Summary
Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.
Abstract
הנוכחות של ribonucleotides ב DNA גרעיני הוכח להיות מקור של אי יציבות גנומית. היקף ההתאגדות ribonucleotide יכול להיות מוערך על ידי הידרוליזה אלקליין, ג'ל אלקטרופורזה כמו ה-RNA הוא רגישים מאוד הידרוליזה בתנאים אלקליין. זה, בשילוב עם ניתוח תספיג דנ א יכול לשמש כדי לקבוע את המיקום לנטישה לתוך אשר ribonucleotides כבר שילבו. עם זאת, הליך זה היא רק חצי כמותית ולא ניתן רגישים מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בתוכן ribonucleotide, למרות סטרנד ספציפיים תספיג חיטוט משפר את הרגישות. כאמצעי של אחת ההשלכות ביולוגי הבולט ביותר של ribonucleotides ב- DNA, מוטגנזה מכוונת ספונטנית ניתן לנתח באמצעות וזמינותו של מוטציה קדימה. באמצעות כתב המתאים גנים, מוטציות נדירות שתוצאתו אובדן התפקוד יכול להיות שנבחרו, הכוללת, המוטציה המחירים נמדד על ידי שילוב הנתונים של תנודות ניסויים עם רצפי DNA של הגן הכתב. וזמינותו תנודות ישימה לבחון מגוון רחב של תהליכים מוטגניות רקע גנטי מסוים או תנאי הגידול.
Introduction
במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים, ribonucleotides משולבים הגנום על ידי כל שלוש הגדולות DNA replicases, אן polymerases (Pols) α, חדוה אלפא1,2. RNase תלויי-H2 ribonucleotide כריתה תיקון (RER3) מסיר את רוב אלה ribonucleotides מוטבע.
Ribonucleotide ב- DNA היא חשופה הידרוליזה, כמו 2' קבוצת הידרוקסיל של moiety הסוכר יכול לתקוף את סמוכים פוספודיאסטרי, שחרור קצה אחד עם 2 - 3' פוספטים מחזורית והשני עם 5'-OH4. תנאי בסיסי מאוד יכולים להאיץ את התגובה הזו. לפיכך, הידרוליזה של ribonucleotides מוטבע במהלך הדגירה בפתרון בסיסי גורם פיצול של הדנ א, אשר ניתן לאבחן על ידי אלקטרופורזה אלקליין agarose5. את הדנ א ניתן להעביר קרום, שנבדק על ידי ניתוח תספיג דנ א באמצעות הגששים סטרנד ספציפיים המאפשרים זיהוי אתרים אלקליות רגיש נגרם על-ידי ribonucleotides משולבים לתוך nascent המובילים - או לקרטע-סטרנד ה-DNA, בהתאמה.
תאי שמרים חסר פעילות RNase H2, הסרה של ribonucleotides יכול להיות יזם כאשר טופואיזומראז (Top1) אני גונבת דנ א ב6,ribonucleotide מוטבע7. עם זאת, כשאתה Top1 cleaves בקצה 3' של ribonucleotide, זה יוצר 5'-הו ומסתיים 2' - 3' פוספט מחזורית DNA כי הם דברים מעוותים religation. כשל תיקון, או חריגה עיבוד קצות אלה' מלוכלך' יכול להוביל אי יציבות גנומית. בנוסף, אם החתך מתבצע בתוך רצף הדנ א. אני חוזר, תהליך התיקון יכול להוביל מוטציות מחיקה. זה בעייתי במיוחד עבור טנדם חוזר, איפה קצר מחיקות (של בין זוגות בסיס וחמש) בדרך כלל שנצפו בתאי RNase H2 לקויה. תלוי Top1-השפעות מזיקות בהיעדרו של שמרים H2 RNase פעילות הם החמירו ב- DNA פולימראז חדוה מוטציה (pol2-M644G) מופקר על התאגדות ribonucleotide במהלך סינתזה גדיל מוביל המתהווה.
