-inside-out, את החוץ-אאוט, התיקון השלם-תא. שלוש תצורות הראשונה משמשים בדרך כלל עבור יון בודד ערוץ חקירות. ליום העצמאות, בעקבות לתצורת צמוד-תא, חור קרום התא הוא עשה שימוש בלחץ אטמוספרי תת. תצורה זו מאפשרת גם חקירות של יון ערוץ הרכב של התא כולו 12. עם זאת, מגבלה אחת של טכניקה זו היא כי מולקולות cytoplasmic הם מדולל על ידי תיקון פיפטה פתרון 13 (איור 1א'), ובכך משפיע על התגובות חשמליות ומגנטיות פיזיולוגיים של התאים למד. אכן, חלק מן המולקולות עשוי לשחק תפקידים חשובים בהעברת האות או בוויסות של תעלות יונים שונים. כדי למנוע זאת, לינדאו, פרננדז 14 פיתח שיטה איפה תרכובת להיוות נקבובית מתווסף על פיפטה תיקון. בעקבות לתצורת צמוד-תא, המתחם לשלב קרום פלזמה תחת התיקון, לאט לנקב את הקרום יצירת מגע חשמלית עם ציטוזול (איור 1B). ניתן להשתמש במספר תבחיני שונים כגון ניסטטין 15 ו- B שהוא גוסס 16, או פיתחה כגון סאפונין בטא-escin 17,18 . תרכובות אלו ליצור נקבוביות גדול מספיק כדי לאפשר הקטיון monovalent ו- Cl– דיפוזיה בין ציטוזול על פיפטה של תיקון תוך שמירה על רמת cytosolic של מקרומולקולות, יונים גדולים יותר כמו Ca2 + 15, 16.

האתגר של שימוש תיקון מחורר הוא ההתנגדות סדרת פוטנציאל גבוה. סדרת ההתנגדות (Rs) או הגישה התנגדות נגמר ההתנגדות משולב פיפטה תיקון ביחס הקרקע. במהלך הקלטות תיקון-קלאמפ, ה-Rs יהיה במקביל התנגדות הממברנה (Rמ'). Rm ו- Rs עבודה במקביל מחלק מתח. עם ה-R גבוהs, המתח ייפול על ה Rs נותן שגיאות בהקלטות. השגיאה יהפוך גדול עם זרמים גדול נרשם. בנוסף, מחלק מתח הוא גם תדירות תלויה יצירת מסנן נמוך לעבור, ובכך להשפיע על רזולוציה טמפורלית. למעשה, התיקון מחורר שלא תמיד יאפשרו הקלטות של זרמים גדול ומהיר כמו המתח מגודרת זרמי Na+ (עבור קריאות מפורט ראו התייחסות 19). כמו כן, Rs עשוי להשתנות במהלך הקלטות תיקון-קלאמפ, שוב מובילים לשינויים בזרם המוקלט. לפיכך, תוצאות חיוביות שגויות עלולה להתרחש במצבים שבו Rs משתנה במהלך היישום סמים.

אלקטרופיזיולוגיה על הרקמה הפרוס הוצג לראשונה על ידי המעבדה אנדרסן ללמוד אלקטרופיזיולוגיות מאפייני הנוירונים במוח 20. הטכניקה סללה את הדרך עבור חקירות מפורט של תאים בודדים, כמו גם מעגלי תקשורת ותא תא-תא בסביבה יותר ללא פגע. טכניקה דומה להכנת פרוסות יותרת המוח הוצג לראשונה בשנת 1998 על ידי. Guérineau et al. 21. עם זאת, זה לא היה לפני 2005, הכנה פרוסה יותרת המוח הזה שימש בהצלחה ללימודי תיקון-קלאמפ teleost 22. במחקר זה, המחברים דיווחו גם על השימוש תיקון מחורר-קלאמפ הקלטות. עם זאת, עד כה, רוב החקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח נערכו יונקים, רק קומץ של בעלי חוליות אחרים, כולל דגים teleost 1,2,22,23 . ב- teleosts, כמעט כל מחקרים בוצעו על תאים הפומבית ראשי 24,25,26,27,28,29,30 .

בתוך המאמר הנוכחי, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול ממוטב עבור הכנה של המוח, יותרת המוח בריא, פרוסות medaka דגים המודל. הגישה מייצג מספר יתרונות בהשוואה תרביות תאים הפומבית העיקרי. ראשית, התאים נרשמים בסביבה יחסית משומר לעומת חלופה מועדפת תנאי התרבות תאים. שנית, ההכנות פרוסה מאפשרים לנו ללמוד מסלולים עקיף בתיווך תא-תא תקשורת 22, אשר אינה אפשרית בתנאי חלופה מועדפת תא תרבות. יתר על כן, נדגים כיצד לנהל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות על הפרוסות רקמות שהושג באמצעות הטכניקה מחורר כולו-תא תיקון-קלאמפ עם המפוטריצין כסוכן להיוות נקבובית.

