Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

دراسة Ribonucleotide التأسيس: كشف حبلا على حدة Ribonucleotides في جينوم الخميرة وقياس الطفرات المستحثة Ribonucleotide

Published: July 26, 2018 doi: 10.3791/58020
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS
* These authors contributed equally

Summary

ريبونوكليوتيديس من بين النيوكليوتيدات غير المقبول الأكثر وفرة دمج الجينوم أثناء النسخ المتماثل حقيقية النواة للحمض النووي. إذا تمت إزالة بشكل غير صحيح، يمكن أن يسبب ريبونوكليوتيديس تلف الحمض النووي والطفرات. نقدم هنا، نهجين التجريبية التي تستخدم لتقييم وفرة إدماج ريبونوكليوتيدي في الحمض النووي وآثاره مطفرة.

Abstract

ثبت وجود ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي يكون مصدرا لعدم الاستقرار المجيني. مدى إدماج ribonucleotide يمكن تقييمها بالتحلل المائي القلوي وجل التفريد كما الجيش الملكي النيبالي عرضه للتحلل في الظروف القلوية. هذا، بالاقتران مع تحليل لطخة جنوب استخدامها لتحديد الموقع وحبلا إلى التي أدرجت في ريبونوكليوتيديس. ومع ذلك، هذا الإجراء هو فقط نصف الكمية، وقد لا تكون حساسة بما يكفي للكشف عن تغيرات صغيرة في المحتوى ريبونوكليوتيدي، على الرغم من أن السبر حبلا على حدة الجنوبي وصمة عار ويحسن الحساسية. كمقياس لإحدى العواقب البيولوجية الأكثر لفتا للنظر من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي، يمكن تحليل الطفرات العفوية باستخدام مقايسة طفرة إلى الأمام. استخدام الجينات مراسل المناسبة، يمكن أن تكون الطفرات النادرة التي ينتج عنها فقدان الوظيفة المحددة والشاملة، ويمكن قياس معدلات الطفرة محدد عن طريق الجمع بين البيانات المستمدة من تجارب تقلب مع تسلسل الحمض النووي الجينات مراسل. والرزن تقلب قابل للتطبيق لدراسة طائفة واسعة من العمليات مطفرة في خلفية وراثية محددة أو ظروف النمو.

Introduction

أثناء النسخ المتماثل التوكسينات الحمض النووي، تدمج ribonucleotides الجينوم بجميع الثلاثة الرئيسية ريبليكاسيس الحمض النووي والحمض النووي α بولمرس (Pols) واليورو و δ1،2. رناسي تعتمد على H2 ribonucleotide الختان إصلاح (RER3) يزيل معظم هذه ريبونوكليوتيديس المضمنة.

ريبونوكليوتيدي في الحمض النووي عرضه للتحلل المائي، كما يمكن مهاجمة مجموعة الهيدروكسيل 2 'لمجموعة السكر بوند phosphodiester المتاخمة، الإفراج عن نهاية واحدة مع فوسفات دوري 2'-3 'والآخر مع 5'--أوه4. ويمكن تسريع ظروف قلوية كثيرا رد الفعل هذا. وهكذا، يسبب التحلل المائي ل ribonucleotides المضمنة أثناء حضانة في حل أساسي تجزؤ الحمض النووي، التي يمكن تصور ب التفريد قلوية [اغروس]5. هذا الحمض النووي يمكن أن تنقل إلى غشاء وسبر بتحليل لطخة الجنوبية استخدام المسابير حبلا الخاصة التي تسمح بتحديد مواقع حساسة القلوية الناجمة عن ريبونوكليوتيديس تدرج إلى الوليدة الرائدة-أو متخلفة-حبلا الحمض النووي، على التوالي.

في خلايا الخميرة التي تفتقر إلى النشاط H2 رناسي، يمكن البدء في إزالة ريبونوكليوتيديس عند توبويسوميراسي (Top1) أنا نيكس الحمض النووي في6،ريبونوكليوتيدي المضمنة7. ومع ذلك، عندما كليفس Top1 على الجانب 3 'ريبونوكليوتيدي، هذا يولد 5'--يا و 2 '-3' الفوسفات دوري الحمض النووي الغايات التي مقاومة للحرارة إلى ريليجيشن. عدم إصلاح، أو تجهيز الشاذة هذه 'الغايات القذرة' يمكن أن يؤدي إلى عدم الاستقرار المجيني. وبالإضافة إلى ذلك، في حالة حدوث الشق داخل تكرار تسلسل الحمض النووي، عملية الإصلاح يمكن أن يؤدي إلى طفرات الحذف. وهذه مشكلة خاصة ليكرر جنبا إلى جنب، حيث القصير الحذف (من بين اثنين وخمسة أزواج قاعدة) عادة ولوحظت في الخلايا رناسي H2-تعاني من نقص. Top1-تعتمد على الآثار الضارة في غياب الخميرة H2 رناسي النشاط تتفاقم في دنا بوليميريز اليورو متحولة (pol2-M644G) منحل لإدماج ribonucleotide خلال توليف حبلا الرائدة الوليدة.