עיבוד של ribonucleotides בדנ א מוביל מוטציות ספונטניות, מוטגנזה מכוונת זו ניתן להבחין באמצעות הכתבת המתאימים גנים ובחירה עבור השינוי פנוטיפי הנלווה. מבחן תנודות או ניסוי לוריא, דלבריק הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר למדוד את המחירים מוטציה ספונטנית באמצעות כתב לבחירה על ידי גנים8,9. בשמרים, הגנים URA3 , CAN1 יכול לשמש עיתונאים ב וזמינותו מוטציה קדימה, המאפשר איתור כל סוגי מוטציה שתוצאתה אובדן התפקוד ג'ין. קצב מוטציה ספונטנית מוערך כמו החציון של זה נצפתה לגבי תרבויות רבות במקביל החלה מ מושבות יחיד ללא מוטציות בגן כתב היעד. שמרים RNase H2 לקויה זן כגון Δ rnh201יש קצב מוטציה ספונטנית בסך הכל במתינות מוגברות נגרמת בעיקר על ידי שכיחות גבוה של 2-5 מחיקות bp במשולב לחזור על רצפים. לפיכך, לאפיין באופן מלא את ההשפעות המוטגניות של ribonucleotides הגנום, המוטציה המחירים צריך להיקבע. במקרה זה, הגנים כתב URA3 או CAN1 יכול להיות מוגבר וסודרו כדי לקבוע את סוגי והמיקומים של מוטציות ו המוטציה המחירים יכול להיות מחושב. הידור מוטציות. שזוהו מספר מוטציות URA3 או CAN1 עצמאית ואז ניתן ליצור קשת מוטציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אלקליין ההידרוליזה וזמינות תספיג דנ ספציפיים סטרנד (איור 1)
- צמיחת תאים ובידוד דנ א גנומי
- לבודד שמרים דנ א גנומי באמצעות שמרים ערכת טיהור DNA ההוראות של היצרן. השתמש התרבויות, הן בשלב מעריכית של צמיחה בין (צפיפות אופטית של 0.5) 1. Resuspend בגדר DNA הסופי ב- 35 מ ל 1 x מאגר TE (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)).
- להוסיף 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל RNase של ה-DNA, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לזרז את הדנ א באמצעות 0.1 כרכים של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2) ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול במשך 20 דקות על קרח.
- צנטריפוגה ב 16,000 x g כעשרים דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה.
- לשטוף את גלולה פעמיים עם 500 מ"ל אתנול 70%. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה.
- יבש בגדר על הספסל, resuspend ב 35 מ ל 1 x מאגר טה.
- Quantitate ה-DNA באמצעות של fluorimeter (טבלה של חומרים) עם dsDNA ערכת BR וזמינותו.
- לזרז 5 מ"ג של ה-DNA של כל דגימה באמצעות 0.1 כרכים של 3 מ' סודיום אצטט, pH 5.2 ו- 2.5 בנפחים של 100% EtOH על הנפח הכולל של 200 מ ל (להוסיף H2O אם הצורך, נוספים 5 מ"ג של ה-DNA נחוצה אם הפקד ג'ל ניטרלי נדרשת). דגירה על קרח למשך 20 דקות.
- צנטריפוגה ב 16,000 x g כעשרים דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה.
- יבש בגדר על הספסל. Resuspend ה-DNA ב מ 14 ל H2O.
- אלקליין ההידרוליזה וזמינות ג'ל אלקטרופורזה
- מוסיפים 6 מ של 1 מ' KOH, דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- דגירה בדגימות בקרח במשך 5 דקות.
- להוסיף מ 4 ל 6 x אלקליין DNA טעינת מאגר: 300 מ מ KOH, 6 מ מ EDTA, pH 8.0, polysucrose 18% (טבלה של חומרים), 0.15% bromocresol ירוק ו- 0.25% קסילן cyanol FF.
- הטיל של ג'ל אלקליין מורכב של 1% agarose, 50 מ מ NaOH, 1 מ מ EDTA, pH 8.0. משתמש במסרק המאפשר 24 מ של דנ א ייטענו לכל ליין
- הפעל את הג'ל בטמפרטורת החדר 1 x אלקטרופורזה אלקליין מאגר: 50 מ מ NaOH, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0. לכלול סמן בגודל המתאים של DNA.
- ספין לטמיון בקצרה וטען המדגם כולו mL 24 לתוך הג'ל אלקליין agarose. Electrophorese למשך 30 דקות וחצי V, ואחריו 18-20 h 10 V.
- לנטרל את הג'ל על 2 incubations של 45 דקות כל בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין ניטרול מאגר i: 1 מ' טריס-HCl, 1.5 M NaCl.
- כתם הדנ א למסמס את הג'ל ינוטרלו ב 200 מ של מים המכילים לדילול 1/10,000 הכתם SYBR זהב עבור 2 h בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
- דמיינו את הדנ א באמצעות transilluminator UV. אלקלי-לרגישות מוגברת גורמת את המראה של שברים DNA קטנים יותר, המציינת את צפיפות גבוהה יותר של ribonucleotides לא מתוקן דנ א5.
- העברת בדרום
- להעביר את ה-DNA מ הג'ל אלקליין למוח ניילון הטעון חיובית על ידי נימיות10. דוגמה של איך העברה זו ניתן להגדיר מסופק ידנית, Sambrook, של ראסל10.
- משרים את הג'ל אלקליין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר במאגר אלקליין העברה: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.
- להרטיב את הקרום ניילון (לחתוך לגודל של הג'ל) לזמן קצר עם מים ולאחר מכן משרים למשך 5 דקות מאגר העברה אלקליין.
- להגדיר את הפלטפורמה העברה על-ידי היפוך זכוכית 3 ספלים (100 מ"ל) בכוס אפייה. מאכל זה צריך להיות מעט גדול יותר מהגודל של הג'ל agarose. הגדר צלחת זכוכית מעל כולם.
- לעטוף 2 חתיכות גדולות של 3 מ מ- CHR-כרומטוגרפיה-נייר (לחתוך לגודל של הרוחב של ג'ל ועוד יותר הצדדים יכול לעטוף פינות לתוך המאגר מאגר) מעל לוח הזכוכית.
- מאגר העברה אלקליין שופכים הנייר כרומטוגרפיה ומלא חצי את צלחת זכוכית. חלקה את הבועות בעזרת פיפטה מזכוכית 5 מ ל.
- מקם את הג'ל agarose עליון, שוב החלקת את הבועות. מקיפים את כל הקצוות של הג'ל עם מצלמות-מיקרוסקופים. יוצקים כמות קטנה של מאגר העברה אלקליין על גבי הג'ל.
- מניחים ניילון טרום רטוב הקרום על גבי הג'ל. חלקה את הבועות.
- רטוב 2 חתיכות של נייר חתוך לגודל של הג'ל agarose. למקם אותם על גבי הקרום, להחליק בועות.
- במקום אוסף גדול של מגבות נייר (קאט לגודל גדול מעט יותר הג'ל agarose) על גבי הכריך העברה. בזהירות המקום צלחת זכוכית מעל מגבות הנייר. הוסף אובייקט משוקלל העליון (ספר עם מסה של 400 גרם עובד היטב).
- . בסדר ההעברה להמשיך ללילה בטמפרטורת החדר
- בזהירות לפרק את הערימה העברה ומשרים את הקרום למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ניטרול מאגר השנייה: 0.5 M טריס-HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.
- Crosslink דנ א קרום ניילון טעונה באמצעות crosslinker UV. הכנס מחדש הקרום, השתמש בהגדרה autocrosslink.
- הכנה בדיקה בדרום
הערה: הגישה המתוארת כאן כדי לזהות אלקליות רגיש אתרים מובילים המתהווה-לעומת לקרטע-גדיל של הד מבוססת על פרוטוקול פרסם בעבר11. שהניסוי שלנו, הבדיקה מבוצעת על הגן כתב URA3 אשר הוכנס באחד שני כיוונים (OR1 או ניתוח 2) הסמוך מקור שכפול ARS306 על כרומוזום השלישי (איור 3 א). הנוכחות של רגיש אלקליות אתרים ב- DNA גנומי שמרים הוא מחוון התאגדות ribonucleotide, המאפשר את השימוש ribonucleotides כמו סמנים ביולוגיים של ה-DNA פולימראז פעילות12,13,14. גישה זו, באמצעות מטרה רצף ה-DNA סמוך המקור ARS306 יעיל של שכפול, צריך להיות נוטה גנומית מיקומים אחרים, היעד גנים וכן.- PCR-להגביר 520-בסיס זוג קטע גן מדווח URA3 באמצעות צמד פריימר הבאים: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) ו- URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
- לבצע את התגובה PCR באמצעות 10-20 ng של שמרים DNA גנומי כתבנית, 4 μL של כל פריימר (10 מניות μM), μL 10 של 10 x Ex מאגר Taq (מ ג2 + פלוס), μL 8 תערובת dNTP (2.5 מ מ כל אחד), 0.5 μL של Ex דנ א. אנזימים (U 5/μL) , ולכוונן את העוצמה הסופי כדי μL 100 עם H2O.
- הפעלת התוכנית הבאה של ה-PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 55 ° C עבור 1 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות והחזק ב 4 º C.
- לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR ו elute ה-DNA באמצעות 50 מ של H2O. זה יכול כעת לשמש כתבנית בתגובה radiolabeling.
- להשתמש את תחל הבאה עבור סטרנד ספציפי radiolabeling: שימוש URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) להמחשת DNA anneals כדי בדיקה א זה מקביל הדי גדיל מוביל המתהווה כאשר URA3 ניתוח 2, את tnascent מפגרות גדיל DNA כאשר URA3 OR1. השתמש URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) להמחשת DNA המתהווה anneals כדי בדיקת B. זה תואם את הדי גדיל מוביל המתהווה כאשר URA3 OR1 ו לקרטע nascent גדיל DNA כאשר URA3 ניתוח 2 (איור 3).
- לבצע את התגובה radiolabeling באמצעות 10-20 ng מוגבר URA3 שבר כמו תבנית ה-DNA, μL 2 פריימר (10 מניות μM), 5 μL של 10 x Ex Taq מאגר (מ ג2 + פלוס), 4 μL של 2.5 מ מ dNTPs (מינוס dCTP), μL 5 (50 μCi) של -32P-dCTP , 0.5 μL של ExTaq ה-DNA פולימראז (5 U μL) ולהתאים את עוצמת הקול הסופי כדי μL 50 עם H2O. בניהול הבאות תוכנית עבור radiolabeling: 94 ° C עבור 5 דקות; 25 מחזורי 94 ° C במשך 1 דקה, 55 ° C ל 30 s, 72 ° C עבור 1 דקות; 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות והחזק ב 4 º C.
- להשתמש בעמודת ספין G-25 להסיר את התווית רדיואקטיבי טריטוריה. לפני הוספת מדגם radiolabeled, centrifuge את העמודה עבור 1 דקות ב- 720 x מאגר g ולהסיר על-ידי pipetting. לטעון את התגובה radiolabeled המוצר ואת צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 720 x g כדי elute את המכשיר עם תוויות.
- דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי denature את המכשיר מייד לפני הכלאה. מגניב בקצרה על קרח.
- הכלאה בדרום
- לגלגל את הקרום wetted לתוך צינור הכלאה, להוסיף 25 מ ל שזה עתה הוכנו הכלאה המאגר: 0.5 M סודיום פוספט מאגר, pH 7.2, 7% סולפט נתרן dodecyl (מרחביות), 1% אלבומין שור (BSA). דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 1-2 h עם סיבוב בתנור הכלאה.
- בזהירות יוצקים את הפתרון ולהוסיף 25 מ של הכלאה מאגר ובנוסף המכשיר radiolabelled. דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h עם סיבוב.
- יוצקים את הפתרון לתוך מיכל פסולת רדיואקטיבית. ביצוע שוטף 5 של 5 דקות כל בטמפרטורת החדר עם פוספט-מרחביות שטיפה פתרון א': 40 מ מ סודיום פוספט מאגר, pH 7.2, 5% מרחביות, BSA 0.5%, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0.
- ביצוע שוטף 2 של 15 דקות כל ב 65 ° C עם פוספט-מרחביות שטיפה פתרון II: מאגר סודיום פוספט 40 מ מ, pH 7.2, 1% מרחביות, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0.
- הסרת הקרום מהצינור הכלאה באמצעות פינצטה ולמקם נפתח שרוול פלסטיק מגן. מכסה, לחשוף צלחת הדמיה. נסה מספר פעמים ועד 4 h 4 d חשיפה שונות.
- במידת הצורך, חשפנות, בדיקה מחדש את האבן החשופה באמצעות בדיקה שונים כ 3 - 4 פעמים. להתפשט, דגירה הקרום עבור 2 h ב- 65 מעלות צלזיוס ב 25 מיליליטר 50% formamide, 2 x SSPE פתרון.
הערה: x SSPE 20 מניות פתרון: 3 M NaCl, 0.2 מ' NaH2PO4, מ 0.02 נקודות EDTA, pH 7.4. - יוצקים את הפתרון לתוך מיכל פסולת רדיואקטיבית. ביצוע שוטף 2 של 15 דקות כל ב 65 ° C פוספט-מרחביות שטיפה הפתרון השני.
- בדוק את הקרום עם מונה גייגר ' וחזור על פרוטוקול חשפנות, אם האות נשארת.
- מבצעים טרום הכלאה הכלאה כמתואר לעיל.
2. מדידת קצב מוטציה וספציפיות של זנים cerevisiae ס
- להכין את התרבות התא
- לחסן מושבה בודדת (שמרים בריא תאים לוקח 2-3 ימים ב- 30 מעלות צלזיוס על טופס מתאים בגודל מושבות) גדל על אגר YPD בתוספת 100 מ"ג/מ"ל אדנין לתוך מ ל מרק YPDA בתוספת 250 מ"ג/מ"ל אדנין (תוספת של אדנין אינו נחוץ רק אם המתח היה הוא auxotroph אדנין). גדלים של חממה בשייקר או על מסובב ב 30 ° C עד התרבות מגיע רוויה (36-48 שעות עבור זן ללא פגם חמור צמיחה).
- ספין למטה התאים ב g x ~ 2000 במשך 5 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את התאים עם 5 מ ל מים סטריליים.
- Resuspend התאים 500 מ"ל מים סטריליים.
- דילול של תרבית תאים, ציפוי
- עבור פקדים ללא בחירה, לדלל את התאים במנת 96-ובכן לפי פקטור של 1,600,000 וצלחת 100 מ של כל תרבות על צלחת מלאה (COM).
- כדי לבחור למוטאנטים ura3 , צלחת 100 מ של תאים מדולל על צלחת 5-דניאל עבור זן (WT) פראי-סוג. לדלל את התאים בהתאם אם קצב מוטציה המתח עניין צפוי להיות גבוה יותר בזן WT.
- כדי לבחור למוטאנטים can1 , לדלל את התאים 5 פי, צלחת 100 מ לצלחת המכילים canavanine (יכול) עבור זן WT. הגורם דילול הוא 0.5.
- דגירה הלוחות ב 30 ° C עד שמרים מושבות טופס. עבור זנים ללא פגם צמיחה, 2-3 ימים מספיקה בדרך כלל עבור COM ויכול צלחות ו- 3-5 ימים עבור לוחות 5-דניאל. כדי להשוות את המחירים מוטציה בין זנים שונים, עדיף לבחור באותו היום של צמיחה לספור מושבות. חנות את הלוחיות מוכן להיספר בחדר הקר (~ 4 ° C).
- חישוב קצב מוטציה ספונטנית
- לספור מושבות גלוי שהלוח ולקחת הערות של המושבה מספרים
- לחשב את קצב מוטציה באמצעות נוסחת דרייק: μ = ln ÷ נ (μNt). f הוא תדירות מוטציה מחושב לפי מספר מוטציות מחולק מספר תאים בתרבות הסופי. Nt הוא מספר התאים בתרבות הסופי והוא μ קצב מוטציה. המשוואה הזו ניתן לפתור על ידי שיטה איטרטיבית כגון שיטת ניוטון-רפסון. ישנן שיטות אחרות משערך, כולל הבדיקה לאה, קולסון, כדי לחשב את קצב מוטציה15.
- חישוב מרווח הביטחון בהנחה יומן להתפלגות הנורמלית של שיעור utation של הפרט מבודד. 95% הסמך משמש לרוב.
- ניתוח ספקטרום מוטציה
- מושבה בודדת של כל 5-דניאל או יכול צלחת ולרענן על צלחת YPDA.
- לבצע המושבה PCR כדי להגביר את ג'ין URA3 או CAN1 ואת רצף כדי לזהות מוטציות באמצעות תחל את הבאים: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') ו URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') עבור שני הגברה PCR ו רצף של הגן URA3 bp 800; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') ו- CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') עבור הגברה ו- CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3 "), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') ו- (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') עבור רצף של הגן כתב 1800 CAN1 bp.
- כדי לבצע המושבה PCR, resuspend מושבה בודדת ב- 5 μL של H2O ולהשתמש 1 μL כתבנית. להוסיף 1 μL של כל אחד תחל (5 מניות μM), μL 2 מאגר x KAPA2G 5 (מ ג2 + פלוס), 0.5 μL של dNTP (2.5 מ מ), 0.5 μL של KAPA2G מהר DNA פולימראז, μL 12 של H2O.
- עבור ההגברה של URA3 ג'ין, להפעיל את התוכנית הבאה של ה-PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 5 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C ל 30 s; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C ל 30 s; 72 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות והחזק ב 4 º C. עבור ההגברה של ג'ין CAN1 , להפעיל את התוכנית הבאה של ה-PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 5 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 61 ° C 15 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 45 s; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 61 ° C 15 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 45 s; 72 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות והחזק ב 4 º C.
- יישר את התוצאות רצף לרצף הפניה באמצעות תוכנית כגון DNASTAR Seqman Pro או Sequencher לזיהוי מוטציות.
- לקמפל את הנתונים מוטציות לפי סוג המוטציה (איור 4) או מיקום המוטציה (איור 5). לחשב תעריפי המוטציה תדירות מוטציה (מספר האירועים נצפתה מחולק מספר מוטציות וסודרו) כפול התעריף מוטציה הכללית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טיפול ה-DNA גנומי עם אלקליות ואחריו בג'ל אלקליין מאפשרת גילוי חצי כמותית של DNA במבנה השביר עקב שפע ribonucleotides stably incorporated. איור 2 מציג את התמונות ג'ל של שמרים דנ א גנומי מטופלים עם או בלי קו5. גרסה M644L של Pol2, יחידת משנה קטליטי של Polε, הפחיתה את היכולת לשלב ribonucleotides בזמן המוטציה M644G משלבת ribonucleotides יותר מאשר WT פולימראז. כמפורט בפרוטוקול, הג'ל אלקליין נוסף פתור על ידי ניתוח ספציפי סטרנד תספיג דנ א. עם הידע של המיקום של האתר גנומית, הנייר ביחס מקורותיה סמוכים, יכול מנצלים באופן סלקטיבי ribonucleotides שולבו את המתהווה מובילים או מפגרות גדילי. איור 3 מראה את התוצאות תספיג חיטוט את גן מדווח URA3 מוכנס שני כיוונים מנוגדים קרוב בדר שכפול ירי מוקדם, ARS30616. באמצעות מובילים הגששים ספציפיים סטרנד, נתבונן אל התבנית פיצול DNA הנגרם על ידי אלקלי-המחשוף ב ribonucleotides בדנ א nascent המובילים סטרנד זן WT, זנים לבטא וריאנטים של polymerases α אלפא, חדוה כי הם מופקר בשביל ribonucleotide ההתאגדות.
באמצעות ניסוי תנודות, אנו יכולים למדוד את קצבי מוטציה זני שמרים המכיל גנים הכתב. איור 4 מציג את המחירים מוטציה ההחלטיים3 ו CAN1 לוקוסים זנים פולימראז WT או המוטציה pol2-M644G עם או בלי H2 RNase פונקציונלי. העדר RNase H2 גורמת עלייה מתונה במחירי מוטציה הכוללת את הרקע בשני. עם זאת, היחודיות מוטציה מדוקדקת יותר של זנים חסר RNase H2 (איור 5), יש עלייה חזקה קצב מוטציה מחיקות קצר, בפרט רצפים חוזרים טנדם. איור 5A משווה בין יחודיות מוטציה ב WT ו rnh זנים201Δ ומציגה דמות 5B ההשפעה mutational של עוד יותר גבוהות ribonucleotide השתלבות צירוף ד. נ המוביל nascent ידי Pol חדוה.
איור 1: פרוטוקול שלבים המעורבים סטרנד ספציפיים איתור האתרים הרגישים אלקליות הנגרמת על ידי ההתאגדות ribonucleotide לתוך ה-DNA גנומי שמרים- מבט כולל על השלבים העיקריים השונים המעורבים בהליך זה, החל עם בידוד דנ א גנומי שמרים, ממשיך דרך הניתוח הסופי תספיג דנ א. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תמונת הנציגה של תוצאות מתקבל על ידי אלקטרופורזה בג'ל אלקליין agarose. איור זה הותאם של ניק McElhinny, א ס. et al. 5. שמרים ה-DNA גנומי של זנים של אחרים שונים התייחסו עם אשלגן כלורי (נייטרלי) או קו (אלקליין) ואז מופרדים על ג'ל ניטרלי או אלקליין agarose. א"ו-"M644G"מציינים את מצב Pol חדוה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: סטרנד ספציפיים חיטוט של ג'ל אלקליין agarose על ידי תספיג דנ א. איור זה כבר ממאמרו של וויליאמס, י. ס. ואח 13. (א) הגששים radiolabeled anneal צירוף ד. נ המוביל המתהווה בתוך הגן כתב URA3 זה הוכנס קרוב ARS306 שני הכיוונים הנגדי (OR1 וניתוח 2). (B) התוצאות נציג של הדרומי סופג באמצעות את הגששים סטרנד ספציפיים המובילים המתהווה. המוצגים הם התוצאות החקרנית עבור סטרנד המובילים nascent בזן עם WT DNA polymerases, או את pol1-L868M, pol2-M644G או את pol3-L612M זנים משתנה עם או בלי RNase H2. הגנים POL1, POL2, ו POL3 לקודד קטליטי subunits של Pols α, חדוה, אלפא, בהתאמה. המשתנים הם יותר מתירני ribonucleotide התאגדות5,12,17. (ג) כימות של האות רדיואקטיבי על ידי שבר הסכום הכולל של כל ליין (B). הערכים מבוטאים כאחוזים של הסכום הכולל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מוטציה ספונטנית בבתי זני שמרים- איור זה הותאם של ניק McElhinny, א ס. et al. 5. הגנים כתב URA3 , CAN1 שימשו וזמינותו מוטציה קדימה כדי למדוד את המחירים מוטציה של זנים המצוין. הכתבת URA3. "אוריינטציה 2" (ניתוח 2, איור 3A). 95% הסמך (CI) כלולה עבור כל אחת מהמידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מוטציה spectra עבור הגן כתב URA3-ניתוח 2. איור זה הותאם19,18,5,פרסומים קודמים20. מיקום וסוג המוטציה נצפו כל המושבה 5-דניאל-עמידה עצמאית שנבחרו וזמינותו מוטציה קדימה מתוארים ב 804 bp URA3 רצף קידוד. אותיות מצביעים על בסיס החלפות, משולשים פתוחים מציינים מחיקות בסיס יחיד, משולשים סגורים מציינים הוספות בסיס יחיד, קווים אחידים מציינים מחיקות קצר. (א) ספקטרה מוטציה בזנים WT ו- rnh201Δ . תוויות אדומות מעל הרצף הם מוטציות שנצפתה WT בזמן תוויות כחול מתחת הרצף אלו הנהוגות זן rnh201Δ . (B) ספקטרה מוטציה בזנים pol2-M644G ו- pol2-M644G rnh201Δ . תוויות אדומות מעל הרצף הם מוטציות שנצפתה pol2-M644G ואילו הכחולים מתחת הרצף עבור זנים pol2-M644G rnh201Δ . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים עבור שתי קבוצות של ניסויים המשמשים לעתים קרובות לנתח באופן כמותי למחצה ribonucleotides שולבו במהלך שכפול ה-DNA ואת ההשפעות המוטגניות של ribonucleotides לא מתוקן. למרות גישות אלה כוללות את מודל איקריוטים cerevisiae ס, טכניקות אלו ניתן להתאים בקלות על חיידקים ועל פרוקריוטים גבוהה יותר האחרות.
בודק את ribonucleotides לא מתוקן ב- DNA באמצעות אלקטרופורזה אלקליין agarose בשילוב עם סופג הדרומי מספק מידע חשוב לגבי מספר ribonucleotides נוכח ומלון סטראנד שאליה הם כבר שילבו. עם זאת, חשוב לציין שאלקלי-הרגישות הזו יכולה להיגרם גם על ידי נגעים DNA אחרים, כגון אתר abasic. אמצעי נוסף של גילוי ribonucleotides בדנ א הוא על ידי הטיפול עם האנזים RNase H2 מטוהרים, כפי שעשו תאים בתרבית של21. למרות הגישה שלנו כרוך חיטוט אלקליות רגיש באתרים המובילים nascent לעומת מפגרות גדילי-הגן כתב URA3 שימוש בניסויים שלנו ניתוח mutational, זה ניתן לעצב את הגששים זה anneal במקומות אחרים על מנת כדי לקבל מידע חשוב לגבי צפיפות ribonucleotide באתרים אחרים גנומית. החלק תספיג דנ א של ההליך יכול גם לשמש כהפניה לניסויים החקרנית אחרות DNA כלליים.
מדידה של מוטציה המחירים באמצעות מבחן תנודות כבר בשימוש נרחב לניתוח של אירועים שונים המוטגניות של מיקרואורגניזמים, ובכך לא מוגבל ניתוח ההשלכות המוטגניות של ribonucleotides ב- DNA. עבור ניסוי זה, הגדלת מספר תרבויות עצמאית יכולה להגביר מאד את הדיוק מדידה. ניתן להשיג את המושבות עצמאית ומבטא זן של ריבית על גבי YPDA בינוני או על ידי הניתוח של מושבות נבג עצמאית מתקבל על ידי דטרמיניזם דיסקציה של כתם שמרים דיפלואידי. באופן אידיאלי, השימוש במספר זני שמרים הפלואידי עצמאית (למשל., מן דטרמיניזם דיסקציה) מעודד כדי למזער את ההשפעה של זן-כדי-זן וריאציה. הדבר חשוב במיוחד כאשר קצב מוטציה ספונטנית גבוהה או כאשר המתח יש פגם צמיחה. שיטה נוספת זה יכול להיות מועסק כדי למדוד ספונטנית קצב מוטציה היא הצטברות למוטציה ניסוי22. ניתוח זה, תדירות מוטציה נקבע עבור התאים לאחר צמיחה נרחב, ניתן להשתמש כדי לחשב עבור קצב מוטציה. צימוד של ניסוי הצטברות מוטציה בטכנולוגיה רצף עמוק הוכח להיות כלי רב עוצמה כדי לנתח את קצב מוטציה וספציפיות ברחבי הגנום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לכל בהווה ובעבר Kunkel מעבדה החברים על עבודתם, דיונים הקשורים פרוטוקול נתונים שהוצגו כאן לעשות בה שימוש חוזר. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Z01 ES065070 כדי T.A.K. של המחלקה של מגזר בחקר המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), לאומי המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