Medaka הוא דג מים מתוקים קטנים ילידי אסיה, בעיקר נמצאו ביפן. פיזיולוגיה, אמבריולוגיה, גנטיקה של medaka בהרחבה נחקרו במשך שנים מעל 100 31, זה דגם נפוץ מחקר במעבדות רבות. חשוב במיוחד הנייר הזה הינו הארגון מורפולוגיים ברורים של המתחם ההיפותלמוס, יותרת המוח בדגים teleost: ואילו ב יונקים וציפורים הנוירונים ההיפותלמוס משחרר שלהם הנוירו-ההורמונים וויסות תאים אנדוקריני יותרת המוח למערכת פורטל של קדושתו החציוני, יש השלכה עצבני ישירה של נוירונים היפותלמי אל התאים האנדוקריניים של ההיפופיזה ב דגים teleost 32. לפיכך, עם פרוסות המוח, יותרת המוח מתנהל היטב יש חשיבות מיוחדת בדגים, ומאפשר לנו לחקור את מאפייני אלקטרופיזיולוגיות התאים יותרת המוח ברשת יותרת המוח שהשתמרו ותאים בפרט איך בבלוטת יתרת המוח לשלוט דעתנית שלהם ועל ידי כך Ca2 + הומאוסטזיס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לטיפול בבעלי חיים כל בוצעה על-פי המלצות טיפול ולרווחתם של בעלי חיים מחקר ב אוניברסיטת הנורבגית למדעי החיים, ותחת פיקוחו של חוקרים מורשים.

1. הכנת כלים ופתרונות

הערה: כל הפתרונות צריכים להיות סטרילי. תשומת לב תינתן ועד ה-pH של osmolality (osmol/kg מים) של כל הפתרונות, אשר צריך להיות בזהירות מותאם הסביבה חוץ-תאי המין למד. pH ו osmolality צריך להיות מותאם עם ציוד אלקטרוני מדויק, כגון ph ו- osmometer נקודת הקיפאון בהתאמה.

  1. להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר ללא Ca2 + (Ca2 + חינם EC): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
    1. להמיס 4.38 g של NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג של גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית (0.055 ארה ב / ס מ 25 ° c, את resistivity של שלום כהן 18.2) H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
    2. להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.
    3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.
    4. מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.
  2. להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר (EC): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl2, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
    1. להמיס 4.38 גר' NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 147.01 מ"ג CaCl2, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
    2. להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.
    3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.
    4. מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.
  3. להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר עם 0.1% אלבומין שור (EC עם BSA): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl2, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
    1. להמיס 4.38 גר' NaCl, 186.37 מ"ג אשלגן כלורי, 147.01 מ"ג CaCl2, 61.89 מ"ג של MgCl2, 360.32 מ"ג גלוקוז ו- g 1.19 של HEPES ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
    2. להתאים את ה-pH ל 7.75 עם NaOH.
    3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל.
    4. מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 290-300 mOsm עם מניטול. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן. להוסיף 50 מ"ג BSA.
  4. להפוך 250 מ של פתרון תאיים (IC): 110 מ מ KOH, 20 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ Hepes, סוכרוז 20 מ מ.
    1. להמיס 1.54 g KOH, 327.75 מ"ג אשלגן כלורי, 595.75 מ"ג של HEPES ו 1.712 גר' סוכרוז ב 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
    2. להתאים את ה-pH ל 7.2 (N-מורפולינו) אתאן. חומצה sulfonic (MES).
    3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון הנפחי 250 מ. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 250 מ.
    4. מערבבים את הפתרון לפני מדידה את osmolality. התאם ל 280 – 290 mOsm (10 mOsm נמוך יותר EC) עם סוכרוז. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים ו- 0.2 µm מסנן.
  5. לעשות 100 מ של פתרון 2% נמוך agarose נמס ב Ca2 + ו- BSA חינם EC (2 גר' agarose ההיתוך נמוכה ב- 100 מ של Ca2 + חינם EC). לפזר בעזרת מיקרוגל ולמקם את agarose נמס בתוך אמבט מים ב- 40 מעלות צלזיוס. תן לזה להתקרר עד 40 ° צלזיוס לפני השימוש על הרקמות.
    הערה: EC, Ca2 + EC חינם ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות אם סטרילי ופתרונות IC ב-20 ° C, במשך מספר חודשים. Agarose ניתן לאחסן במשך שבוע ב 4 ° C, ניתן לבצע שימוש חוזר 3 – 5 פעמים לזמן קצר במיקרוגל. שימוש חוזר מופרז יוביל אידוי ושינוי של agarose, ריכוז המלחים ואיכות.
  6. לבצע גשר אגר:
    1. מחממים 7.5 מ מ נימים זכוכית בורוסיליקט ארוך עם מחוץ בקוטר 2 מ מ (יתר) והצבע בתוך קוטר (ז) מ מ טאו 1.16 בעזרת מבער בונזן מוקד כ 1/3 מקצה אחד עד הזכוכית יתחיל להתכופף. הסר את הזכוכית של הלהבה ולאפשר הזכוכית לכופף עם זווית של כ 120 מעלות (איור 2א).
    2. ממיסים 2% אגר ב- EC רגילה ללא גלוקוז באמצעות מיקרוגל, ובעוד agarose זה מילוי נוזלי הזכוכית מוכנות מראש נימי באמצעות קפילריות כוחות על ידי לשים באחד הקצוות של הזכוכית לתוך הנוזל ומחכים כמה דקות. לאחסן גשרים עד השימוש ב 4 ° C ב- EC ללא גלוקוז.
  7. הכינו זכוכית בורוסיליקט עם נימה תיקון פיפטות באמצעות של פולר פיפטה מתאימים. עיין במדריך פולר פיפטה כדי לקבל את ההתנגדות הרצויה אלקטרודה.
    הערה: לנר של פיפטה צריך להיות קצר ככל האפשר. להתחדד קצר פיפטה מושגת באמצעות צעדים מושך 4-6. ההתנגדות אלקטרודה צריך להיות בין 2 ו 6 MΩ בהתאם לגודל התא.
  8. כדי למנוע תנועה של רקמות במהלך הניסויים תיקון-קלאמפ מעיל פני השטח של התא הקלטה עם 0.1% של polyethylenimine (פיי) במאגר בוראט.
    1. הכנת 500 מ"ל של בוראט מאגר (25 מ מ):
      1. להמיס g 4.768 של נה2B4O710 H2O ב- 450 מ של הנדסה גנטית H2O בתוך זכוכית באמצעות מסית מגנטי.
      2. להתאים את ה-pH ל 8.4 עם HCl.
      3. להעביר את הפתרון לתוך בקבוקון נפח 500 מ"ל. למלא את סטריליות הנדסה גנטית H2O עד 500 מ"ל ו- 0.2 µm מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מערכת ואקום מים.
    2. להכין פתרון 1% מניות של פיי (50% 1 מ"ל פיי למאגר בוראט 25 מ מ מ ל 49) ו- 0.1% פיי לדילול מאת המדללת 10 µL של 1% פתרון מניות µL 100 בוראט מאגר לשימוש האחרון.
    3. להוסיף 2 מ של 0.1% פיי על הזכוכית של בעל פרוסה ולתת את ציפוי תקופת דגירה של 1 דקה. אז בקצרה לשטוף את הזכוכית. פעמיים עם 5 מ של הנדסה גנטית H2O ותני אוויר יבש עד השימוש.
  9. להכין את הפתרונות המפוטריצין.
    1. להפוך 60 מ"ג/מ"ל פתרון מניות על ידי המסת 3 מ ג של אבקת המפוטריצין µL 50 דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), צינור 1 מ"ל מוגן מפני אור. מערבולת במהירות המרבית עבור 30 s ו sonicate למשך 15 דקות homogenize. חנות aliquots לתוך צינורות 3 – 5 ב-20 ° C, להשתמש aliquot אחת ליום.
      הערה: אם הפתרון מניות B שהוא גוסס אינה ברורה וחד צהוב צבע אבל חלבי (עדיין צהוב) לאחר 15-20 דקות sonication להפוך פתרון מלאי חדש.
    2. להפוך IC פתרון עם המפוטריצין על ידי pipetting 2 מ ל IC גביע זכוכית נקי עם יותר מ- 10 מיליליטר. להוסיף 8 µL של פתרון מניות B שהוא גוסס הפתרון פיפטה ומערבבים על ידי pipetting. לעטוף את. הספל עם רדיד אלומיניום והמקום על הקרח עד לשימוש, לחדש אותו כל 3 שעות.