تجهيز ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي يؤدي إلى الطفرات العفوية ويمكن الكشف عن هذه الطفرات باستخدام الجينات مراسل المناسبة وتحديد التغيير المظهرية المصاحبة لها. تقلب اختبار أو تجربة لوريا وديلبروك واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لقياس معدلات الطفرة التلقائية باستخدام التحديد مراسل الجينات8،9. في الخميرة، يمكن استخدام الجينات URA3 و CAN1 كالصحافيين مقايسة طفرة إلى الأمام، مما يسمح للكشف عن جميع أنواع الطفرات التي تؤدي إلى فقدان وظيفة الجينات. ويقدر معدل الطفرات العفوية كوسيط التي لاحظت لثقافات متعددة موازية بدأت من المستعمرات مفردة دون الطفرات في الجينات مراسل الهدف. خميرة سلالة رناسي H2 التي تفتقر إلى مثل rnh201Δ له بمعدل الطفرات عفوية وعموما متوسطة مرتفعة إلى حد كبير بسبب ارتفاع معدل انتشار الإصابة 2-5 bp الحذف بالترادف تكرار تسلسل. وهكذا تماما وصف تأثيرات مطفرة ريبونوكليوتيديس في الجينوم، معدلات طفرة محددة تحتاج إلى تحديد. وفي هذه الحالة، يمكن تضخيم الجينات مراسل URA3 أو CAN1 ومتسلسلة لتحديد أنواع وأماكن للطفرات، ويمكن حساب معدلات الطفرة محددة. تجميع الطفرات التي تم تحديدها في عدة طفرات مستقلة URA3 أو CAN1 ثم استخدامها لتوليد طيف الطفرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-القلوي المائي ووصمة عار جنوب حبلا على حدة (الشكل 1)

  1. نمو الخلايا وعزل الحمض النووي الجينومي
    1. عزل من خميرة طقم تنقية الحمض النووي اتباع إرشادات الشركة المصنعة باستخدام الخميرة الحمض النووي. استخدام الثقافات التي في مرحلة النمو (كثافة بصرية من 0.5) بين 1 أسي. ريسوسبيند بيليه الحمض النووي النهائي في 35 مل 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 1 ملم حمض الإيثيلين (يدتا)).
    2. أضف 1 مل من 5 ملغ/مل رناسي A للحمض النووي، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. يعجل بالحمض النووي باستخدام وحدات التخزين 0.1 من خلات الصوديوم 3 م (pH 5.2) وحجم 2.5 من الإيثانول 100% لمدة 20 دقيقة على الجليد.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة.
    5. أغسل بيليه مرتين مع 500 مل إيثانول 70%. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة.
    6. الجاف لبيليه على مقاعد البدلاء وريسوسبيند في 35 مل 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
    7. كوانتيتاتي الحمض النووي استخدام فلوريميتير (جدول المواد) مع دسدنا طقم المقايسة BR.
    8. يعجل بملغ 5 من الحمض النووي من كل عينة باستخدام أحجام 0.1 م 3 خلات الصوديوم، وحدات الأس الهيدروجيني 5-2 و 2.5% 100 EtOH لإجمالي حجم 200 مل (إضافة ح2س إذا كان هناك حاجة ضرورية، إضافية 5 ملغ من الحمض النووي إذا لزم الأمر عنصر التحكم جل محايدة). تبني على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    9. أجهزة الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة.
    10. جاف بيليه على مقاعد البدلاء. ريسوسبيند الحمض النووي في 14 مل ح2o.
  2. التفريد التحلل المائي وجل القلوية
    1. إضافة مل 6 1 م كوه واحتضان في 55 درجة مئوية ح 2.
    2. احتضان هذه العينات في الثلج لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة مل 4 من 6 × القلوية الحمض النووي تحميل المخزن المؤقت: 300 ملم كوه، 6 مم يدتا، pH 8.0، 18% بوليسوكروسي (جدول المواد)، 0.15% بروموكريسول الخضراء، و 0.25% زيلين نفط زايلين فرنك فرنسي.
    4. ويلقي جل قلوية التي تتألف من 1% [اغروس]، 50 مم هيدروكسيد الصوديوم، يدتا 1 مم، الرقم الهيدروجيني 8.0. استخدام مشط تسمح لمل 24 من عينات الحمض النووي إلى أن يتم تحميل كل حارة.
    5. تشغيل الهلام في درجة حرارة الغرفة في 1 × التفريد القلوية المخزن المؤقت: 50 مم هيدروكسيد الصوديوم، 1 مم يدتا، pH 8.0. وتتضمن علامة حجم الحمض النووي مناسب.
    6. تدور إلى أسفل الأنابيب بإيجاز وتحميل العينة مل 24 أسرة إلى قلوية [اغروس] هلام. اليكتروفوريسي لمدة 30 دقيقة في 30 الخامس، تليها ح 18-20 في 10 الخامس.
    7. تحييد الهلام إينكوباتيونس 2 من 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف في تحييد المخزن المؤقت الأول: 1 م تريس-HCl، 1.5 م كلوريد الصوديوم.
    8. وصمة عار في الحمض النووي بامتصاص الجل معادلتها في 200 مل الماء الذي يحتوي على 1/10,000 إضعاف "الذهب سيبر" وصمة عار ح 2 في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
    9. تصور ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية باستخدام الحمض النووي. زيادة القلوية-الحساسية يسبب ظهور أصغر شظايا من الحمض النووي، مما يشير إلى كثافة أعلى من ريبونوكليوتيديس التي لم يتم إصلاحها في الحمض النووي5.
  3. نقل جنوب
    1. نقل الحمض النووي من هلام القلوية للغشاء النايلون مشحونة إيجابيا بعمل شعري10. مثال عن كيفية نقل هذا يمكن إعداد يرد في دليل سامبروك ورسل10.
    2. نقع هلام القلوية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في "المخزن المؤقت لنقل القلوية": 0.4 M هيدروكسيد الصوديوم، وكلوريد الصوديوم م 1.
    3. الرطب الغشاء النايلون (خفض لحجم الهلام) بإيجاز مع الماء، وثم ينقع لمدة 5 دقائق في "المخزن المؤقت لنقل القلوية".
    4. إعداد منصة نقل بعكس قنينة زجاجية 3 (100 مل) في زجاج صحن الخبز. ينبغي أن يكون هذا الطبق أكبر قليلاً من الحجم [اغروس] هلام. تعيين لوحة زجاج على أعلى منهم.
    5. ثني 2 قطعة كبيرة من الورق اللوني CHR 3 مم (خفض لحجم العرض جل بالإضافة إلى الجانبين أطول التي يمكن ثني على الحواف إلى الخزان المخزن المؤقت) على اللوحة الزجاجية.
    6. صب "القلوية نقل المخزن المؤقت" على الورقة اللوني وملء نصف الطبق الزجاج. سلسة من الفقاعات باستخدام ماصة زجاجية 5 مل من.
    7. ضع [اغروس] هلام في الأعلى، تذليل مجددا الفقاعات. قم بإحاطة كافة حواف الجل مع بارافيلم. صب كمية صغيرة من "القلوية نقل المخزن المؤقت" إلى الهلام.
    8. مكان الغشاء النايلون غارقة مسبقاً على رأس الهلام. سلسة من الفقاعات.
    9. قص الرطب 2 قطعة من الورق بالحجم [اغروس] هلام. وضعها على رأس الغشاء، وتذليل أي فقاعات.
    10. ضع كومة كبيرة من المناشف الورقية (قطع بحجم أكبر قليلاً من [اغروس] هلام) على رأس ساندويتش نقل. بعناية بوضع لوحة زجاج فوق مناشف ورقية. إضافة كائن مرجحة للأعلى (كتاب مع كتلة من 400 غرام يعمل بشكل جيد).
    11. السماح النقل المتابعة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    12. تأخذ المكدس نقل وبصرف النظر بعناية وامتصاص الغشاء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في "تحييد المخزن المؤقت الثاني": 0.5 م تريس-HCl، الرقم الهيدروجيني 7.2، 1 م كلوريد الصوديوم.
    13. التشعب الحمض النووي للغشاء النايلون مشحونة باستخدام كروسلينكير من الأشعة فوق البنفسجية. وضع الغشاء في كروسلينكير واستخدام الإعداد أوتوكروسلينك.
  4. إعداد التحقيق جنوب
    ملاحظة: سبق نشرة النهج المذكور هنا للكشف عن مواقع حساسة القلوية في الرائدة الوليدة-مقابل حبلا المتخلفة من حبلا الحمض النووي يستند إلى بروتوكول11. لتجربتنا، يتم إجراء التدقيق في الجينات مراسل URA3 الذي تم إدخاله في أحد هناك اتجاهان (OR1 أو OR2) المتاخمة لأصل النسخ المتماثل ARS306 على الكروموسوم الثالث (الشكل 3A). وجود مواقع حساسة القلوية في الخميرة المجينية الحمض النووي مؤشر ريبونوكليوتيدي التأسيس، والسماح باستخدام ريبونوكليوتيديس كالمؤشرات الحيوية بوليميراز الدنا النشاط12،،من1314. ينبغي أن يكون هذا النهج، باستخدام تسلسل الحمض النووي المتاخمة لأصل ARS306 كفاءة النسخ المتماثل، هدفا قابلاً لمواقع الجينوم والجينات المستهدفة، فضلا عن أخرى.
    1. [بكر] تضخيم 520-قاعدة الجزء زوج من الجينات مراسل URA3 استخدام زوج التمهيدي التالية: URA3--F1 (5´-جكتاكاتاتاجاكجتجكتجك) و URA3-R1 (5´-كتتجتكجكتكتكجكاتجتك).
    2. إجراء تفاعل PCR باستخدام 10-20 نانوغرام من الحمض النووي الخميرة كقالب، ميكروليتر 4 من كل 10 ميكروليتر من 10 × السابقين العازلة بوليميراز (Mg2 + زائد)، 8 ميكروليتر من خليط دنتب (2.5 ملم في كل)، 0.5 ميكروليتر من "السابقين بوليميراز الدنا بوليميراز" التمهيدي (10 ميكرومترات الأسهم)، (يو 5/ميكروليتر) ، وضبط وحدة التخزين النهائي إلى 100 ميكروليتر مع H2o.
    3. قم بتشغيل برنامج الاسترداد التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 30 من 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية 10 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
    4. تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات تنقية بكر والوت الحمض النووي باستخدام 50 مل ح2o. يمكن الآن استخدام هذا كالقالب في رد فعل راديولابيلينج.
    5. استخدام كبسولة تفجير التالية محددة حبلا راديولابيلينج: استخدام URA3-أ (5´-كتكاتككتاجتككتجتجكتجكك) لتصور الحمض النووي التي أنيالس للتحقيق أ وهذا يناظر الوليدة الرائدة حبلا الحمض النووي عندما URA3 في OR2 وتناسسينت متخلفة حبلا الحمض النووي عندما URA3 في OR1. استخدام URA3-ب (5´-كاجتاكككتاجتاتاتكتككاج) لتصور الحمض النووي الوليدة التي أنيالس للتحقيق باء وهذا يقابل الوليدة الرائدة حبلا الحمض النووي عندما URA3 في OR1 وتخلف الوليدة حبلا الحمض النووي عندما URA3 في OR2 (الشكل 3).
      1. القيام برد فعل راديولابيلينج باستخدام 10-20 نانوغرام تضخيم URA3 يفتت كقالب الحمض النووي، 2 ميكروليتر التمهيدي (10 ميكرومترات الأسهم)، 5 ميكروليتر من 10 س ت تق المخزن المؤقت (Mg2 + زائد)، 4 ميكروليتر من دنتبس 2.5 ملم (ناقص دكتب)، 5 ميكروليتر (50 μCi)-32فدكتب ، 0.5 ميكروليتر من "اكستاق دنا بوليميريز" (يو 5/ميكروليتر) وضبط الحجم النهائي إلى 50 ميكروليتر مع سين تشغيل البرنامج التالي راديولابيلينج ح2: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 25 دورات 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة, 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية.
    6. استخدام عمود دوران G-25 لإزالة التسمية المشعة غير مسجلة. قبل إضافة العينة راديولابيليد، الطرد المركزي في عمود 1 دقيقة على 720 × المخزن ز وريموفيثي بيبيتينج. تحميل المنتج رد فعل راديولابيليد والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 720 x ز الوت المجس المسمى.
    7. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تجريدها التحقيق فورا قبل التهجين. بارد بإيجاز على الجليد.
  5. التهجين الجنوبي
    1. لفة الغشاء ترطب في أنبوب تهجين وإضافة 25 مل من المخزن المؤقت التهجين الطازجة: 0.5 م فوسفات الصوديوم العازلة، ودرجة الحموضة 7-2، 7% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، 1% ألبومين المصل البقري (BSA). احتضان عند 65 درجة مئوية ح 1-2 مع التناوب في فرن تهجين.
    2. بعناية من أجل الخروج الحل وإضافة 25 مل من التهجين المخزن المؤقت بالإضافة إلى التحقيق راديولابيليد. احتضان عند 65 درجة مئوية ح 16-18 بالتناوب.
    3. من أجل إيقاف الحل في حاوية نفايات مشعة. أداء يغسل 5 من 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الفوسفات-الحزب الديمقراطي الصربي الغسيل الحل الأول: 40 مم فوسفات الصوديوم العازلة، درجة الحموضة 7-2، 5% الحزب الديمقراطي الصربي، 0.5% جيش صرب البوسنة، 1 مم يدتا، pH 8.0.
    4. أداء يغسل 2 من 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية مع الفوسفات-الحزب الديمقراطي الصربي "الغسيل الحل الثاني": 40 مم فوسفات الصوديوم العازلة، ودرجة الحموضة 7-2، 1% الحزب الديمقراطي الصربي، 1 مم يدتا، pH 8.0.
    5. إزالة الغشاء من الأنبوب التهجين باستخدام الملقط وفي حامي فتح الأكمام بلاستيكية. تغطية وفضح لصفيحة تصوير. حاول عدة مرات تتراوح بين 4 ح د 4 التعرض المختلفة.
    6. إذا لزم الأمر، الشريط وإعادة التحقيق وصمة عار باستخدام مجس مختلف تقريبا 3-4 مرات. على الشريط، احتضان الغشاء ح 2 في 65 درجة مئوية في 25 مل من ميثلامين 50%, 2 x SSPE الحل.
      ملاحظة: 20 x SSPE الأسهم الحل: 3 م كلوريد الصوديوم، 0.2 م NaH2بو4، يدتا 0.02 م، درجة الحموضة 7.4.
    7. من أجل إيقاف الحل في حاوية نفايات مشعة. أداء يغسل 2 من 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية في الفوسفات-الحزب الديمقراطي الصربي "الغسيل الحل الثاني".
    8. تحقق من الغشاء مع عداد غايغر وكرر البروتوكول تجريد إذا بقيت إشارة.
    9. تنفيذ ما قبل التهجين والتهجين كما هو موضح أعلاه.

2-قياس معدل الطفرات وخصوصية في سلالات سيريفيسيا س.

  1. إعداد ثقافة الخلية
    1. تطعيم مستعمرة واحدة (المستعمرات 2-3 أيام عند 30 درجة مئوية بشكل مناسب الحجم تحيط خلايا الخميرة صحية) نمت في أجار YPD تكملة مع الأدنين 100 مغ/مل إلى 5 مل مرق ايبدا تستكمل مع الأدنين 250 ملغ/مل (المكملات الأدنين ضروري فقط إذا الضغط الذي يستخدم أوكسوتروف الأدنين). تنمو في حاضنة شاكر أو دوار عند 30 درجة مئوية حتى تصل إلى الثقافة التشبع (36-48 ح لسلالة دون خلل نمو شديد).
    2. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في عام 2000 ~ x ز لمدة 5 دقائق.
    3. تجاهل المادة طافية وغسل الخلايا مع 5 مل الماء المعقم.
    4. ريسوسبيند الخلايا في 500 مل الماء المعقم.
  2. تمييع الثقافة الخلية والطلاء
    1. لعدم اختيار عناصر التحكم، يؤدي إلى تمييع الخلايا الموجودة في لوحة 96-جيدا بمعامل 1,600,000 ولوحة 100 مل من كل ثقافة على صفيحة (COM) كاملة.
    2. لتحديد لطفرات ura3 ، لوحة 100 مل خلايا غير مخفف على صفيحة 5-فوا لسلالة (WT) البرية من نوع. تمييع الخلايا وبالتالي إذا كان معدل تحور سلالة الفائدة من المتوقع أن يكون أعلى منه في سلالة WT.
    3. حدد لطفرات can1 وتمييع الخلايا إضعاف ولوحة 100 مل على لوحة المحتوية على كانافانيني (يمكن) لسلالة WT. عامل إضعاف وهو 0.5.
    4. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية حتى شكل المستعمرات الخميرة. لسلالات دون خلل نمو، 2-3 أيام كافية عادة لكوم ويمكن لوحات و 3-5 أيام للوحات 5-فوا. لمقارنة معدلات الطفرة بين سلالات مختلفة، فمن الأفضل أن يختار في نفس اليوم للنمو حساب المستعمرات. تخزين لوحات جاهزة حسابها في الغرفة الباردة (~ 4 درجة مئوية).
  3. حساب معدل الطفرات العفوية
    1. عد المستعمرات مرئية على كل لوحة وتدوين ملاحظات أرقام مستعمرة
    2. حساب معدل الطفرات باستخدام صيغة دريك: μ = و ÷ ln (μNt). و هو التردد الطفرة محسوبة بعدد من طفرات مقسوماً على عدد من الخلايا في ثقافة النهائي. Nt هو عدد الخلايا في ثقافة النهائي وهو μ معدل الطفرة. يمكن حل هذه المعادلة بطريقة تكرارية مثل طريقة نيوتن-Raphson. وهناك أساليب أخرى مقدر، بما في ذلك اختبار ليا وكولسون، لحساب معدل الطفرات15.
    3. حساب التوزيع العادي سجل فاصل الثقة بافتراض معدلات أوتاتيون يعزل الفردية. غالباً ما يستخدم فاصل الثقة 95%.
  4. تحليل الطيف الطفرة
    1. اختيار مستعمرة واحدة من كل 5-فوا أو يمكن لوحة وتحديث على لوحة يبدأ.
    2. أداء مستعمرة PCR لتضخيم الجين URA3 أو CAN1 وتسلسل من أجل الكشف عن الطفرات باستخدام كبسولة تفجير التالية: URA3-F (5 '-كجكاتاتجتجتجتجاجا-3') و URA3-R (5 '-تجتجاجتتاجتاتاكاتجكا-3') لكل [بكر] تضخيم و تسلسل الجين URA3 بي بي 800؛ CAN1-F (5 '-كتكتاكتككجتكتجكتتك-3') و CAN1-R (5 '-كاجاجتكتكاجاكتك-3') للتضخيم و CAN1-AR (5 '-تجااتجتجاجكاجكجت-3')، CAN1-9R (5 '-ككتجكاكاككاجتجاتا-3')، CAN1-10R (5 '-جاجاتجتاكاججاتجات-3') و (CAN1-فرع --كجتجتاتجاكتاتجاجج 5 '-3') لتسلسل الجين المراسل CAN1 bp 1800.
    3. لتنفيذ مستعمرة [بكر]، ريسوسبيند مستعمرة واحدة في ميكروليتر 5 ح2س واستخدام ميكروليتر 1 كقالب. إضافة ميكروليتر 1 من كل من الإشعال (5 ميكرومترات الأسهم)، 2 ميكروليتر من 5 x KAPA2G العازلة (Mg2 + زائد)، 0.5 ميكروليتر من دنتب (2.5 مم)، 0.5 ميكروليتر من KAPA2G سريعة دنا بوليميريز، ميكروليتر 12 ح2o.
    4. للتضخيم الجيني URA3 ، قم بتشغيل برنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 5 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 10 s، 61 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ دورات 35 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، 61 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ق؛ 72 درجة مئوية 2 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية. للتضخيم الجيني CAN1 ، قم بتشغيل برنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 5 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 10 s، 61 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 72 درجة مئوية ل 45 s; دورات 35 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، 61 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 72 درجة مئوية ل 45 s؛ 72 درجة مئوية 2 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
    5. قم بمحاذاة نتائج التسلسل لتسلسل مرجع باستخدام برنامج مثل برو سيكمان دناستار أو سيكوينتشير للتعرف على الطفرات.
    6. تجميع بيانات الطفرات بالطفرات موقع (الشكل 5) أو نوع الطفرة (الشكل 4). حساب معدلات الطفرة محدد بتواتر طفرة (عدد الأحداث ولاحظ مقسوماً على عدد من طفرات متتابعة) مضروباً في المعدل الإجمالي للطفرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

العلاج من الحمض النووي مع القلوي متبوعاً بالتفريد جل القلوية يسمح لكشف شبه كمي تجزؤ الحمض النووي نظراً لوفرة ribonucleotides ستابلي مدمجة. ويبين الشكل 2 الصور هلام الخميرة الحمض النووي تعامل مع أو بدون كوه5. البديل M644L من Pol2، وحدة فرعية الحفاز من Polε، خفضت القدرة على دمج ribonucleotides بينما يتضمن المسخ M644G ريبونوكليوتيديس أكثر من بوليميريز WT. كما هو مفصل في البروتوكول، يمكن سبر جل القلوية كذلك بتحليل حبلا على حدة الجنوبي وصمة عار. بمعرفة مكان موقع جينومي بروبيد مقارنة بأصولها المتاخمة، ونحن بشكل انتقائي التحقيق ribonucleotides تدمج الوليدة الرائدة أو متخلفة عن خيوط. ويبين الشكل 3 نتائج وصمة عار جنوب سبر الجينات مراسل URA3 إدراجها في توجهات المعاكس اثنين قريبة من مصدر النسخ متماثل مبكر إطلاق نار، ARS30616. باستخدام الرائدة المسابير حبلا على حدة، نلاحظ نمط تجزؤ الحمض النووي الناجم عن الانقسام القلوي في ريبونوكليوتيديس في الوليدة الرائدة حبلا الحمض الخلوي الصبغي في سلالة WT وفي التعبير عن المتغيرات δ α بولمرس واليورو التي منحل لسلالات إدراج ريبونوكليوتيدي.

استخدام تجربة تقلب، يمكننا قياس معدلات الطفرة سلالات الخميرة التي تحتوي على الجينات مراسل. ويبين الشكل 4 معدلات الطفرة في اتفاق جولة أوروغواي3 والمكاني CAN1 سلالات معربا عن بوليميريز WT أو المسخ pol2-M644G مع أو بدون وظيفية رناسي H2. عدم وجود H2 رناسي يسبب زيادة معتدلة في المعدلات الإجمالية للطفرة في الخلفيات على حد سواء. ومع ذلك، يكشف الفحص الدقيق لخصوصية الطفرة في سلالات تفتقر إلى H2 رناسي (الشكل 5)، وهناك زيادة كبيرة في معدل الطفرات للحذف قصيرة، لا سيما في تسلسل تكرار جنبا إلى جنب. الشكل 5A يقارن خصوصية الطفرة في سلالات201Δ WT ورنة ويعرض الشكل 5B حيث أثر زيادة ribonucleotide مرتفعة في إدماج حبلا الحمض النووي الرائدة الوليدة ببول اليورو.

Figure 1
رقم 1: بروتوكول الخطوات المتضمنة في الكشف حبلا على حدة لمواقع حساسة القلوية الناجمة عن دمج ريبونوكليوتيدي في الحمض النووي الخميرة. لمحة عامة عن مختلف الخطوات الرئيسية المشاركة في هذا الإجراء، بدءاً بعزل الحمض النووي الجينومي الخميرة وانطلاقا من خلال تحليل لطخة جنوب النهائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: صورة تمثيلية للنتائج التي حصلت عليها قلوية [اغروس] هلام استشراد. وقد تم تكييف هذا الرقم من نك مسيلهيني، أ. س. et al. 5-الخميرة الحمض النووي من سلالات من الأنماط الجينية المختلفة قد تعامل مع بوكل (المحايدة) أو كوه (القلوية) وفصل بعد ذلك في جل [اغروس] محايدة أو القلوية. "وزن" و "M644G" تشير إلى حالة Pol اليورو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: حبلا الخاصة بالتدقيق قلوية [اغروس] هلام بوصمة عار جنوب- وهذا الرقم قد تم تكييفه من ويليامز، س. ج. et al. 13- (أ) تحقيقات راديولابيليد يصلب إلى حبلا الحمض النووي الرائدة الناشئة داخل الجينات مراسل URA3 أنه تم إدراج ما يقرب من ARS306 في اثنين من التوجهات المعاكس (OR1 و OR2). (ب) نتائج تمثيلية من النشاف الجنوبية استخدام المسابير حبلا الخاصة الرائدة الوليدة. عرض نتائج السبر حبلا الرائدة الوليدة في سلالة مع الحمض النووي WT [بولمرس]، أو pol1-L868M، pol2-M644G أو pol3-L612M سلالات البديل مع أو بدون رناسي H2. ترميز الجينات POL1، POL2، و POL3 الحفاز مفارز Pols α، اليورو، و δ، على التوالي. المتغيرات أكثر منحل ل ribonucleotide إدراج5،،من1217. (ج) التحديد الكمي لإشارة المشعة بجزء ضئيل مجموع كل حارة من (ب). يتم التعبير عن القيم كنسبة مئوية من المجموع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: معدلات الطفرة العفوية في سلالات الخميرة. وقد تم تكييف هذا الرقم من نك مسيلهيني، أ. س. et al. 5-استخدمت الجينات مراسل URA3 و CAN1 في مقايسة طفرة إلى الأمام لقياس معدلات الطفرة سلالات المشار إليه. مراسل URA3 في "التوجه 2" (OR2، الشكل 3 ألف). فاصل الثقة 95% (CI) يتم تضمين لكل قياس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: الأطياف طفرة للجينات مراسل URA3-OR2. وقد تم تكييف هذا الرقم من المنشورات السابقة5،18،،من1920. يصور نوع الموقف والطفرة لوحظت في كل مستعمرة 5-فوا-مقاومة مستقلة المحدد في مقايسة طفرة إلى الأمام في 804 bp تسلسل الترميز URA3 . تشير الأحرف إلى قاعدة استبدالات، مثلثات مفتوحة تشير إلى حذف قاعدة واحدة، مثلثات مغلقة تشير إلى عمليات الإدراج قاعدة واحدة، وتشير الخطوط الصلبة إلى الحذف قصيرة. (أ) الأطياف الطفرة في سلالات WT و rnh201Δ . التسميات الأحمر أعلى التسلسل هي الطفرات التي لوحظت في وزن بينما تسميات الأزرق أسفل التسلسل تلك التي لوحظت في عبئا rnh201Δ . (ب) الأطياف الطفرة في سلالات pol2 M644G و rnh201Δ pol2-M644G . تكون تسميات الأحمر أعلاه التسلسل الطفرات التي لوحظت في pol2-M644G بينما الأزرق أدناه بالتسلسل لسلالات rnh201Δ pol2-M644G . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهنا يصف لنا البروتوكولات لمجموعتين من التجارب التي تستخدم بشكل متكرر لتحليل شبه كمي ribonucleotides إدراجها أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي وآثار مطفرة ريبونوكليوتيديس التي لم يتم إصلاحها. على الرغم من أن تنطوي هذه النهج النموذجي eukaryote S. cerevisiae، يمكن تكييفها هذه التقنيات بسهولة للميكروبات وحقيقيات النوى حتى أعلى الأخرى.

التدقيق في ريبونوكليوتيديس التي لم يتم إصلاحها في الحمض النووي استخدام التفريد قلوية [اغروس] يقترن مع النشاف جنوبي يوفر معلومات هامة فيما يتعلق بعدد ريبونوكليوتيديس الحالية وحبلا التي أدرجت. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن حساسية القلوي يمكن أن يسببه أيضا غيرها من الآفات الحمض النووي، مثل موقع الأساسية. وسيلة أخرى للكشف عن ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي بالمعاملة مع المنقي H2 رناسي الإنزيم، كما فعلت في خلايا الثدييات21. على الرغم من أن لدينا نهج ينطوي على التدقيق في مواقع حساسة للقلويات في الرائدة الوليدة مقابل متخلفة عن خيوط في الجينات مراسل URA3 المستخدمة في تجارب التحليل حيث لدينا، من الممكن تصميم المجسات أن يصلب في أماكن أخرى في النظام للحصول على معلومات هامة فيما يتعلق بكثافة ريبونوكليوتيدي في مواقع أخرى الجينوم. يمكن استخدام الجزء الجنوبي وصمة عار للإجراء أيضا كمرجع لتجارب السبر عامة أخرى الحمض النووي.

قياس معدلات الطفرة باستخدام اختبار تقلب قد استخدمت على نطاق واسع لتحليل مختلف الأحداث مطفرة في الكائنات الدقيقة، وهكذا لا تقتصر على تحليل آثار مطفرة ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي. لهذه التجربة، يمكن زيادة عدد ثقافات مستقلة إلى حد كبير تعزيز دقة القياس. يمكن الحصول على المستعمرات المستقلة streaking سلالة فائدة على المتوسط يبدأ أو تحليل المستعمرات بوغ المستقلة التي حصل عليها تشريح tetrad من وصمة الخميرة مثنوية. ومن الناحية المثالية، استخدام سلالات الخميرة فرداني مستقلة متعددة (على سبيل المثال.، من تشريح تتراد) تشجع على التقليل من تأثير الاختلاف سلالة إلى سلالة. هذا مهم خاصة عندما يكون معدل الطفرات العفوية عالية أو عندما السلالة خلل نمو. طريقة إضافية يمكن استخدامها لقياس عفوية معدل الطفرات تراكم الطفرات تجربة22. في هذا التحليل، تردد طفرة مصممة للخلايا بعد نمو واسعة، ويمكن استخدامها لحساب معدل الطفرة. اقتران تجربة تراكم الطفرات مع تكنولوجيا التسلسل العميق قد ثبت أن تكون أداة قوية لتحليل معدل الطفرات وخصوصية عبر الجينوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كونكيل لعملهم والمناقشات ذات الصلة بالبروتوكول، وإعادة استخدام البيانات المقدمة هنا. وأيد هذا العمل المشروع Z01 ES065070 إلى T.A.K. من "شعبة البحوث الداخلية" للمعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة)، "الوطني معهد لعلوم الصحة البيئية" (نيس).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
YPD media 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.
COM plates 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate.
CAN plates 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.
5-FOA plates 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.
L-Canavanine sulfate US Biological C1050
5-FOA US Biological F5050
20 mL glass culture tube Any brand
Culture rotator in 30 °C incubator Shaker incubator can be used instead
96 well round bottom plates Sterile, any brand
3 mm glass beads Fisher Scientific 11-312A Autoclave before use
12-channel pipettes Any brand
Ex Taq DNA Polymerase TaKaRa RR001
Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit Epicenter MPY80200
3 M sodium acetate Sigma-Aldrich S7899
100% ethanol
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866 Newer model available
dsDNA BR Assay kit Invitrogen Q32850
KOH Sigma-Aldrich 221473
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Ficoll 400 Dot Scientific Inc. DSF10400
Bromocresol green Eastman 6356
Xylene cyanol FF International Technologies Inc. 72120
NaOH Sigma-Aldrich S8045
1 M Tris-HCl (pH 8.0) Teknova T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Invitrogen S11494
UV transilluminator
Amersham Nylon membrane Hybond-N+ GE Healthcare RPN303B
3 MM CHR Chromotography paper Whatman 3030-392
NaCl Caledon 7560-1
Stratalinker 1800 Stratagene
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
G-25 spin column GE Healthcare 27-5325-01
1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) Sigma-Aldrich NaH2PO4 (S9638);
Na2HPO4 (S9390)
SDS Sigma-Aldrich L4522
BSA Sigma-Aldrich A3059
Formamide Sigma-Aldrich 47671
Geiger counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
  2. Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
  3. Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
  4. Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
  5. Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
  6. Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
  7. Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
  8. Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
  9. Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
  10. Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  11. Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
  12. Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
  13. Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
  14. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
  15. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
  16. Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
  17. Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
  18. Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
  19. Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
  20. Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
  21. Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
  22. Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).

Tags

علم الأحياء، العدد 137، ريبونوكليوتيدي التأسيس، وتكرار الحمض النووي، رناسي H2، القلوية جل التفريد، واختبار التقلب، والطفرات
دراسة Ribonucleotide التأسيس: كشف حبلا على حدة Ribonucleotides في جينوم الخميرة وقياس الطفرات المستحثة Ribonucleotide
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, Z. X., Williams, J. S.,… More

Zhou, Z. X., Williams, J. S., Kunkel, T. A. Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis. J. Vis. Exp. (137), e58020, doi:10.3791/58020 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter