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Neuroscience

Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Der Artikel beschreibt eine optimierte Protokoll für machen lebensfähigen Gehirn-Hypophysen Gewebe Scheiben schneiden, mit den teleost Fische Medaka (Oryzias Latipes), gefolgt von elektrophysiologischen Aufzeichnungen von Hypophysen Zellen mithilfe der Patch-Clamp-Technik mit der perforierten Patch Konfiguration.

Abstract

Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen wurden in zahlreichen Wirbeltierarten, aber nur sehr wenige in den teleost Fischen durchgeführt. Unter diesen sind die klare Mehrheit an dissoziierten Primärzellen durchgeführt worden. Um zu einem besseren Verständnis der wie teleost Hypophysen Zellen, in einem mehr biologisch relevante Umfeld Verhalten, veranschaulicht dieses Protokolls lebensfähige Gehirn-Hypophysen-Scheiben mit kleinen Süßwasserfische Medaka (Oryzias Latipes) vorzubereiten. Machen die Gehirn-Hypophysen-Scheiben, wurden pH-Wert und Osmolalität aller Lösungen auf Werte in Körperflüssigkeiten von Süßwasserfischen Leben bei 25 bis 28 ° c eingestellt Nach Vorbereitung der Scheibe veranschaulicht das Protokoll führen elektrophysiologische Aufnahmen mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik. Die Patch-Clamp-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit noch nie da gewesenen zeitlicher Auflösung und Empfindlichkeit, so dass die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von intakten ganze Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Perforierten Patch ist einzigartig, da es hält die intrazelluläre Umwelt intakt zu verhindern, dass sich regulatorische Elemente in das Zytosol durch die Patch-Pipette-Elektrode-Lösung verdünnt wird. Im Gegensatz dazu wurde bei der gesamten Zelle Bauform es beobachtet, dass Medaka Hypophysen Zellen schnell ihre Fähigkeit verlieren, Aktionspotentiale abzufeuern. Unter den verschiedenen Perforation-Techniken veranschaulicht dieses Protokoll zu Perforation der gepatchten Membran mit Fungizid Amphotericin b.

Introduction

Die Hypophyse ist ein wichtiger endokrine Organ bei Wirbeltieren unterhalb des Hypothalamus und posterior, die Optik Chiasmus. Es produziert und sondert sechs bis acht Hormone aus der spezifischen Zelltypen. Hypophyse Hormone bilden ein Zwischenprodukt zwischen Gehirn und periphere Organe und fahren zahlreiche essentielle physiologische Prozesse einschließlich Wachstum, Fortpflanzung und Regelung der Homöostase. Ähnlich wie bei Neuronen, endokrinen Zellen der Hypophyse sind elektrisch erregbare mit der Fähigkeit, spontan Aktionspotentiale abzufeuern 1. Die Rolle der diese Aktionspotentiale ist Zelle angewiesen. In verschiedenen Zelltypen der Säugetier-Hypophyse können Aktionspotentiale der intrazellulären Ca2 + ausreichend für ein verzögerter Freisetzung des Hormons 2erheben. Darüber hinaus erhält die Hypophyse stimulierende und hemmende Informationen aus dem Gehirn, das das Membrane Potential der Zellen 3,4,5,6betrifft. In der Regel stimulierende Eingang erhöht die Erregbarkeit und oft beinhaltet die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären speichern sowie erhöhte Frequenz 7feuern. Verstehen, wie die Zelle nutzt die Ionen-Kanal-Komposition und passt sich diese Signale aus dem Gehirn ist Schlüssel zum Verständnis der hormonsynthese und Freigabe.

Die Patch-Clamp-Technik wurde in den späten 1970er Jahren von Sakmann und Neher 8,9,10 entwickelt und weiter verbessert, indem Hamill 11, und ermöglicht detaillierte Untersuchungen der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Darüber hinaus kann die Technik verwendet werden, für das Studium von Strom und Spannung. Patch-Klemmung ist heute der Goldstandard für die Messung von elektrophysiologischer Eigenschaften der Zelle. Vier wichtige Konfigurationen von dicht-Patch-Clamp-Technik wurden entwickelten 11; der Zelle angebracht, Inside-Out, die außen-Out und die gesamte Zelle Patch. Die drei ersten Konfigurationen sind in der Regel für einzelne Ionen-Kanal Untersuchungen verwendet. Für die vierte, von der Zelle-attached Konfiguration wird ein Loch in der Zellmembran mit Sub-atmosphärischen Druck hergestellt. Diese Konfiguration ermöglicht auch Untersuchungen der Ionen-Kanal Zusammensetzung der ganzen Zelle 12. Eine Einschränkung dieser Technik ist jedoch, dass zytoplasmatischen Moleküle durch den Patch Pipette Lösung 13 (Abb. 1A), was sich auf die elektrische und physiologischen Reaktionen der untersuchten Zellen verdünnt werden. In der Tat können einige von diesen Molekülen eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion des Signals oder bei der Regulierung der verschiedenen Ionenkanäle spielen. Um dies zu vermeiden, Lindau und Fernandez 14 eine Methode entwickelt, wo eine Pore-forming Verbindung zu den Patch-Pipette hinzugefügt. Im Anschluss an die Zelle-attached Konfiguration wird die Verbindung in der Plasmamembran unter den Patch integrieren und langsam Perforieren die Membran Erstellung elektrischen Kontakt mit dem Zytosol (Abbildung 1B). Mehrere verschiedene Antimykotika wie Nystatin 15 und Amphotericin B 16oder Tenside wie Saponin Beta-Aescin 17,18 können verwendet werden. Diese Verbindungen erstellen Poren groß genug, um monovalente kationen und Cl– Diffusion zwischen dem Cytosol und die Patch-Pipette unter Beibehaltung der cytosolischen Ebenen von Makromolekülen und größeren Ionen wie Ca2 + 15zu ermöglichen, 16.