2. ניתוח וחלוקת עם Vibratome

  1. להכין כלי ניתוח לפני לנתח, כולל חדה אחת, מלקחיים חזק אחת עם מספריים. לנקות את הכלים (קופסת הטישיו, מברשת, מלקחיים) עם אתנול ולוודא כי הם משמשים למטרות ניתוח בלבד, לא ליצור קשר עם רקמות קבוע. לשמור אותם בקופסה נפרדת כדי למנוע זיהום.
  2. המתת חסד הדג במי קרח קר עבור 1 דקות.
  3. בצע את השלבים הבאים לנתח במהירות medaka המוח ואת יותרת המוח עם מלקחיים חדה (השתמש לא יותר מ 3 דקות).
    1. בעוד מחזיק את הדג עם המלקחיים חזקה חמור העצבים האופטים שני מאחורי העיניים עם מספריים או מלקחיים חדים.
    2. פתח את החלק הגבי של הגולגולת מן הצד האחורי בצד הקדמי על ידי שבירת עצמות הגולגולת צעד אחר צעד עם מלקחיים חזקה.
    3. לקלף את הגולגולת בצד אחד עם מלקחיים חזקה.
    4. חמור חוט השדרה עם מספריים או מלקחיים חדה.
    5. . בעדינות, קח חוט השדרה עם המלקחיים, להפוך את המוח האחורי כדי הקדמי ולמקם אותו לתוך תבשיל עם קר כקרח Ca2 + חינם לכלכלת
  4. ממלאים תבנית מתכת3 1.5-2 ס מ עם agarose נוזלי ומניחים אותו על הקרח.
  5. בדיוק לפני agarose מתמצק (ב בסביבות 25-30 מעלות צלזיוס), בעדינות לתפוס את המוח על ידי חוט השדרה עם המלקחיים, יבש המלקחיים עם חתיכה של נייר איכותי, מכניסים agarose הרקמה. מערבבים במהירות את agarose לדלל את העקבות של EC הותירו מסביב לרקמת, להתמצא הרקמה ולתת את התבנית על קרח לכמה שניות עד agarose מתקשה.
    הערה: הכרחי בשלב זה יהיה מהיר. Agarose עפור במהירות כפי כייר מתכת מקורר של קרח.
  6. חיתוך בלוק מרובע של agarose המכילה הרקמות עם להב סכין והדבק אותה על המחזיק הדגימה vibratome באמצעות דבק ניתוח (רעיל).
  7. למלא את cuvette של vibratome קבלת המחזיק (יותרת-המוח) הדגימה עם קרח Ca2 + חינם לכלכלת
  8. למקם את המחזיק הדגימה vibratome וחותכים את הבלוק agarose כדי להפוך parasagittal מקטעים של 150 מיקרומטר, באמצעות תדר גבוה ומהירות נמוכה עבור חלוקתה. לאסוף את המקטעים הנבחרים ולמקם אותם אל החדר הקלטה תיקון-קלאמפ עם 3 מ"ל של קרח Ca2 + חינם לכלכלת
  9. במקום הנבל הרשת (איור 2B) על סעיף הרקמה.
    הערה: הנבל יחד עם הציפוי לייצב את הרקמות ולמנוע ממנו לזוז במהלך ההקלטות תיקון-קלאמפ.
  10. לאחר בנבל במקום, לשנות Ca2 + חינם EC המדיום EC נורמלי עם Ca2 + ו- BSA. תן לשאר רקמות למשך 10 דקות.

3. תיקון-קלאמפ והקלטות אלקטרופיזיולוגיות מחורר

  1. לפני תחילת הניסוי, כלוריד הכסף תיל אלקטרודות על ידי הפעולות הבאות: ראשית, להשתמש עם נייר זכוכית עדין (p180 מיוצר מאלומיניום) כדי לנקות את האלקטרודות חוט כסף. שנית, לשטוף עם 2 מ"ל, 70% אתנול. שלישית, לטבול את החוטים ב mL 2, 2 – 5% כלור למשך 10 דקות. לבסוף, לשטוף עם 2 מ"ל, הנדסה גנטית H2O.
  2. מקום תא הקלטה עם הפרוסה יותרת המוח בשלב מיקרוסקופ לאתר אזור היעד (יותרת המוח) באמצעות המטרה X 10, לבדוק את התאים באמצעות המטרה X 40.
    הערה: אם ההכנה הוא מוצלח, צריך תאים עגולים ומעט מאוד להיות גלוי. תאים עגולים אלה הם תאים פגומים בדרך כלל כי הן ניתוק מן הרקמה.
  3. מקם את אלקטרודת הארקה דרך הגשר 2% אגר לאמבטיה EC.
  4. אתר תא בריא באמצעות המטרה X 40.
    הערה: תא בריא צריך להיות בחוזקה המצורפת הפרוסה רקמות לא מעוגל למעלה, מנותקת הפרוסה.
  5. להגדיר את המגבר מתח-קלאמפ (VC; מצב הצבע 4A איור 1). פתח החותם לבדוק תצורת האמבט החלון ולחץ (איור 4B נקודה 1 ו- 2. השתמש דופק 5-mV כדי לפקח על פיפטה ההתנגדות (איור 4B נקודת 3).
  6. מילוי בקצה פיפטה תיקון עם הפתרון IC חינם פטריות לפני הוספת הפתרון IC עם המפוטריצין באמצעות מזרק מיקרו-המילוי (ראה איור 3).
  7. להוסיף לחץ אוויר חיובי מעט פיפטה תיקון באמצעות מזרק 1 מ"ל.
    הערה: זה הופך זרם נוזלי קטן מ פיפטה תיקון זה למנוע זיהום של הקצה.
  8. פעם אחת באמבטיה, להעריך את ההתנגדות פיפטה תיקון וודא כי אין חלקיקי מחוברים בקצה פיפטה (איור 4C).
    הערה: חתיכה קטנה של קלטת מחובר על גבי הצג הצגת הטופס הקלטת וידאו שדה הראייה. זה הופך את מיקום פיפטה תיקון ביחס תא קל יותר כאשר המטרה לא מתמקד התא.
  9. מדריך על פיפטה תיקון אל התא באמצעות micromanipulators.
    הערה: ודא כי פיפטה נקי על-ידי חיפוש חלקיקים קטנים יש לצרף עד לקצה פיפטה. שינויים פתאומיים התנגדות עשוי גם להיות תוצאה של חלקיקים תקוע בקצה פיפטה.
  10. להתאים מחדש את פיפטה כאשר מספר מיקרונים שמעל לתא כך קצה פיפטה יגע התא 1/3 מהאמצע של התא, כמוצג באיור5. כאשר נוגעים התא, לשחרר את הלחץ ולהחיל היניקה עדין עד שנגרום לכלב-ים.
    הערה: הזמן פיפטה תיקון נכנס לאמבטיה כדי מוצלחת חותם ולמורה קצר ככל האפשר. לא יותר מ 1 – 1.5 דקות כדי להימנע המפוטריצין להגיע בקצה של פיפטה, דליפה לתוך האמבט.
  11. מיד, מעבר לחלון טלאי תיקון-קלאמפ לתוכנה (איור 4 D נקודה 1) ויש פוטנציאל מחזיק בין-50 ו-60 mV (נקודת4D איור 2). רפד קיבול מהר מורכב על-ידי פיפטה מזכוכית (נקודת4D איור 3).
  12. מעבר לחלון התא . מלחציים צולבים תיקון תוכנה (איור 4E נקודה 1 ו- 2) ולהתחיל ניטור הגישה התנגדות, Ra, מוצג בחלון. אפס החוצה קיבול הממברנה בתוכנה מגבר (איור 4E נקודת 3) לאחר ושברשותך הרשאת גישה מתאימה.
    הערה: גישה מספיקות עשוי להימשך 10-30 דקות (איור 4E הצבע 2). גישה טובה להקלטות קלאמפ הנוכחי צריך להיות מתחת 20 מ'.
  13. לעבור קלאמפ הנוכחי, IC, בחלון התוכנה מגבר (איור 4F נקודה 1). התאם את הזרמים מהיר-קיבולי בחלון קלאמפ של התוכנה מגבר (איור 4F הצבע 2 ו- 3) אותו ערך כמו 3.12. בדוק פוטנציאל ממברנה (איור 4F נקודה 1).
    הערה: חשוב, אם קרום פוטנציאלי הוא רדוד (אופייני מעל-35 mV) התא עלול להינזק. בטל את ההקלטה, למצוא תא חדש.
  14. לאחר מציאת תא בריא (מחובר היטב אל הרקמות עם קרומית אפשרית מתחת-40 mV), להתחיל ההקלטות ניסיוני כמפורט של היצרן-פרוטוקול- 33,-34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מדגים פרוטוקול צעד אחר צעד כיצד להשיג הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אמין מתאי יותרת המוח (gonadotrope), באמצעות קו הטרנסגניים medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] היכן היעד תאים (מייצרי Lh gonadotropes) מסומנות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).

בתחילה, החקירות אלקטרופיזיולוגיות נערכו באמצעות התצורה תאים שלמים. עם זאת, פוטנציאל פעולה ספונטנית לא נצפו בכל התאים למד. בקבוצת משנה של תאים, פוטנציאל פעולה יכול להיות מופעלות באמצעות זריקות הנוכחי קטן (5-9 pA) של פוטנציאל מנוחה בין-50 ו-60 mV (איור 6). פוטנציאל פעולה אלה הייתה סקירה מהירה, לאחר כ- 4-6 דקות כבר לא היו מופעלות פוטנציאל פעולה אפשרית. הסקירה מהירה במיוחד נצפתה ניתנת להסבר על ידי גודל תאים קטנים. באופן כללי, יותרת המוח תאים קטנים נוירונים 30. למשל, ממוצע קיבול הממברנה של gonadotrope טווחי תאים בין 4 ל 10 pF- 3,-30,-35. דומה medaka ממצאים אלה תאים gonadotrope היה של קיבול הממברנה הממוצע של pF 3.4 ± 0.9 (זאת אומרת ± S.D) (n = 67).

החלפת בתצורת תיקון מחוררים באמצעות המפוטריצין, פוטנציאל פעולה ספונטנית נצפו וכ-50% של תאים מוקלטות (איור 7א, n = 63 תאים מחיות 21). יתר על כן, פוטנציאל פעולה יכולח ב- 95% של תאים אלה עם סקירה הנצפה אין אפילו אחרי הקלטות ממושכות (עד 1 h). חשוב, על מנת להשיג הקלטות איכותי ואמין, יש צורך קודם למלא את הטיפ עם פטריות ללא פתרון IC. אם כמויות קטנות של תבחיני לברוח הטיפ פיפטה לפני שאתם עושים את gigaseal, זה עלול לגרום נזק לתא המטרה כתאי טוב כמו שמסביב.

על מנת לבדוק אם התאים בתצורה תיקון מחורר מסוגלים להגיב הורמון המשחרר הראשי שלהם, אנחנו מוחלים 1 מיקרומטר Gnrh1 עלים נפלט על תאי היעד. הניסויים בוצעו ב המלחציים הנוכחי כדי לאפשר לנו לעקוב אחר השינויים מתח. ניסויים אלה חשף תגובה biphasic (איור 7ב'). השלב הראשון הוא hyperpolarization שבו שחרורו של Ca2 + מחנויות פנימי להפעיל Ca2 + הופעל K+ ערוצי גורם hyperpolarization. השלב הראשון ואחריו דפולריזציה בעלת פוטנציאל הפעולה מוגברת תדר מ 1 – 2 הרץ עד בסביבות 3 הרץ. בחלק מן ההקלטות, השלב השני היה פוטנציאל מישור מדומה שבו נצפו 2 או 3 קוצים קטנים לפני רה-פולריזציה.

Figure 1
איור 1 : ההבדל בין התא כולו (א') את תצורות תיקון מחורר (B) לשיטת תיקון-קלאמפ. בתצורה שלם-תא (א), אחרי gigaseal הוא במקום, חור עשוי ממברנה על-ידי החלת לחץ שלילי קטן לתוך פיפטה תיקון. בתצורה זו, מולקולות תאיים חשובים כגון מולקולות איתות יכול להיות מדולל הפתרון פיפטה תיקון ובכך משפיע על תגובות פיזיולוגיות וחשמליים של התא. תופעה זו חשובה אפילו יותר תאים קטנים, כגון תאים יותרת המוח. לעומת זאת, בתצורת תלאים מחורר (B), בעקבות gigaseal, קשר חשמלי בין ציטוזול את התיקון פיפטה מורכב של תבחיני או פיתחה. פטריות או חומרים פעילי שטח טעינתו פיפטה תיקון לפני תיקון, ישולב קרום פלזמה תחת התיקון, ובכך לאט ניקוב הממברנה, ומאפשר רק מולקולות קטנות כמו יונים monovalent לעבור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תמונות של הגשר אגר (A) והנבל (B) בשימוש בפרוטוקול. המידה במ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : מילוי של התיקון-פיפטה. (א) פטריות חינם IC פתרון (נוזל כחול) הוא עצמם נסתמו ע י כוחות נימי בשל הלהט בפנים פיפטה. (B) לאחר מילוי בקצה פיפטה עם פטריות IC חינם, החלק האחורי של פיפטה מלא IC לאודנום המפוטריצין (נוזל צהוב) באמצעות מחט מזרק (מיקרו מלוי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4A
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4B
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4C
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4D
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4E
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4F
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : צילומי מסך התוכנה- (א) בסה כ מציג מגבר חלון התוכנה. 1. מדגיש (עיגול אדום) אזור מצב המאפשר מעבר בין מתח מהדק (VC), קלאמפ הנוכחי ללא כל זריקה הנוכחי (אני = 0) וקלאמפ הנוכחי עם אפשרות לזריקות הנוכחי (IC). 2 מדגיש (עיגול אדום) האזור לכיוונון זרם קיבולי מהר מתח קלאמפ, כמו גם התאמות הנוכחי קיבולי תאים שלמים. (B) מציג את התוכנה תיקון-קלאמפ עם חלון הבדיקה ממברנה פתוח. 1. מדגיש (עיגול אדום) לחצן בדיקת קרום. 2. מדגיש את תצורות שונות הדופק אמבטיה, תיקון, תא (עיגול אדום). 3. מדגיש (עיגול אדום) את הדופק תצורה משרעת ותדירות. (C-F) מראה אלמנת משולב תיקון-קלאמפ (משמאל) ותוכנות מגבר (מימין). (ג) מדגיש (עיגול אדום) ההתנגדות כאשר פיפטה באמבטיה ונכון ההארקה באמצעות גשר אגר (במצב אמבטיה). (ד) 1. מדגיש את המעבר למצב תיקון בעקבות gigaseal (עיגול אדום). 2. מדגיש (עיגול אדום) הדופק תצורה (10 mV פעימה) ופוטנציאל אחזקות להתאים ל-60 mV. 3. מדגיש (עיגול אדום) את החלון של תיקון או מכוונת את הזרמים מהיר-קיבולי בעקבות גושפנקה גיגה. (E) 1. מדגיש (עיגול אדום) מצב התא המשמש לניטור הגישה התנגדות. 2 מדגיש (עיגול אדום) הפרמטרים תא, קיבול הממברנה (ס מ), חותם האיכות (Rm), הגישה התנגדות (Ra), זמן קבוע (טאו) ומעודכנים אחזקות (לחיצה). 3. מדגיש (עיגול אדום) לחצן שתיקנת את הזרמים קיבולי ממברנה. (F) 1. מדגיש (עיגול אדום) את מצב IC עבור ניטור קרומית אפשרית. 2. מדגיש (עיגול אדום) לחצן כדי לעבור התאמות קלאמפ הנוכחי (I-קלאמפ). 3. מדגיש (עיגול אדום) החלון שתיקנת את הזרמים קיבולי-מהיר.

Figure 5
איור 5 : Micrograph מתיקון-מלחציים הקלטה על תא יותרת המוח באמצעות התצורה תיקון מחורר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : הקלטות קלאמפ הנוכחי GFP שכותרתו Lh-ייצור תא בעקבות זריקות הנוכחי משתמש בתצורה רגילה כל תא. התאים נשמרו בין-50 ו-60 mV. פוטנציאל פעולה אופיינית יכולח בקבוצת משנה של תאים באמצעות זריקות הנוכחית של הרשות הפלסטינית 5 – 10 מיד לאחר השגת גישה לתא (trace שחור). לאחר 1-3 דקות משרעת פוטנציאל הפעולה החלו להקטין, סימן אופייני של סיכום (trace ציאן). לאחר 4-6 דקות משרעת פוטנציאל הפעולה נעלמו כמעט לחלוטין (מגנטה trace). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : מהדק הנוכחי הקלטה מתוך תא GFP שכותרתו Lh ייצור באמצעות לתצורת תיקון מחורר, בעקבות גירוי עם Gnrh1 גונדוטרופין – releasing הורמון. (א) קלאמפ ההקלטה הנוכחית הוכחת פוטנציאל פעולה ספונטנית מתא gonadotrope ייצור Lh. תגובה biphasic (B) A שבו גירוי Gnrh1 10 s המושרה קודם hyperpolarization של קרום התא ואחריו דפולריזציה והגדילה ירי תדר (מ 1 – 2 Hz עד 3 הרץ) של פוטנציאל פעולה בתא אשר קודם לכן ירה פוטנציאל פעולה ספונטנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בטכניקה תיקון-קלאמפ על פרוסות המוח, יותרת המוח דורש אופטימיזציה זהירה. פרוטוקולים היטב אופטימיזציה עבור ביצוע חקירות לחיות תאים במיוחד teleosts מוגבלות, עם הרוב של פרסומים באמצעות פרוטוקולים המבוססים על מערכות יונקים. בהקשר זה, חשוב להיות מודעים לעובדה כי מספר פרמטרים פיזיולוגיים כמו pH osmolality הם לא רק מינים תלויים, אבל גם תלוי מאוד אם המדובר האורגניזם חי ביבשה או במים. דגים, יש גם צורך, לקחת בחשבון, אם הם חיים בסביבה ימית או מים מתוקים. לדוגמה, הלחץ חלקי2 CO הוא נמוך בהרבה בדגים לעומת יונקים עם הרמות החל 1.7-3.4 מ מ כספית pCO2 דגים ו 40-46 מ מ כספית pCO2 ב יונקים 36. בהתבסס על זה, נוכל להתאים את ה-pH ל- 7.75 37,38,39,40 בכל הפתרונות בשימוש בפרוטוקול הנוכחי. אנו משתמשים גם HEPES מאגר כפי הוכח להחזיק קיבולות חציצה מעולה באזור ה-pH 7.4 – 7.8 41. עבור osmolality, אנו משתמשים mOsm 290-300 וזה מה יש למדוד בסביבה חוץ-תאי של medaka 42. הטמפרטורה במהלך ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות נבחר לפי הסביבה של הדג. אכן, medaka חי במים עם טמפרטורה רחב טווח (בין 4 ל- 40 ° C), תוך במעבדה שלנו שהם גדלים בסביבה מבוקרת ב 26 – 28 º C. על סמך זה, ביצענו את הקלטות שלנו בטמפרטורת החדר (בסביבות 25 ° C), שונה מכל מה משמש עבור יונקים רקמות (37 ° C) או מים קרים זני דגים כגון בקלה האוקיינוס האטלנטי (12 ° C) 18.

כדי שתוכל לתקן תאים יותרת המוח, חיוני ליצירת פרוסות רקמה בריאה. זה הכרחי להשתמש בכלים נקיים (קופסת הטישיו, מברשת, מלקחיים, וכו ') כי הם רק במגע עם רקמת חיים (ללא כתות ומייצבים). ניתוח מהיר של המוח, יותרת המוח ואת שמירת הרקמה בטמפרטורה נמוכה (4 ° C) תוך כדי לנתח וחלוקת הם גורמי מפתח אחרים כדי לספק מקטעים קיימא. תשומת לב מסוימת צריך להינתן גם הטמפרטורה של agarose על רקמות הטבעה. Agarose חם מדי עלול לגרום נזק לרקמת תוך קר מדי agarose לא אעזוב. אותך זמן להתמצא הרקמה על חלוקתה נאותה. בנוסף, עם פרוסות צריך להיעשות עם הנציבות האירופית פתרון ללא Ca2 + כדי להימנע התאים הפגומים בעקבות חלוקתה להיכנס אפופטוזיס. מבעבעים אינה נחוצה, אבל הפרוסות רקמות צריכים להיאסף מיד לאחר חלוקתה. להשאיר את הפרוסה על 15min בעקבות חלוקתה לתת את התאים לנוח קצת לפני תיקון.