Die Herausforderung der Verwendung von perforierten Patch ist der potenziell hohen Reihenwiderstand. Vorwiderstand (R-s) oder Zugang Widerstand ist der Gesamtwiderstand über die Patch-Pipette im Verhältnis zum Boden. Während Patch-Clamp-Aufnahmen, die R-s werden parallel mit Membran-Widerstand (Rm). Rm und Rs in Parallele Arbeit als Spannungsteiler. Mit dem hohen R-s, fällt die Spannung über die R-s geben Fehler in den Aufnahmen. Der Fehler wird mit größeren Strömungen erfasst größer geworden. Darüber hinaus ist der Spannungsteiler auch frequenzabhängig einen Tiefpass-Filter, was sich auf die zeitliche Auflösung zu schaffen. In der Tat kann der perforierten Patch nicht immer zulassen Aufnahmen von großen und schnellen Strömungen wie die Spannung Na+ Strömungen Gated (für detaillierte Messwerte Referenz 19 Siehe) Rs kann auch während der Patch-Clamp-Aufnahmen, wieder führt zu Veränderungen in den aufgenommenen Strom variieren. So können Fehlalarme in Situationen auftreten wo Rs während der Zulassungsantrag ändert.

Die Elektrophysiologie auf das geschnittene Gewebe wurde erstmals von Andersen-Lab, elektrophysiologische Eigenschaften der Nervenzellen im Gehirn 20zu studieren. Die Technik ebnete den Weg für detaillierte Untersuchungen der Einzelzellen sowie Zellezelle Kommunikation und Zelle Schaltungen in einem mehr intakten Umwelt. Eine ähnliche Technik für die Herstellung von Hypophyse Scheiben wurde von Guérineau Et Al. 1998 eingeführt. 21. es war jedoch nicht vor 2005 wurde dieser Gehirn-Hypophysen Slice-Vorbereitung für Patch-Clamp-Studien in teleost 22erfolgreich eingesetzt. In dieser Studie berichteten die Autoren auch die Verwendung von perforierten Patch-Clamp-Aufnahmen. Allerdings wurden bei weitem die meisten elektrophysiologischen Untersuchungen der Hypophysen Zellen bei Säugetieren, und nur eine Handvoll anderer Wirbeltiere, einschließlich teleost Fische 1,2,22,23 durchgeführt . Im umkonstruiert wurden fast alle Studien am primären dissoziierten Zellen 24,25,26,27,28,29,30 durchgeführt. .

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Zubereitung von gesunden Gehirn-Hypophysen-Scheiben aus dem Modell Fisch Medaka. Der Ansatz stellt mehrere Vorteile im Vergleich zu primären dissoziierten Zellkulturen. Zuerst werden die Zellen in einer relativ geschützten Umgebung im Vergleich zu Zelle Kulturbedingungen getrennt erfasst. Zweitens erlauben Slice Vorbereitungen uns indirekte Wege vermittelt durch Zell-Zell-Kommunikation- 22, das ist nicht möglich in dissoziierten Zelle Kulturbedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus führen wir elektrophysiologische Aufnahmen auf die erhaltenen Gewebe-Scheiben mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik mit Amphotericin B als die porenbildner durchzuführen.

Medaka ist eine kleine Süßwasserfische aus Asien, vor allem in Japan gefunden. Physiologie, Embryologie und Genetik von Medaka wurden für mehr als 100 Jahren 31ausgiebig untersucht, und es ist eine häufig verwendete Forschungsmodell in vielen Laboratorien. Für dieses Papier von besonderer Bedeutung ist die deutliche morphologische Organisation der Hypothalamus-Hypophysen-Komplex in teleost Fische: während in Säugetiere und Vögel der Hypothalamus Neuronen ihre Neuro-Hormone regulieren Hypophyse endokrine Zellen freigeben in das Portal die mediane Eminenz ist eine direkte nervöse Projektion des Hypothalamus Neuronen auf die endokrinen Zellen der Hypophyse in teleost Fische 32. Deshalb sorgfältig durchgeführte Gehirn-Hypophysen Schneiden von besonderer Bedeutung in Fisch, ermöglicht es uns, elektrophysiologische Eigenschaften der Hypophysen Zellen in einem gut erhaltenen Gehirn-Hypophysen-Netzwerk und insbesondere wie Hypophysen Zellen untersuchen Steuern Sie ihre Erregbarkeit und damit Ca2 + Homöostase.

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Protocol

Alle Tier Handhabung wurde entsprechend den Empfehlungen für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere an der Norwegian University Life Sciences und unter der Aufsicht der autorisierte Ermittler durchgeführt.

1. Vorbereitung der Instrumente und Lösungen

Hinweis: Alle Lösungen sollten steril sein. Sorgfältige Augenmerk auf den pH-Wert und die Osmolalität (Osmol/kg Wasser) aller Lösungen, die sorgfältig die extrazellulären Umwelt der untersuchten Arten angepasst werden sollte. pH-Wert und Osmolalität sollte mit präzisen elektronischen Geräten wie pH-Meter und Gefrierpunkt XR angepasst werden.

  1. 500 mL der extrazellulären Lösung ohne Ca2 + zu machen (Ca2 + gratis EG): 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
    1. Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreinen 61,89 mg (0,055 uS / cm bei 25 ° C, der Widerstand von 18,2 MOhm) H2O in ein Becherglas mit einem magnetischen Rührer.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.
    3. Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.
    4. Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.
  2. 500 mL der extrazellulären Lösung (EG) zu machen: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
    1. Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.
    3. Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.
    4. Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.
  3. 500 mL der extrazellulären Lösung mit 0,1 % Rinderserumalbumin (EG mit BSA) zu machen: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
    1. Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.
    3. Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.
    4. Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter. Fügen Sie 50 mg BSA.
  4. 250 mL der intrazellulären Lösung (IC) zu machen: 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM Saccharose.
    1. Lösen Sie 1,54 g KOH, KCl 327,75 mg, 595,75 mg HEPES und 1,712 g Saccharose in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2 mit (N-Morpholino) Ethan Sulfo (MES) Säure.
    3. Übertragen Sie die Lösung in einem 250 mL volumetrischen Kolben. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 250 mL.
    4. Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 280 – 290 mOsm (niedriger als EG 10 mOsm) mit Saccharose. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.
  5. Machen Sie 100 mL 2 % niedrig schmelzende Agarose-Lösung in Ca2 + und BSA frei EG (2 g niedrig schmelzende Agarose in 100 mL Ca2 + gratis EG). Lösen Sie mit Hilfe einer Mikrowelle auf und legen Sie die geschmolzene Agarose in einem Wasserbad bei 40 ° C. Lassen Sie sie abkühlen, bis 40 ° C vor dem Gebrauch auf das Gewebe erreicht.
    Hinweis: EG, Ca2 + kostenlose EG bei 4 ° C für mehrere Wochen, wenn steril und IC-Lösungen bei-20 ° C, für mehrere Monate gelagert werden kann. Agarose pro Woche bei 4 ° C gelagert werden und durch kurz Mikrowelle 3 – 5 Mal wiederverwendet werden kann. Übermäßige Wiederverwendung führt zur Verdunstung und Veränderung der Agarose und Salzkonzentration und Qualität.
  6. Agar-Brücke zu machen:
    1. Erhitzen Sie 7,5 mm lange Borosilikatglas Kapillaren mit Außendurchmesser (Außendurchmesser) 2 mm und Innendurchmesser (ID) 1,16 mm mit dem Bunsenbrenner auf einen fokalen Punkt ca. 1/3 von einem Ende bis das Glas beginnt zu beugen. Entfernen Sie das Glas von der Flamme und lassen Sie das Glas mit einem Winkel von etwa 120 Grad (Abb. 2A) beugen.
    2. Schmelzen Sie 2 % Agar in normalen EG ohne Glukose mit Hilfe einer Mikrowelle, und während die Agarose Flüssigkeit zu füllen ist das vorgefertigte Glas-Kapillare mit Kapillarität zwingt, indem eines der Enden des Glases in die Flüssigkeit und warten einige Minuten. Brücken bis zur Verwendung bei 4 ° C im EG ohne Glukose zu speichern.
  7. Bereiten Sie Borosilikatglas mit Glühfaden Patch Pipetten mit einem geeigneten Pipette Abzieher vor. Finden Sie die Pipette Puller Handbuch der gewünschten elektrodenwiderstand zu erhalten.
    Hinweis: Die Verjüngung der Pipette sollte so kurz wie möglich sein. Kurze Pipette Kegel wird mit 4 – 6 ziehende Schritte erreicht. Der elektrodenwiderstand sollte zwischen 2 und 6 MΩ je nach Größe der Zellen.
  8. Zur Vermeidung von Bewegung des Gewebes während der Patch-Clamp-Experimenten Mantel der Oberfläche der Aufnahme Kammer mit 0,1 % der Polyethylenimine (PEI) in Borat-Puffer.
    1. Bereiten Sie 500 mL Borat Puffer (25 mM):
      1. Lösen Sie 4,768 g Na2B4O710 H2O in 450 mL von hochreinen H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.
      2. PH-Wert auf 8,4 mit HCl anpassen.
      3. Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL und 0,2 µm-Filter die Lösung mit Wasser Vakuumsystem sterilisieren.
    2. Endnutzung eine 1 %-Stammlösung von PEI (1 mL 50 % PEI auf 49 mL 25 mM Borat Puffer) und eine 0,1 % PEI Verdünnung durch Verdünnung 10 µL der Stammlösung 1 % in 100 µL Puffer Borat vorbereiten.
    3. 2 mL 0,1 % PEI auf dem Glas des Inhabers Scheibe und lassen Sie die Beschichtung für 1 Minute inkubieren. Dann kurz waschen Sie das Glas zweimal mit 5 mL des hochreinen H2O und lassen Sie Luft bis zum Gebrauch trocknen.
  9. Amphotericin B Lösungen vorzubereiten.
    1. Machen Sie 60 mg/mL Stammlösung durch Auflösen von 3 mg Amphotericin B Pulver in 50 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer 1-mL-Tube vor Licht geschützt werden. Strudel mit der maximalen Geschwindigkeit für 30 s und für 15 min zum Homogenisieren beschallen. Speichern Sie Aliquote in 3 – 5 Röhrchen bei-20 ° C und verwenden Sie einer Teilprobe pro Tag.
      Hinweis: Wenn Vorratslösung Amphotericin B nicht klar und gelb ist Farbe, sondern milchig (noch gelb) nach 15 – 20 min. Beschallung stellen eine neue Stammlösung.
    2. Machen Sie IC-Lösung mit Amphotericin B durch pipettieren 2 mL des IC in ein sauberes Glasgefäß mit mehr als 10 mL Fassungsvermögen. 8 µL der Stammlösung Amphotericin B in die Pipette Lösung und Mischen von pipettieren. Wickeln Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie und Platz auf dem Eis bis zur Verwendung und erneuern Sie alle 3 h.

2. Präparation und Schneiden mit Vibratome

  1. Bereiten Sie die Dissektion Werkzeuge vor sezieren, darunter eine scharfe und eine starke Zange mit einer Schere. Reinigen Sie die Werkzeuge (Gewebe-Halter, Bürste, Zange) mit Ethanol und stellen Sie sicher, dass sie nur zu Zwecken der Dissektion und nie in Kontakt mit festen Gewebe verwendet werden. Halten sie in einem separaten Feld zur Vermeidung von Kontaminationen.
  2. Den Fisch in kaltem Eiswasser für 1 min einschläfern.
  3. Befolgen Sie die nachfolgenden Schritte aus, um schnell die Medaka Gehirn und Hypophyse mit scharfen Zangen zergliedern (verwenden Sie nicht mehr als 3 min).
    1. Halten die Fische mit der starken Zange schwere die beiden Sehnerven hinter den Augen mit einer Schere oder Pinzette scharf.
    2. Öffnen Sie die dorsalen Teil des Schädels aus der hinteren an der vorderen Seite durch Brechen der Schädelknochen Schritt für Schritt mit starker Zange.
    3. Der Schädel auf der einen Seite mit starker Zange abziehen.
    4. Schwere des Rückenmarks mit einer Schere oder scharfen Zange.
    5. Sanft, das Rückenmark mit der Zange greifen, das Gehirn vom hinteren zum vorderen flip und legen Sie sie in eine Schüssel mit eiskaltem Ca2 + Kostenlose ec
  4. Füllen Sie eine 1,5 – 2 cm3 Metallform mit flüssige Agarose und legen Sie es auf dem Eis.
  5. Kurz bevor die Agarose (bei ca. 25 – 30 ° C) erstarrt, sanft greifen Sie das Gehirn durch das Rückenmark mit der Zange, trocknen Sie die Zange mit einem Stück feines Papier und legen Sie das Gewebe in der Agarose. Mischen Sie schnell die Agarose um die Spuren der EG Links rund um das Gewebe zu verdünnen und das Gewebe zu orientieren und lassen die Form auf dem Eis für ein paar Sekunden bis die Agarose härtet.
    Anmerkung: Es ist wichtig für diesen Schritt schnell sein. Die Agarose erstarrt schnell wie die Metallform durch das Eis abgekühlt ist.
  6. Schneiden Sie ein Quadrat von Agarose, enthält das Gewebe mit einer Skalpellklinge und Vibratome Probenhalter mit Chirurgie (ungiftig) Kleber aufkleben.
  7. Füllen Sie die Küvette der Vibratome erhalten (Gehirn-Hypophyse) Probenhalter mit eiskalten Ca2 + kostenlose EG.
  8. Probenhalter in der Vibratome und schneiden Sie die Agarose-Block um parasagittalen Abschnitte von 150 µm, mit hoher Frequenz und niedriger Drehzahl für den Schnitt zu machen. Sammeln Sie die ausgewählten Abschnitte zu und legen Sie sie in die Patch-Clamp-Aufnahme-Kammer mit 3 mL eiskaltes Ca2 + kostenlose EG
  9. Legen Sie die Raster-Harfe (Abbildung 2B) auf dem Gewebe.
    Hinweis: Die Harfe wird zusammen mit der Beschichtung stabilisieren das Gewebe und verhindern, dass es während der Patch-Clamp-Aufnahmen bewegt.
  10. Nachdem die Harfe vorhanden ist, ändern Sie die Ca2 + freie EG Mitte in der normalen EG mit Ca2 + und BSA. Lassen Sie die Gewebe 10 min ruhen.

(3) perforiert, Patch-Clamp und elektrophysiologische Aufnahmen

  1. Vor Beginn des Experiments, Chlorid Silber Draht Elektroden mit den folgenden Schritten: zunächst ein feines Schleifpapier (p180) verwenden, um die Silberdraht-Elektroden reinigen. Zweitens mit 2 mL 70 % igem Ethanol spülen. Drittens: Tauchen Sie die Drähte in 2 mL, 2 – 5 % Chlor für 10 min. Zu guter Letzt spülen Sie mit 2 mL, hochreine H2O.
  2. Legen Sie die Aufnahme Kammer mit der Gehirn-Hypophysen-Scheibe in den Mikroskoptisch und suchen Sie den Zielbereich (Hypophyse) mit 10 X-Objektiv und Inspizieren Sie die Zellen mit 40 X Objektiv.
    Hinweis: Wenn die Vorbereitung erfolgreich ist, sollte sehr wenige Rundzellen sichtbar sein. Diese Runde Zellen sind in der Regel beschädigte Zellen, die aus dem Gewebe lösen werden.
  3. Legen Sie die Erdung Elektrode durch die 2 % Agar-Brücke in das EG-Bad.
  4. Suchen Sie eine gesunde Zelle mit 40 X Objektiv.
    Hinweis: Eine gesunde Zelle sollte fest an das Gewebe Slice und nicht aufgerundet und losgelöst von der Scheibe.
  5. Einstellen des Verstärkers in Voltage-Clamp (VC; Abbildung 4A Nummer 1) Modus. Offenen testen die Dichtung Fenster und drücken Sie das Bad Konfiguration (Abbildung 4 b Punkt 1 und 2. Nutzen Sie ein 5-mV Pulse Pipette Widerstand (Abbildung 4 b Ziffer 3) zu überwachen.
  6. Abgleich der Patch PIPETTENSPITZE mit Antimykotika kostenlose IC-Lösung vor dem Hinzufügen der IC-Lösung mit Amphotericin B mit einer Mikro-Füller-Spritze (siehe Abbildung 3).
  7. Fügen Sie einen leicht positiver Luftdruck in der Patch-Pipette mit 1 mL Spritze.
    Hinweis: Dadurch wird eine kleine Flüssigkeitsstrom aus der Patch-Pipette, die Vermeidung von Kontaminationen der Spitze.
  8. Einmal in der Badewanne, bewerten Sie den Patch Pipette Widerstand zu und stellen Sie sicher, dass keine Partikel an der Spitze der Pipette (Abbildung 4) verbunden sind.
    Hinweis: Ein kleines Stück Klebeband ist auf den Monitor Anzeige der video-Aufnahme-Form das Sichtfeld angebracht. Dies macht die Positionierung der Patch Pipette relativ Zelle einfacher wenn das Ziel nicht auf die Zelle richtet.
  9. Führen Sie die Patch-Pipette auf die Zelle mit Mikromanipulatoren.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Pipette ist sauber von der Suche nach kleinen Teilchen, die an der Spitze der Pipette angebracht haben können. Plötzliche Änderungen im Widerstand möglicherweise auch eine Folge der Partikel in der Pipettenspitze stecken.
  10. Passen Sie die Pipette, wenn wenige Mikrometer über der Zelle damit die Spitze der Pipette die Zelle 1/3 von der Mitte der Zelle, berühren wird, wie in Abbildung 5dargestellt. Wenn die Zelle berühren, lassen Sie den Druck und gelten Sie die sanfte Saugwirkung um eine Dichtung zu machen.
    Hinweis: Die Zeit aus der Patch-Pipette betritt das Bad zu einem erfolgreichen Dichtung sollte so kurz wie möglich gehalten werden. Nicht mehr als 1 – 1,5 min zur Vermeidung von Amphotericin B erreichen die Spitze der Pipette und Leck in die Wanne.
  11. Sofort wechseln Sie zum Fenster " Patch " in der Patch-Clamp-Software (Abbildung 4 D Punkt 1) und haben Sie eine Holding Potential zwischen-50 und-60 mV (Abbildung 4 Punkt 2). NULL heraus aus der Glaspipette (Abbildung 4 Punkt 3) die schnelle Kapazität zusammensetzt.
  12. Wechseln Sie in die Zelle -Fenster in Patch-Clamp-Software (Abbildung 4E Punkt 1 und 2) und starten Sie die Überwachung Zugang Widerstand, Ra, erscheint im Fenster. NULL, die Kapazität der Membran in der Verstärker-Software (Abbildung 4E Punkt 3) nach ausreichender Zugang.
    Hinweis: Ausreichender Zugang dauert 10 bis 30 min (Abbildung 4E Punkt 2). Ein guter Zugang zur aktuellen Klemme Aufnahmen sollte unter 20 M liegen.
  13. Wechseln Sie zur zangenstromwandler, IC, in Verstärker Software-Fenster (Abbildung 4F Punkt 1). Passen Sie die schnell-kapazitive Ströme im Fenster Klemme der Verstärker Software (Abbildung 4F Punkt 2 und 3) auf den gleichen Wert wie in 3.12. Überprüfen Sie die Membran Potenzial (Abbildung 4F Punkt 1).
    Hinweis: Wichtig ist, wenn das Membranpotential seicht ist (typische über-35 mV) die Zelle beschädigt werden. Die Aufnahme abbrechen und eine neue Zelle zu finden.
  14. Nach der Suche nach einer gesunden Zelle (fest des Gewebes mit Membranpotential unter-40 mV), beginnen die experimentelle Aufnahmen wie in des Herstellers Protokoll 33,34.

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Representative Results

Dieses Protokoll zeigt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll wie zuverlässige elektrophysiologische Aufnahmen aus Zellen der Hypophyse (Gonadotrope), mit einer Medaka transgene Linie [Tg (Lhb- HrGfpII)], wo Zellen das Ziel (Gonadotropine Lh-Produktion) mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) beschriftet sind.

Zunächst wurden die elektrophysiologischen Untersuchungen mit ganz-Zell Konfiguration durchgeführt. Jedoch wurden spontan Aktionspotentiale in keiner der untersuchten Zellen nicht beobachtet. In einer Teilmenge von Zellen könnte Aktionspotentiale ausgelöst werden, mit kleinen aktuellen Injektionen (5-9 pA) von einem Ruhepotential zwischen-50 und-60 mV (Abbildung 6). Diese Aktionspotentiale hatte einen schnellen Überblick, und nach ca. 4 – 6 min. ausgelöste Aktionspotentiale waren nicht mehr möglich. Die besonders schnelle Verminderung beobachtet kann durch die Größe der kleinen Zellen erklärt. Hypophyse Zellen sind im Allgemeinen kleiner als Neuronen 30. Zum Beispiel durchschnittliche Kapazität der Membran Gonadotrope Zellen liegt zwischen 4 und 10 pF 3,30,35. Ähnlich wie diese Erkenntnisse Medaka Gonadotrope Zellen hatten eine durchschnittliche Membran-Kapazität (Mittelwert ± S.D) 3,4 ± 0,9 PF (n = 67).

Umstellung auf die perforierten Patch-Konfiguration mit Amphotericin B, spontan Aktionspotentiale in etwa 50 % der aufgenommenen Zellen beobachtet wurden (Abb. 7A, n = 63 Zellen von Tieren, 21). Darüber hinaus können Aktionspotentiale in 95 % dieser Zellen mit keine sichtbare Verschraubung auch nach längerer Aufnahmen (bis zu 1 h) ausgelöst werden. Wichtig ist, um zuverlässige und qualitativ hochwertige Aufnahmen zu erreichen, ist es notwendig, zuerst die Spitze mit Antimykotika-freien IC-Lösung gefüllt. Wenn kleine Mengen von Antimykotika die PIPETTENSPITZE fliehen vor den Gigaseal, kann es die Zielzelle als auch umgebenden Zellen beschädigen.

Um zu testen, wenn Zellen in der perforierten Patch-Konfiguration auf ihre wichtigsten releasing Hormon reagieren können, haben wir 1 µM Gnrh1 Blätterteig ausgeworfen auf die Zielzellen angewandt. Die Experimente wurden durchgeführt in der Stromzange, um Änderungen in der Spannung überwachen können. Diese Experimente zeigten eine biphasische Reaktion (Abb. 7B). Die erste Phase ist eine Hyperpolarisation, wo die Freisetzung von Ca2 + aus interne Speicher aktivieren Ca2 + aktiviert K+ Kanäle verursachen die Hyperpolarisation. Die erste Phase eine Depolarisation und erhöhte Aktionspotential-Frequenz von 1 – 2 Hz bis ca. 3 Hz folgt. In einigen der Aufnahmen hatte in der zweite Phase Pseudo Plateau Potenziale wo 2 oder 3 kleine Spikes vor Repolarisation beobachtet wurden.

Figure 1
Abbildung 1 : Unterschied zwischen der gesamten Zelle (A) und die perforierten Patch (B) Konfigurationen der Patch-Clamp-Technik. In der ganz-Zell Konfiguration (A) nach Gigaseal vorhanden, ist ein Loch in der Membran erfolgt durch die Anwendung eines kleinen Unterdrucks in der Patch-Pipette. In dieser Konfiguration können wichtige intrazelluläre Moleküle wie Signalmoleküle in die Patch-Pipette-Lösung, was sich auf die elektrische und physiologischen Reaktionen der Zelle verdünnt werden. Dieses Phänomen ist in kleine Zellen, wie z. B. Hypophysen Zellen sogar noch wichtiger. Im Gegensatz dazu in perforierten Patch-Konfiguration (B), nach Gigaseal, elektrischer Kontakt zwischen der Zellflüssigkeit und den Patch Pipette Antimykotika oder Tensiden besteht aus. Die Antimykotika oder Tensid wird vor dem Patchen in der Patch-Pipette geladen und werden in der Plasmamembran unter den Patch, damit langsam Perforation der Membran, so dass nur kleine Moleküle wie einwertige Ionen passieren einfließen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Bilder von der Agar-Brücke (A) und die Harfe (B) in das Protokoll verwendet. Skala in mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Der Patch-Pipette füllen. Antimykotische (A) kostenlose IC-Lösung (blaue Flüssigkeit) ist hinterfüllt durch Kapillarkräfte durch das Filament innerhalb der Pipette. (B) nach der Pipettenspitze mit Antimykotika frei IC, der hintere Teil der Pipette füllen mit IC-Lösung mit Amphotericin B (gelbe Flüssigkeit) mit Hilfe einer Spritzennadel (Mikro-Füller) gefüllt ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4A
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Figure 4B
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Figure 4C
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Figure 4D
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Figure 4E
Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 4F
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Abbildung 4 : Software Screenshots. (A) zeigt Verstärker Softwarefenster. (1) (rotem Kreis) Modus hebt den Bereich hervor, die ermöglicht das Wechseln zwischen Spannung Klemme (VC), Stromzange ohne jede Stromeinspeisung (ich = 0) und Stromzange mit Möglichkeit für aktuelle Injektionen (IC). 2 hebt den Bereich für die Anpassung schnell kapazitiven Strom in Spannung Klemme sowie ganze Zelle kapazitive aktuelle Anpassungen (rotem Kreis) hervor. (B) zeigt die Patch-Clamp-Software mit dem Membran-Testfenster geöffnet. 1. betont (rotem Kreis) die Membran-Test-Taste. 2. betont (rotem Kreis) der verschiedenen Puls Konfigurationen, Bad, Patch und Zelle. 3. betont (rotem Kreis), Puls Konfiguration Amplitude und Frequenz. (C-F) zeigt eine kombinierte Witwe der Patch-Clamp-Software (links) und Verstärker (rechts) Software. (C) unterstreicht (rotem Kreis) den Widerstand, wenn die Pipette in der Badewanne und ordnungsgemäße Erdung mit Agar-Brücke (im Bad-Modus) ist. (D) 1. Highlights (rotem Kreis) die Umstellung auf die folgenden Gigaseal Patch-Modus. (2) Highlights (roter Kreis) Puls-Konfiguration (10 mV Puls) und Holding Potenzial-60 angepasst mV. 3. betont (rotem Kreis) das Fenster für die Korrektur oder Einschießen der schnell-kapazitive Ströme nach ein Giga-Siegel. (E) 1. Highlights (rotem Kreis) den Zellenmodus zur Überwachung Zugang Widerstand verwendet. 2 Highlights (roter Kreis) versiegeln die zellenparameter, Membran-Kapazität (Cm), Qualität (Rm), Zugang Widerstand (Ra), die Zeitkonstante (Tau) und Strom (Hold) halten. 3. betont (rotem Kreis), die Taste für die Korrektur der Membran kapazitive Ströme. (F) 1. Highlights (rotem Kreis) den IC-Modus für die Überwachung des Membranpotentials. 2. betont (rotem Kreis) die Taste, um zur aktuellen Klemme Anpassungen (I-Klemme) wechseln. 3. betont (rotem Kreis) das Fenster für die schnell-kapazitive Ströme zu korrigieren.

Figure 5
Abbildung 5 : Schliffbild von einem Patch-Clamp Aufnahme auf einer hypophysären Zelle mithilfe der perforierten Patch Konfiguration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Aktuelle Klemme Aufnahmen aus einer GFP-mit der Bezeichnung Lh-produzierenden Zelle folgt aktuellen Injektionen mit normalen ganz-Zell Konfiguration. Die Zellen wurden zwischen-50 und-60 mV gehalten. Typische Aktionspotentiale könnte in einer Teilmenge von Zellen mit 5 – 10 pA aktuellen Injektionen unmittelbar nach einen Zugang zu der Zelle (schwarze Spur) ausgelöst werden. Nach 1 – 3 min begann die Amplitude des Aktionspotentials zu verringern, ein typischen Zeichen der Verschraubung (Cyan Spur). Nach 4 – 6 min. verschwunden die Amplitude des Aktionspotentials fast vollständig (Magenta Spur). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Stromzange Aufnahme aus einer GLP-mit der Bezeichnung Lh-produzierenden Zelle mithilfe der perforierten Patch-Konfiguration nach Stimulation mit Gonadotropinen – Releasing Hormon Gnrh1. (A) aktuelle Klemme Aufnahme spontan Aktionspotentiale aus einer Lh produzierenden Gonadotrope Zelle zeigen. (B) ein biphasische Reaktion wo Gnrh1 Stimulation für 10 s zuerst induziert eine Hyperpolarisation der Zellmembran, gefolgt von einer Depolarisation und erhöhte Frequenz (von 1 – 2 Hz bis 3 Hz) Feuern von Aktionspotentialen in eine Zelle, die zuvor gefeuert spontane Aktionspotentiale. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Elektrophysiologische Aufnahmen mit der Patch-Clamp-Technik auf Gehirn-Hypophysen Scheiben benötigen sorgfältige Optimierung. Gut optimierte Protokolle für Leben-Zelle Untersuchungen insbesondere umkonstruiert beschränken sich die meisten Publikationen mit Protokollen auf Basis von Säugetier-Systemen. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Tatsache, dass mehrere physiologische Parameter wie pH-Wert und Osmolalität kennen nicht nur Arten angewiesen, aber auch sehr stark abhängig ob der betreffende Organismus lebt auf dem Land oder im Wasser. Für Fische ist es auch notwendig, zu berücksichtigen, wenn sie in einer marine oder Süßwasser leben. Beispielsweise ist der CO2 -Partialdruck in Fische im Vergleich zu Säugetieren mit Ebenen, von 1,7 – 3.4 MmHg pCO2 in Fisch und 40 – 46 MmHg pCO2 Säugetiere 36viel niedriger. Auf dieser Basis passen wir den pH-Wert auf 7,75 37,38,39,40 in allen Lösungen in das aktuelle Protokoll verwendet. Wir verwenden auch HEPES-Puffer, wie sich gezeigt hat, besitzen hervorragende Pufferung Kapazitäten im Großraum pH-Wert von 7,4-7,8 41. Wir verwenden für die Osmolalität 290 – 300 mOsm, das ist, was in der extrazellulären Umgebung von Medaka 42gemessen wurde. Die Temperatur während der elektrophysiologischen Aufnahmen verwendet wurde entsprechend der Umwelt des Fisches ausgewählt. In der Tat lebt Medaka in Gewässern mit einem weiten Temperaturbereich (von 4 bis 40 ° C), während in unserem Labor, die sie in einer kontrollierten Umgebung bei 26 – 28 ° c angehoben werden Auf dieser Basis haben wir unsere Aufnahmen bei Raumtemperatur (ca. 25 ° C), anders als für Säugetier-Gewebe (37 ° C) oder kaltem Wasser Fischarten wie Kabeljau (12 ° C) 18 Verwendungszweckdurchgeführt.

Um Hypophysen Zellen Patchen zu können, ist es wichtig, gesundes Gewebe Scheiben zu generieren. Es ist zwingend notwendig, um saubere Werkzeuge (Gewebe-Halter, Pinsel, Pinzetten usw.) zu verwenden, die nur im Kontakt mit lebender Gewebe (ohne Fixiermittel) sind. Eine schnelle Dissektion des Gehirns und Hypophyse und halten das Gewebe bei niedrigen Temperaturen (4 ° C) beim sezieren und Schneiden sind andere Schlüsselfaktoren, um praktikable Abschnitten. Besondere Aufmerksamkeit sollte auch auf die Temperatur von der Agarose auf Gewebe einbetten. Zu warm Agarose kann das Gewebe beschädigen, während zu kalt Agarose Sie nicht lassen Zeit, das Gewebe für den richtigen Schnitt zu orientieren. Darüber hinaus schneiden sollte erfolgen mit EG-Lösung ohne Ca2 + , die geschädigten Zellen zu vermeiden folgen schneiden um Apoptose eingehen. Sprudeln ist nicht notwendig, aber die Gewebe-Scheiben sollte sofort nach dem Schnitt gesammelt werden. Lassen Sie die Scheibe ca. 15 min nach schneiden um die Zellen vor dem Patchen ein wenig ausruhen zu lassen.

Teleost Fische sind hervorragende Modelle, elektrophysiologische Eigenschaften von Hypophysen Zellen zu untersuchen. In der Tat anders als Säugetiere und Vögel besitzen Fische keine mediane Eminenz, was bedeutet, dass der Hypothalamus Neuronen, die Steuerung der Hypophyse direkt auf ihre Ziel-Zellen 32ihre Axone projizieren. So eine Gehirn-Hypophysen-Scheibe die Hypophysen Zellen sind in einem mehr intakten Umwelt im Vergleich zu primären Hypophyse Zellkulturen gepflegt wo die Zellen getrennt sind mit chemischen und mechanischen Behandlungen. Mit Gehirn-Hypophysen-Scheiben von Medaka, konnten wir interessanterweise beobachten, dass das Aktionspotential feuern Frequenz in Lh Zellen, nach der Aktivierung von Gnrh1 (Abbildung 5 erhöht). Diese Beobachtungen sind im Einvernehmen mit dem, was in Hypophyse Zelle Kulturwissenschaft aus unserem eigenen Labor 29 darauf hinweist, dass mit berichtet worden ist primäre Hypophyse Zellkulturen sind immer noch relevant für die Membran-Eigenschaften der Hypophysen Zellen zu charakterisieren. Gehirn-Hypophysen Scheiben erlauben uns zu studieren auch indirekte Auswirkungen der verschiedenen Verbindungen sowie Wechselwirkungen zwischen den Zellen, jedoch wie es strukturelle Verbindungen unterhält, die im primären Hypophyse Zellkulturen verloren gehen. Darüber hinaus Slice Vorbereitung soll schneller vorbereiten im Vergleich zu einer dissoziierten Primärzelle Kultur und elektrophysiologische Aufnahmen können in den folgenden 30 min nach Dissektion durchgeführt werden. Dies bedeutet, dass im Gegensatz zu einer Primärzelle Kultur zirkadianen Rhythmen in einer sinnvollen Weise mit frisch zubereiteten Scheiben angesprochen werden kann.

Wegen der geringen Größe der Hypophysen Zellen in Fisch (Membran-Kapazität um 3 bis 10 pF), und unsere eigenen Beobachtungen zeigen, dass Gonadotrope Zellen ihre Fähigkeit verlieren, Feuer Aktionspotentiale (Abbildung 3) und verlieren dadurch ihre Fähigkeit zur Reaktion auf Freigabe von Hormonen bei der Aufnahme im ganz-Zell Konfiguration, beschlossen wir, verwenden und die perforierten Patch-Technik hier zu präsentieren. In der Tat hat sich gezeigt, dass diese ganz-Zell Konfiguration zur Verbreitung wichtiger zytoplasmatischen Moleküle verändert also die elektrophysiologische Zelle Eigenschaften 13führen könnte. Verwenden Sie stattdessen die perforierten Patch-Konfigurationen mit Amphotericin B um zu perforieren der Zellmembran in die Patch-Pipette, so dass nur kleine Löcher, so dass nur kleine Ionen passieren, 15,16,43, 44, könnten wir diese Verdünnung und Aufzeichnung der elektrischen Aktivität der Zelle über einen längeren Zeitraum vermeiden.

Ein wichtiger Punkt in der perforierten Patch-Technik soll Erstbefüllung Rücken die Pipette mit IC-Lösung ohne Antimykotika um zu vermeiden, Freisetzung von Antimykotika in das Medium und alle Zellen des Abschnitts beim Anflug mit der Patch-Pipette schädigen. In der Tat ist wegen der positiven Druck auf die Patch-Pipette beim Anflug auf des Gewebes, etwas Flüssigkeit durch die Patch-Pipette undicht, bis der Patch vorgenommen wird. Diese Strömung hilft die Spitze sauber zu halten, bis Sie die gezielte Zelle erreichen aber wenn Antimykotika im Medium veröffentlicht wird, bevor der Patch gemacht wird, kann es alle Membranen aller Zellen, verändert sich dramatisch die durchlässigen Eigenschaften der Zellmembranen Perforieren und damit Ihre elektrischen Eigenschaften.

Das vorgestellte Verfahren optimiert und erfolgreich eingesetzt, um die elektrische Aktivität von Medaka Gonadotrope Zellen zu studieren. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um alle (endokrine) Zelltypen gefunden in der Hypophyse von Medaka und andere teleost Fischsorten zu studieren. Denken Sie daran nur, dass die Osmolalität und pH-Wert aller Lösungen, dass die Körperflüssigkeiten der Arten angepasst werden müssen in Frage.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben

Acknowledgments

Wir danken Frau LourdesCarreon G Tan für ihre Hilfe, die Aufrechterhaltung der Medaka Anlage und Anthony Peltier für die anschaulichen Zahlen. Diese Arbeit wurde von NMBU und der Forschung Rat von Norwegen, Grantnummern 244461 (Aquakultur-Programm) und 248828 (Digitalleben Norwegen-Programm) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 138 Gehirn-Hypophyse Gewebe-Slice Elektrophysiologie Fisch Patch-Clamp endokrine Zellen
Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische
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Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

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