הדגים teleost הם מודלים מצוין לחקור את מאפייני אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח. ואכן, בניגוד יונקים, ציפורים, דגים לא ניחנת קדושתו החציוני, כלומר כי הנוירונים ההיפותלמוס שולט בלוטת יותרת המוח ישירות משקפות את האקסונים שלהם שלהם תאי היעד 32. לפיכך, בפרוסה המוח, יותרת המוח, התאים יותרת המוח נשמרים בסביבה שלם יותר בהשוואה תרביות תאים יותרת המוח העיקרי בו התאים אינם חלופה מועדפת באמצעות טיפולים כימי מכניים. מעניין, באמצעות המוח, יותרת המוח פרוסות של medaka, אנו יכול להבחין כי פוטנציאל הפעולה ירי תדירות בתאים Lh, בעת ההפעלה Gnrh1, גדל (איור 5). תצפיות אלה הם מסכים עם מה שדווח במחקרים תרבות תא יותרת המוח מ שלנו במעבדה 29 המציינת כי באמצעות תרביות תאים יותרת המוח הראשי עדיין רלוונטיות לאפיין את המאפיינים הממברנה של התאים יותרת המוח. עם זאת, פרוסות המוח, יותרת המוח מאפשרים לנו ללמוד גם השפעות עקיפות של תרכובות שונות, כמו גם אינטראקציות בין תאים, כפי שהוא שומר על חיבורים מבניים אשר הולכים לאיבוד במבוך תרביות תאים יותרת המוח הראשי. בנוסף, הכנה פרוסה מהר יותר להכין לעומת תרבות הפומבית התא הראשי, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות יכול להתבצע על 30 דקות הבאות לאחר ניתוח. משמעות הדבר היא כי, בניגוד תרבות התא הראשי, השעון הביולוגי ניתן לטפל באופן משמעותי באמצעות טריות פרוסות.

בגלל גודלו הקטן של תאי יותרת המוח בדגים (קיבול הממברנה סביב 3-10 pF), ותצפיות שלנו מראה כי תאים gonadotrope לאבד את היכולת שלהם אש פוטנציאל פעולה (איור 3), ובכך מאבדות את יכולתן להגיב שחרור הורמונים בעת הקלטת בתצורה של תאים שלמים, החלטנו להשתמש ולהציג את הטכניקה תיקון מחורר בזאת. אכן, זה הוכח שתצורה זו כל תא יכול להוביל פעפוע של מולקולות cytoplasmic חשוב ובכך משנים את מאפייני תא אלקטרופיזיולוגיות 13. להשתמש במקום זאת את תצורות תיקון מחורר עם המפוטריצין כדי לנקב את קרום התא לתוך תיקון הפיפטה עושה חורים קטנים בלבד ומאפשר רק קטן יונים לעבור דרך 15,16,43, 44, שנוכל להימנע זה דילול ולהקליט הפעילות החשמלית של התא במשך זמן ממושך.

נקודה חשובה אחת בטכניקת תיקון מחורר היא חזרה הראשון-מילוי פיפטה IC פתרון ללא תבחיני כדי למנוע שחרור תבחיני לתוך האמצעי ולהזיק כל התאים של המקטע כשהם התקרבו עם פיפטה תיקון. אכן, בגלל הלחץ חיובי המוחל על פיפטה תיקון כשהם התקרבו הרקמה, נוזל דולף באמצעות פיפטה תיקון עד התיקון. זרם זה מסייעת לשמור את הטיפ נקי עד שתגיעו התא יישוב אבל אם פטריות הוא שוחרר המדיום לפני התיקון נעשה, זה יכול לנקב בכל הממברנות של התאים, לשנות באופן דרמטי את מאפייני חדיר של קרום התא ובכך תכונות חשמליות שלהם.

ההליך שהוצגו לו אופטימיזציה עולמים משתמשים בהצלחה ללמוד את הפעילות החשמלית של תאים gonadotrope medaka. בנוסף, ניתן להשתמש בפרוטוקול ללמוד כל סוגי תאים (האנדוקרינית) נמצאו ב בלוטת יותרת המוח של medaka ומינים אחרים של דגים teleost. זכור רק osmolality ו- pH של כל הפתרונות שתישמר לזה של נוזלי הגוף של המין האנושי הנדון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

אנו מודים גב' LourdesCarreon G טאן עזרה שמירה על המתקן medaka, אנתוני Peltier עבור נתוני המחשה. עבודה זו מומן על-ידי NMBU ועל -ידי מועצת המחקר של נורבגיה, המספרים גרנט 244461 (חקלאות ימית תוכנית) ו 248828 (תכנית החיים הדיגיטליים נורבגיה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613 (1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Tags

מדעי המוח גיליון 138 המוח יותרת המוח רקמות-פרוסה אלקטרופיזיולוגיה דגים תיקון-קלאמפ תאים אנדוקריני
פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter