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Biology

अध्ययन Ribonucleotide निगमन: किनारा-खमीर जीनोम में Ribonucleotides के विशिष्ट पता लगाने और Ribonucleotide प्रेरित Mutagenesis को मापने

Published: July 26, 2018 doi: 10.3791/58020
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS
* These authors contributed equally

Summary

Ribonucleotides सबसे प्रचुर मात्रा में गैर-विहित eukaryotic परमाणु डीएनए प्रतिकृति के दौरान जीनोम में शामिल न्यूक्लियोटाइड के बीच में हैं । अगर ठीक से नहीं निकाला गया तो ribonucleotides डीएनए को नुकसान और mutagenesis पैदा कर सकता है । यहां, हम दो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है कि डीएनए और उसके mutagenic प्रभाव में ribonucleotide निगमन की बहुतायत का आकलन किया जाता है प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

परमाणु डीएनए में ribonucleotides की मौजूदगी को जीनोमिक अस्थिरता का स्रोत दिखाया गया है. ribonucleotide की हद तक क्षारीय hydrolysis और जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के रूप में आरएनए उच्च क्षारीय स्थितियों में hydrolysis के लिए अतिसंवेदनशील है । यह, दक्षिणी दाग विश्लेषण के साथ संयोजन में स्थान और किनारा जिसमें ribonucleotides शामिल किया गया है निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह प्रक्रिया केवल अर्द्ध मात्रात्मक है और ribonucleotide सामग्री में छोटे परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हो सकता है, हालांकि कतरा विशिष्ट दक्षिणी दाग जांच संवेदनशीलता में सुधार । डीएनए में ribonucleotides के सबसे हड़ताली जैविक परिणामों में से एक का एक उपाय के रूप में, सहज mutagenesis एक आगे उत्परिवर्तन परख का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । उपयुक्त रिपोर्टर जीन का प्रयोग, दुर्लभ उत्परिवर्तनों कि समारोह के नुकसान में परिणाम और चयनित किया जा सकता समग्र और विशिष्ट उत्परिवर्तन दरों रिपोर्टर जीन के डीएनए अनुक्रमण के साथ उतार चढ़ाव प्रयोगों से डेटा के संयोजन से मापा जा सकता है । अस्थिरता परख के लिए विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि या विकास की स्थिति में mutagenic प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता की जांच लागू है ।

Introduction

eukaryotic परमाणु डीएनए प्रतिकृति के दौरान, ribonucleotides सभी तीन प्रमुख डीएनए प्रतिकृतियां, डीएनए polymerases (Pols) α, ε, और δ1,2द्वारा जीनोम में शामिल कर रहे हैं । RNase H2-आश्रित ribonucleotide आबकारी मरंमत (RER3) इन एंबेडेड ribonucleotides के बहुमत को हटा ।

डीएनए में एक ribonucleotide hydrolysis की संभावना है, के रूप में चीनी moiety के 2 ' हाइड्रॉक्सिल समूह आसंन phosphodiester बांड पर हमला कर सकते हैं, एक 2 '-3 चक्रीय फॉस्फेट के साथ एक छोर जारी है और एक के साथ दूसरे 5 '-ओह4। alkaline स्थितियों बहुत इस प्रतिक्रिया में तेजी लाने कर सकते हैं । इस प्रकार, एक बुनियादी समाधान में गर्मी के दौरान एंबेडेड ribonucleotides के hydrolysis जीनोमिक डीएनए के विखंडन का कारण बनता है, जो alkaline-agarose ट्रो5द्वारा visualized किया जा सकता है । यह डीएनए एक झिल्ली को हस्तांतरित किया जा सकता है और दक्षिणी ब्लाट विश्लेषण द्वारा जांच किनारा-विशिष्ट जांच है कि क्षार संवेदनशील नवजात अग्रणी-या विश्र्व-किनारा डीएनए में शामिल ribonucleotides की वजह से साइटों की पहचान की अनुमति का उपयोग कर, क्रमशः.

खमीर कोशिकाओं में कमी RNase H2 गतिविधि, ribonucleotides को हटाने शुरू किया जा सकता है जब चतुर्थ तोपोइसोमेरसे मैं (Top1) एंबेडेड ribonucleotide6,7पर डीएनए निक । हालांकि, जब Top1 ribonucleotide के 3 ' पक्ष पर सट जाता है, इस 5 '-OH और 2 '-3 ' चक्रीय फॉस्फेट डीएनए समाप्त होता है कि रेलिगेशन करने के लिए दुर्दम्य हैं उत्पन्न करता है. मरंमत करने में विफलता, या इन ' गंदे सिरों के ंयायपालिका प्रसंस्करण जीनोमिक अस्थिरता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, अगर चीरा एक दोहराने डीएनए अनुक्रम के भीतर होता है, मरम्मत की प्रक्रिया को हटाने उत्परिवर्तनों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह मिलकर दोहराया जाता है के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त है, जहां छोटे विलोपन (के बीच दो और पांच आधार जोड़े) सामांयतः RNase H2-कमी कोशिकाओं में मनाया जाता है । खमीर RNase H2 गतिविधि के अभाव में Top1-निर्भर बचके प्रभाव एक डीएनए पोलीमरेज़ ε उत्परिवर्ती (pol2-M644G) नवजात प्रमुख किनारा संश्लेषण के दौरान ribonucleotide के लिए अनेक में ख़राब कर रहे हैं ।

डीएनए में ribonucleotides के प्रसंस्करण के लिए सहज उत्परिवर्तनों की ओर जाता है और इस mutagenesis उपयुक्त रिपोर्टर जीन का उपयोग करके और साथ phenotypic परिवर्तन के लिए चयन द्वारा पता लगाया जा सकता है । एक उतार-चढ़ाव परीक्षण या Luria और Delbrück प्रयोग सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक के लिए सहज उत्परिवर्तन चयन रिपोर्टर8,9जीन का उपयोग दरों को मापने है । खमीर में, URA3 और CAN1 जीन एक आगे उत्परिवर्तन परख, जो सभी उत्परिवर्तन प्रकार है कि जीन समारोह के नुकसान में परिणाम का पता लगाने के लिए अनुमति देता में संवाददाताओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । सहज उत्परिवर्तन दर है कि कई समानांतर संस्कृतियों के लिए मनाया के औसत के रूप में अनुमानित है लक्ष्य रिपोर्टर जीन में उत्परिवर्तनों के बिना एकल कालोनियों से शुरू कर दिया । rnh201Δ के रूप में एक खमीर RNase H2 की कमी तनाव एक मामूली ऊंचा समग्र सहज उत्परिवर्तन दर है कि काफी हद तक मिलकर दोहराने दृश्यों में 2-5 बीपी विलोपन के एक ऊंचा घटना के कारण होता है । इस प्रकार, पूरी तरह से जीनोम में ribonucleotides के mutagenic प्रभाव को चिह्नित करने के लिए, विशिष्ट उत्परिवर्तन दरों को निर्धारित किया जाना चाहिए । इस मामले में, URA3 या CAN1 रिपोर्टर जीन को परिलक्षित किया जा सकता है और उत्परिवर्तनों के प्रकार और स्थानों का निर्धारण करने के लिए अनुक्रम, और विशिष्ट उत्परिवर्तन दरों की गणना की जा सकती है । एकाधिक स्वतंत्र URA3 या CAN1 म्यूटेंट में पहचाने गए उत्परिवर्तनों का संकलन तो एक उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

1. क्षारीय Hydrolysis और कतरास-विशिष्ट दक्षिणी दाग (चित्रा 1)

  1. कोशिका वृद्धि और जीनोमिक डीएनए अलगाव
    1. अलग खमीर जीनोमिक डीएनए निर्माता के निर्देशों का पालन एक खमीर डीएनए शोधन किट का उपयोग कर । संस्कृतियों है कि विकास के घातीय चरण में है का प्रयोग करें (०.५ और 1 के एक ऑप्टिकल घनत्व के बीच) । 1x ते बफर के ३५ मिलीलीटर में अंतिम डीएनए गोली resuspend (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ७.५, 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)) ।
    2. 5 मिलीग्राम/एमएल RNase एक डीएनए के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    3. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच ५.२) के ०.१ संस्करणों और बर्फ पर 20 मिनट के लिए १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों का उपयोग कर डीएनए हाला ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १६,००० x g पर केंद्रापसारक । किसी पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें ।
    5. दो बार ७०% इथेनॉल के ५०० मिलीलीटर के साथ गोली धो लो । किसी पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें ।
    6. पीठ पर गोली सूखी और 1x ते बफर के ३५ मिलीलीटर में resuspend ।
    7. Quantitate dsDNA बीआर परख किट के साथ एक fluorimeter (सामग्री की मेज) का उपयोग कर डीएनए ।
    8. हाला 5 प्रत्येक नमूने से डीएनए की मिलीग्राम 3 एम सोडियम एसीटेट के ०.१ संस्करणों का उपयोग, पीएच ५.२ और २.५ संस्करणों १००% ेतोः की कुल मात्रा के लिए २०० मिलीलीटर (जोड़ें एच2ओ यदि आवश्यक हो तो, अतिरिक्त 5 डीएनए की मिलीग्राम की जरूरत है अगर तटस्थ जेल नियंत्रण आवश्यक है) । 20 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १६,००० x g पर केंद्रापसारक । किसी पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें ।
    10. पीठ पर गोली सूखी । एच 2 ओ के 14 एमएल में डीएनए को फिर से सस्पेंड करदो।
  2. क्षार hydrolysis आणि जेल ट्रो
    1. 2 एच के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर 1 मीटर KOH और मशीन के 6 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों की मशीन ।
    3. जोड़ें 6x alkaline डीएनए लोड हो रहा है बफर के 4 मिलीलीटर: ३०० mm KOH, 6 मिमी EDTA, पीएच ८.०, 18% polysucrose (सामग्री की मेज), ०.१५% bromocresol ग्रीन, और ०.२५% xylene cyanol एफएफ ।
    4. एक alkaline जेल है कि 1% agarose, ५० mm NaOH, 1 mm EDTA, पीएच ८.० शामिल है डाली । एक कंघी है कि डीएनए नमूने के 24 मिलीलीटर के लिए अनुमति देता है के लिए प्रति लेन लोड किया जा उपयोग करें ।
    5. 1x alkaline ट्रो बफर में कमरे के तापमान पर जेल भागो: ५० मिमी NaOH, 1 मिमी EDTA, पीएच ८.० । एक उचित डीएनए आकार मार्कर शामिल करें ।
    6. नीचे ट्यूबों संक्षेप में स्पिन और alkaline agarose जेल में पूरे 24 मिलीलीटर नमूना लोड । 30 मिनट के लिए Electrophorese 30 वी, 10 वी में 18-20 ज द्वारा पीछा किया ।
    7. बेअसर बफर में कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर ४५ मिनट प्रत्येक के 2 गर्मी के लिए जेल मैं: 1 एम Tris-एचसीएल, १.५ मीटर NaCl ।
    8. SYBR सोने के 1/10000 कमजोर पड़ने से युक्त पानी की २०० मिलीलीटर में बेअसर जेल भिगोने से डीएनए दाग के साथ कमरे के तापमान पर 2 ज के लिए कोमल मिलाते हुए दाग ।
    9. एक यूवी transilluminator का उपयोग डीएनए कल्पना । बढ़ी हुई क्षार-संवेदनशीलता डीएनए5में unrepaired ribonucleotides का एक उच्च घनत्व का संकेत है, छोटे डीएनए अंशों की उपस्थिति का कारण बनता है ।
  3. दक्षिणी स्थानांतरण
    1. केशिका कार्रवाई10द्वारा सकारात्मक आरोप नायलॉन झिल्ली के लिए alkaline जेल से डीएनए स्थानांतरण । कैसे इस हस्तांतरण की स्थापना की जा सकती का एक उदाहरण Sambrook और रसेल मैनुअल10में प्रदान की जाती है ।
    2. alkaline स्थानांतरण बफर में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए alkaline जेल भिगोना: ०.४ मी NaOH, १ मी NaCl.
    3. गीला नायलॉन झिल्ली (जेल के आकार के लिए काट) पानी के साथ संक्षेप में, और फिर alkaline स्थानांतरण बफर में 5 मिनट के लिए लेना ।
    4. एक गिलास बेकिंग डिश में 3 ग्लास यूरिन (१०० mL) को उलटा करके ट्रांसफर प्लेटफॉर्म को सेट करें । इस डिश को agarose जेल के साइज से थोड़ा बड़ा होना चाहिए । उनमें से ऊपर एक गिलास प्लेट सेट करें ।
    5. कपड़े 2 3 मिमी CHR क्रोमैटोग्राफी कागज के बड़े टुकड़े (जेल प्लस की चौड़ाई के आकार को काट अब पक्ष है कि बफर जलाशय में किनारों पर कपड़े) कांच की प्लेट पर कर सकते हैं ।
    6. क्रोमैटोग्राफी कागज पर alkaline स्थानांतरण बफर डालो और आधा गिलास पकवान भरें । एक 5 मिलीलीटर कांच पिपेट का उपयोग कर बुलबुले बाहर चिकनी ।
    7. शीर्ष पर agarose जेल प्लेस, फिर बुलबुले बाहर चिकनी । parafilm के साथ जेल के सभी किनारों चारों ओर । जेल पर alkaline हस्तांतरण बफर की एक छोटी राशि डालो ।
    8. जेल के शीर्ष पर पूर्व लथपथ नायलॉन झिल्ली रखें । बुलबुले बाहर चिकनी ।
    9. गीला कागज के 2 टुकड़े agarose जेल के आकार को काट । उंहें झिल्ली के शीर्ष पर रखें, और किसी भी बुलबुले बाहर चिकनी ।
    10. एक बड़े कागज तौलिए के ढेर प्लेस (एक आकार के लिए कट agarose जेल से थोड़ा बड़ा) हस्तांतरण सैंडविच के शीर्ष पर । ध्यान से कागज तौलिए के ऊपर एक गिलास प्लेट जगह है । शीर्ष करने के लिए एक भारित वस्तु जोड़ें (४०० जी के एक बड़े पैमाने के साथ एक किताब अच्छी तरह से काम करता है) ।
    11. हस्तांतरण को कमरे के तापमान पर रात भर गुजार दें ।
    12. ध्यान से स्थानांतरण ढेर के अलावा ले और बेअसर बफर द्वितीय में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए झिल्ली सोख: ०.५ एम Tris-एचसीएल, पीएच ७.२, 1 एम NaCl ।
    13. Crosslink एक यूवी crosslinker का उपयोग कर आरोपी नायलॉन झिल्ली को डीएनए । क्रॉस-linker में झिल्ली प्लेस और autocrosslink सेटिंग का उपयोग करें ।
  4. दक्षिणी जांच की तैयारी
    नोट: दृष्टिकोण यहां वर्णित में क्षार-संवेदनशील साइटों का पता लगाने के नवजात अग्रणी-बनाम विश्र्व-डीएनए कतरा के किनारा एक पहले11प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित है । हमारे प्रयोग के लिए, जांच URA3 रिपोर्टर जीन पर किया जाता है जो दो झुकाव (OR1 या OR2) गुणसूत्र III (3 ए आंकड़ा) पर ARS306 प्रतिकृति मूल के निकट में से एक में डाला गया है । खमीर जीनोमिक डीएनए में क्षार के प्रति संवेदनशील साइटों की उपस्थिति ribonucleotide निगमन का एक संकेतक है, डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि12,13,14के के रूप में ribonucleotides के उपयोग की अनुमति । इस दृष्टिकोण, एक लक्ष्य डीएनए प्रतिकृति के कुशल ARS306 मूल के निकट अनुक्रम का उपयोग कर, अंय जीनोमिक स्थानों और लक्ष्य जीन के रूप में अच्छी तरह के लिए उत्तरदाई होना चाहिए ।
    1. पीसीआर-बढ़ाना एक ५२०- URA3 रिपोर्टर जीन के आधार जोड़ी खंड निंनलिखित प्राइमर जोड़ी का उपयोग: URA3-F1 (5 ´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) और URA3-R1 (5 ´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC) ।
    2. एक टेम्पलेट के रूप में खमीर जीनोमिक डीएनए के 10-20 एनजी का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन, प्रत्येक प्राइमर के 4 μL (10 माइक्रोन स्टॉक), 10x ex Taq बफर के 10 μL (मिलीग्राम2 + प्लस), dNTP मिश्रण के 8 μL (२.५ मिमी प्रत्येक), ०.५ μL के पूर्व Taq डीएनए पोलीमरेज़ (5 यू/μL) , और एच2ओ के साथ १०० μL को अंतिम मात्रा समायोजित करें ।
    3. निंनलिखित पीसीआर कार्यक्रम चलाने के लिए: ९५ ° c 5 मिनट के लिए; 1 मिनट के लिए ९५ ° c के 30 चक्र, 1 मिनट के लिए ५५ ° c, 2 मिनट के लिए ७२ ° c; ७२ ° c 10 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
    4. पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग कर, डीएनए को शुद्ध करें और एच2ओ के ५० एमएल का इस्तेमाल कर DNA को elute । यह अब radiolabeling प्रतिक्रिया में टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है ।
    5. कतरास-विशिष्ट radiolabeling के लिए निम्नलिखित प्राइमरों का प्रयोग करें: डीएनए visualizing के लिए URA3-ए (5 ´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) का उपयोग करें जो जांच के लिए anneals । यह नवजात अग्रणी कतरा डीएनए से मेल खाती है जब URA3 OR2 में है और tnascent विश्र्व किनारा डीएनए जब URA3 OR1 में है । नवजात डीएनए की कल्पना करने के लिए URA3-बी (5 ´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) का प्रयोग करें जो जांच के लिए anneals बी । यह नवजात अग्रणी कतरा डीएनए से मेल खाती है जब URA3 OR1 और नवजात विश्र्व किनारा डीएनए में है जब URA3 OR2 (चित्रा 3) में है ।
      1. radiolabeling प्रतिक्रिया का उपयोग कर 10-20 एनजी टेंपलेट डीएनए के रूप में प्रवर्धित URA3 टुकड़ा प्रदर्शन, 2 प्राइमर के μL (10 माइक्रोन स्टॉक), 10x पूर्व Taq बफर के 5 μL (मिलीग्राम2 + प्लस), २.५ मिमी dNTPs के 4 μL (ऋण dCTP), 5 μL (५० μCi) के एक-३२पी-dCTP , ०.५ μL के ExTaq डीएनए पोलीमरेज़ (5 U/μL) और अंतिम खंड को समायोजित करने के लिए ५० μL के साथ एच2ओ । radiolabeling के लिए निम्न प्रोग्राम चलाएँ: ९४ ° c 5 मिनट के लिए; 1 मिनट के लिए ९४ ° c के 25 चक्र, 30 एस के लिए ५५ ° c, 1 मिनट के लिए ७२ ° c; ७२ ° c 5 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
    6. एक जी-25 स्पिन कॉलम का प्रयोग करें को हटाने के लिए शामिल रेडियोधर्मी लेबल । radiolabeled नमूना जोड़ने से पहले, pipetting द्वारा ७२० x g और removethe बफर पर 1 मिनट के लिए कॉलम केंद्रापसारक । radiolabeled प्रतिक्रिया उत्पाद लोड और ७२० एक्स जी में 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक को लेबल जांच elute ।
    7. संकरण से पहले जांच तुरंत स्वभाव करने के लिए 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर मशीन । बर्फ पर संक्षेप में ठंडा ।
  5. दक्षिणी संकरण
    1. एक संकरण ट्यूब में गीला झिल्ली रोल और हौसले से तैयार संकरण बफर के 25 मिलीलीटर जोड़ें: ०.५ एम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच ७.२, 7% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA). एक संकरण ओवन में रोटेशन के साथ 1-2 एच के लिए ६५ ° c पर मशीन ।
    2. ध्यान से समाधान डालना और संकरण बफर प्लस radiolabelled जांच के 25 मिलीलीटर जोड़ें । रोटेशन के साथ 16-18 एच के लिए ६५ ° c पर मशीन ।
    3. एक रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में समाधान डालो । 5 के 5 धो प्रदर्शन फॉस्फेट के साथ कमरे के तापमान पर प्रत्येक मिनट-एसडीएस धुलाई समाधान मैं: ४० mm सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच ७.२, 5% एसडीएस, ०.५% BSA, 1 मिमी EDTA, पीएच ८.० ।
    4. ६५ डिग्री पर प्रत्येक 15 मिनट के 2 बहाकर प्रदर्शन फॉस्फेट-एसडीएस धोने समाधान द्वितीय के साथ: ४० mm सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच ७.२, 1% एसडीएस, 1 मिमी EDTA, पीएच ८.० ।
    5. एक खोला प्लास्टिक आस्तीन रक्षक में चिमटी और जगह का उपयोग कर संकरण ट्यूब से झिल्ली निकालें । कवर और एक इमेजिंग प्लेट को बेनकाब । 4 डी से लेकर 4 एच तक के विभिन्न एक्सपोजर टाइम को ट्राई करें ।
    6. यदि आवश्यक हो, पट्टी और फिर से जांच दाग लगभग 3-4 बार एक अलग जांच का उपयोग कर । पट्टी करने के लिए, एक ५०% formamide, 2x SSPE समाधान के 25 मिलीलीटर में ६५ डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए झिल्ली की मशीन ।
      नोट: 20x SSPE स्टॉक समाधान: 3 एम NaCl, ०.२ m णः2पो4, ०.०२ m EDTA, pH ७.४.
    7. एक रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में समाधान डालो । फास्फेट-एसडीएस धुलाई समाधान द्वितीय में ६५ डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 15 मिनट के 2 बहाकर प्रदर्शन ।
    8. एक Geiger काउंटर के साथ झिल्ली की जाँच करें और संकेत रहता है तो अलग करना प्रोटोकॉल दोहराएँ.
    9. पूर्व संकरण और संकरण के रूप में ऊपर वर्णित प्रदर्शन करते हैं ।

2. cerevisiae उपभेदों में उत्परिवर्तन दर और विशिष्टता को मापने

  1. सेल कल्चर तैयार
    1. Inoculate एक एकल कॉलोनी (स्वस्थ खमीर कोशिकाओं 30 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिन लगते है के लिए उचित आकार कालोनियों फार्म) YPD पर हो गया है १०० मिलीग्राम/एमएल adenine के साथ पूरक YPDA शोरबा के 5 मिलीलीटर में अनुपूरक २५० मिलीग्राम/एमएल adenine के साथ पूरक (adenine की अनुपूरण केवल आवश्यक है अगर इस्तेमाल किया तनाव एक adenine auxotroph है) । एक शेखर मशीन में या एक रोटेटर पर 30 डिग्री सेल्सियस में हो जाना जब तक संस्कृति संतृप्ति तक पहुंचता है (एक गंभीर विकास दोष के बिना एक तनाव के लिए ३६-४८ एच) ।
    2. 5 मिनट के लिए ~ २००० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन ।
    3. supernatant को छोड़ दें और कोशिकाओं को बाँझ पानी की 5 मिलीलीटर से धो लें ।
    4. बाँझ पानी की ५०० मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
  2. कोशिका संस्कृति और चढ़ाना के कमजोर पड़ने
    1. गैर चयन नियंत्रण के लिए, एक पूर्ण (COM) प्लेट पर प्रत्येक संस्कृति के १,६००,००० और प्लेट १०० मिलीलीटर के एक कारक द्वारा एक ९६-well थाली में कोशिकाओं को पतला ।
    2. ura3 म्यूटेंट के लिए चयन करने के लिए, एक जंगली प्रकार (WT) तनाव के लिए एक 5-FOA प्लेट पर undilute कोशिकाओं के प्लेट १०० मिलीलीटर । तदनुसार कोशिकाओं को पतला अगर ब्याज की तनाव की उत्परिवर्तन दर एक WT तनाव की तुलना में अधिक होने की उंमीद है ।
    3. can1 म्यूटेंट के लिए चयन करने के लिए, कोशिकाओं को पतला 5-गुना और एक canavanine युक्त प्लेट पर १०० मिलीलीटर प्लेट (एक WT तनाव के लिए कर सकते हैं) । कमजोर पड़ने का कारक ०.५ है ।
    4. खमीर कालोनियों के रूप में 30 डिग्री सेल्सियस से कम प्लेटों की मशीन । एक वृद्धि दोष के बिना उपभेदों के लिए, 2-3 दिन आम तौर पर COM के लिए पर्याप्त है और कर सकते है प्लेटें और 5-FOA प्लेटों के लिए 3-5 दिन । विभिंन उपभेदों के बीच उत्परिवर्तन दरों की तुलना करने के लिए, यह विकास के एक ही दिन का चयन करने के लिए कालोनियों गिनती सबसे अच्छा है । कोल्ड रूम (~ 4 ° c) में गिने जाने के लिए तैयार प्लेट्स को स्टोर करें ।
  3. सहज उत्परिवर्तन दर की गणना
    1. प्रत्येक प्लेट पर दिखाई कालोनियों गिनती और कॉलोनी संख्या के नोट ले
    2. है ड्रेक फार्मूला का उपयोग कर उत्परिवर्तन दर की गणना: μ = f ÷ ln (μNt) । एफ उत्परिवर्तन आवृत्ति अंतिम संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या से विभाजित म्यूटेंट की संख्या से गणना की है । Nt अंतिम संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या है और μ उत्परिवर्तन दर है । इस समीकरण को न्यूटन-Raphson विधि जैसे किसी चलने विधि से हल किया जा सकता है. वहां अंय अनुमानक तरीके हैं, घास का मैदान और Coulson परीक्षण सहित, उत्परिवर्तन दर15की गणना के लिए ।
    3. व्यक्तिगत अलग-अलग की म् यूटेशन दरों लॉग सामान्य वितरण संभालने विश्वास अंतराल की गणना. ९५% विश्वास अंतराल अक्सर उपयोग किया जाता है ।
  4. उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम का विश्लेषण
    1. प्रत्येक 5-FOA से एक ही कॉलोनी उठाओ या थाली और एक YPDA प्लेट पर ताज़ा कर सकते हैं ।
    2. प्रदर्शन कॉलोनी पीसीआर URA3 या CAN1 जीन और अनुक्रम बढ़ाना करने के लिए निंनलिखित प्राइमरों का उपयोग कर उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए: URA3-F (5 '-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3 ') और URA3-R (5 '-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3 ') पीसीआर प्रवर्धन और दोनों के लिए ८०० बीपी URA3 जीन के अनुक्रमण; CAN1-एफ (5 '-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3 ') और CAN1-आर (5 '-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3 ') के लिए प्रवर्धन और CAN1-एआर (5 '-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3 '), CAN1-9R (5 '-CCTGCAACACCAGTGATA-3 '), CAN1-10R (5 '-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3 ') और CAN1-BR ( 5 '-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3 ') १८०० बीपी CAN1 रिपोर्टर जीन के अनुक्रमण के लिए ।
    3. कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए, एच2ओ के 5 μL में एक एकल कॉलोनी resuspend और 1 μL टेम्पलेट के रूप में उपयोग करें । प्रत्येक प्राइमरी के 1 μL जोड़ें (5 माइक्रोन स्टॉक), 5x KAPA2G बफर के 2 μL (मिलीग्राम2 + प्लस), ०.५ μL के dNTP (२.५ मिमी), ०.५ μL के KAPA2G तेजी से डीएनए पोलीमरेज़, 12 μL के एच2ओ.
    4. URA3 जीन के प्रवर्धन के लिए, निंनलिखित पीसीआर कार्यक्रम चलाने के लिए: ९५ ° c 5 मिनट के लिए; के लिए ९५ ° c के 5 चक्र 10 एस, ६१ ° c के लिए 15 एस, ७२ ° c 30 s के लिए; ३५ के लिए ९५ ° c के चक्र 10 s, ६१ ° c के लिए 15 s, ७२ ° c 30 s के लिए; ७२ ° c 2 मिनट के लिए और 4 ° c पर पकड़ । CAN1 जीन के प्रवर्धन के लिए, निंनलिखित पीसीआर कार्यक्रम चलाने के लिए: ९५ ° c 5 मिनट के लिए; के लिए ९५ ° c के 5 चक्र 10 एस, ६१ डिग्री सेल्सियस के लिए 15 एस, ७२ ° c के लिए ४५ s; ३५ के लिए ९५ ° c के चक्र 10 s, ६१ ° c के लिए 15 s, ७२ ° c के लिए ४५ s; ७२ ° c 2 मिनट के लिए और 4 ° c पर पकड़ ।
    5. DNASTAR Seqman प्रो या Sequencher उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए जैसे एक कार्यक्रम का उपयोग कर एक संदर्भ अनुक्रम के लिए अनुक्रमण परिणाम संरेखित करें ।
    6. उत्परिवर्तन प्रकार (चित्रा 4) या उत्परिवर्तन स्थान (चित्रा 5) द्वारा उत्परिवर्तनों डेटा संकलन । एक उत्परिवर्तन की आवृत्ति द्वारा विशिष्ट उत्परिवर्तन दरों की गणना (घटनाओं की संख्या म्यूटेंट अनुक्रम की संख्या से विभाजित) समग्र उत्परिवर्तन दर से गुणा ।

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Representative Results

क्षारीय जेल ट्रो द्वारा पीछा क्षार के साथ जीनोमिक डीएनए के उपचार छुरा शामिल ribonucleotides की बहुतायत के कारण डीएनए विखंडन के अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाने के लिए अनुमति देता है । चित्रा 2 खमीर जीनोमिक डीएनए के साथ या KOH5के बिना इलाज के जेल छवियों से पता चलता है । Pol2, Polε के उत्प्रेरक उपइकाई के M644L संस्करण, ribonucleotides को शामिल करने की क्षमता कम है, जबकि M644G उत्परिवर्ती ribonucleotides WT से अधिक पोलीमरेज़ शामिल हैं । के रूप में प्रोटोकॉल में विस्तृत, alkaline जेल आगे कतरा-विशिष्ट दक्षिणी दाग विश्लेषण द्वारा जांच की जा सकती है । जांच जीनोमिक अपने निकटवर्ती मूल के सापेक्ष साइट के स्थान के ज्ञान के साथ, हम चुनिंदा नवजात अग्रणी या विश्र्व किस्में में शामिल ribonucleotides जांच कर सकते हैं । चित्रा 3 से पता चलता है दक्षिणी दाग URA3 रिपोर्टर जीन दो विपरीत झुकाव एक प्रारंभिक गोलीबारी प्रतिकृति मूल, ARS30616के करीब में डाला जांच । अग्रणी कतरा-विशिष्ट जांच का उपयोग करके, हम डीएनए विखंडन पैटर्न एक WT तनाव में नवजात अग्रणी किनारा डीएनए में ribonucleotides पर और polymerases α, δ, और ε के वेरिएंट व्यक्त उपभेदों में के कारण होता है कि के लिए अनेक ribonucleotide ।

एक उतार-चढ़ाव प्रयोग का उपयोग करके, हम रिपोर्टर जीन युक्त खमीर उपभेदों के उत्परिवर्तन दरों को मापने कर सकते हैं । चित्रा 4 ुरा3 और CAN1 loci के साथ या कार्यात्मक पोलीमरेज़ pol2 के बिना WT M644G या RNase-H2 उत्परिवर्ती व्यक्त उपभेदों के उत्परिवर्तन दरों से पता चलता है । RNase H2 की कमी दोनों पृष्ठभूमि में समग्र उत्परिवर्तन दरों में एक उदारवादी वृद्धि का कारण बनता है । हालांकि, उत्परिवर्तन विशिष्टता के करीब परीक्षा से पता चलता है कि RNase H2 (आंकड़ा 5) में कमी उपभेदों, वहां कम विलोपन के लिए उत्परिवर्तन दर में एक मजबूत वृद्धि, विशेष रूप से मिलकर दोहराने अनुक्रम में है । चित्रा 5 WT और rnh२०१ δ उपभेदों और चित्रा 5B में उत्परिवर्तन विशिष्टता की तुलना नवजात अग्रणी डीएनए किनारा में आगे ऊंचा ribonucleotide निगम के परिवर्तन के प्रभाव को प्रदर्शित करता है पोल ε द्वारा ।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल ribonucleotide शामिल करने के कारण क्षारीय संवेदनशील साइटों के कतरा-विशिष्ट पता लगाने में जुड़े कदम खमीर जीनोमिक डीएनए में । विभिंन प्रमुख इस प्रक्रिया में शामिल कदम के एक सिंहावलोकन, खमीर जीनोमिक डीएनए अलगाव और अंतिम दक्षिणी दाग विश्लेषण के माध्यम से आगे बढ़ने के साथ शुरुआत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: alkaline-agarose जेल ट्रो द्वारा प्राप्त परिणामों की एक प्रतिनिधि छवि । यह आंकड़ा निक McElhinny, एस. ए. एट अल से अनुकूलित किया गया है । 5. खमीर जीनोमिक डीएनए अलग पादी के उपभेदों से KCl (तटस्थ) या KOH (क्षारीय) और फिर एक तटस्थ या alkaline agarose जेल पर अलग से इलाज किया गया था । "WT" और "M644G" की स्थिति का संकेत देता है पोल ε । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: किनारा-दक्षिणी दाग से एक alkaline-agarose जेल के विशिष्ट जांच । यह आंकड़ा विलियंस, जे एस एट अल से अनुकूलित किया गया है । 13. (क) radiolabeled जांच URA3 रिपोर्टर जीन है कि दो विपरीत झुकाव (OR1 और OR2) में ARS306 के करीब डाला गया है के भीतर नवजात अग्रणी डीएनए किनारा करने के लिए एनएन । (ख) नवजात अग्रणी कतरा-विशिष्ट जांच का उपयोग दक्षिणी सोख्ता के प्रतिनिधि परिणाम । प्रदर्शित नवजात WT डीएनए polymerases, या pol1-L868M, pol2-M644G या pol3 -L612M संस्करण उपभेदों के साथ या बिना RNase H2 के साथ एक तनाव में अग्रणी कतरा के लिए जांच परिणाम हैं । POL1, POL2, और POL3 जीन सांकेतिक शब्दों में बदलना उत्प्रेरक Pols α, ε, और δ, क्रमशः के यूनिटों । वेरिएंट ribonucleotide निगमन5,12,17के लिए और अधिक अभेद हैं । (ग) (ख)से प्रत्येक लेन में कुल के अंश द्वारा रेडियोधर्मी संकेत का ठहराव. मान कुल के प्रतिशत के रूप में अभिव्यक्त होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: खमीर उपभेदों में सहज उत्परिवर्तन दरों । यह आंकड़ा निक McElhinny, एस. ए. एट अल से अनुकूलित किया गया है । 5. URA3 और CAN1 रिपोर्टर जीन आगे उत्परिवर्तन परख में इस्तेमाल के लिए संकेत उपभेदों के उत्परिवर्तन दरों को मापने थे । URA3 रिपोर्टर में है "2 अभिविंयास" (OR2, चित्रा 3ए) । ९५% विश्वास अंतराल (CI) प्रत्येक माप के लिए शामिल किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: URA3-OR2 रिपोर्टर जीन के लिए उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशनों5,18,19,20से अनुकूलित किया गया है । स्थिति और उत्परिवर्तन प्रकार प्रत्येक स्वतंत्र 5 में मनाया-FOA प्रतिरोधी आगे उत्परिवर्तन परख में चयनित कॉलोनी ८०४ बीपी URA3 कोडन अनुक्रम में चित्रित कर रहे हैं । पत्र आधार प्रतिस्थापन इंगित करते हैं, खुले त्रिकोण एकल आधार हटाए जाने का संकेत देते हैं, बंद त्रिभुज एकल आधार सम्मिलनों का संकेत देते हैं, और ठोस पंक्तियाँ कम हटाने का संकेत देती हैं. (क) WT और rnh201Δ उपभेदों में उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा । अनुक्रम के ऊपर लाल लेबल उत्परिवर्तनों WT में मनाया जाता है, जबकि नीले अनुक्रम नीचे लेबल एक rnh201Δ तनाव में उन मनाया जाता है । (ख) pol2 में उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा -M644G और pol2-M644G rnh201Δ उपभेदों । अनुक्रम के ऊपर लाल लेबल उत्परिवर्तनों pol2-M644G में मनाया जाता है, जबकि pol2-M644G rnh201Δ उपभेदों के लिए अनुक्रम के नीचे नीला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहाँ, हम उन प्रयोगों के दो सेट के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो अक्सर अर्द्ध-मात्रात्मक रूप से डीएनए प्रतिकृति और unrepaired ribonucleotides के mutagenic प्रभावों के दौरान शामिल ribonucleotides का विश्लेषण करते हैं. हालांकि इन तरीकों मॉडल यूकेरियोट एस cerevisiaeशामिल है, इन तकनीकों को आसानी से अंय रोगाणुओं और भी उच्च eukaryotes के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

डीएनए में unrepaired ribonucleotides के लिए जांच क्षारीय का उपयोग कर-agarose ट्रो दक्षिणी सोख्ता के साथ युग्मित ribonucleotides वर्तमान और किनारा जिसमें वे शामिल किया गया है की संख्या के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है । हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि क्षार-संवेदनशीलता अन्य डीएनए घावों की वजह से भी हो सकती है, जैसे कि कोई abasic साइट । डीएनए में ribonucleotides का पता लगाने का एक अंय साधन शुद्ध RNase H2 एंजाइम के साथ उपचार द्वारा है, के रूप में स्तनधारी कोशिकाओं में किया गया है21। हालांकि हमारे दृष्टिकोण URA3 रिपोर्टर हमारे उत्परिवर्तन विश्लेषण प्रयोगों में इस्तेमाल किया जीन में अग्रणी बनाम नवजात में क्षार के प्रति संवेदनशील साइटों के लिए जांच शामिल है, यह जांच है कि अंय स्थानों पर ऐनी क्रम में डिजाइन संभव है अंय जीनोमिक स्थलों पर ribonucleotide घनत्व के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी हासिल करना । प्रक्रिया के दक्षिणी दाग भी अंय सामांय डीएनए प्रयोगों की जांच के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

उत्परिवर्तन के एक उतार-चढ़ाव परीक्षण का उपयोग दरों का मापन व्यापक रूप से सूक्ष्मजीवों में विभिंन mutagenic घटनाओं के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है, और इस तरह डीएनए में ribonucleotides के mutagenic परिणामों के विश्लेषण तक ही सीमित नहीं है । इस प्रयोग के लिए, स्वतंत्र संस्कृतियों की संख्या में वृद्धि बहुत माप की सटीकता को बढ़ा सकते हैं । स्वतंत्र कालोनियों YPDA माध्यम पर ब्याज की एक तनाव लकीर से प्राप्त किया जा सकता है या स्वतंत्र बीजाणु एक द्विगुणित खमीर दाग के tetrad विच्छेदन द्वारा प्राप्त की कालोनियों के विश्लेषण के द्वारा । आदर्श रूप में, एकाधिक स्वतंत्र अगुणित खमीर उपभेदों के उपयोग (उदाहरणके लिए, tetrad विच्छेदन से) तनाव के प्रभाव को कम करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है करने के लिए तनाव भिंनता । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब सहज उत्परिवर्तन की दर अधिक है या जब तनाव एक वृद्धि दोष है । एक अतिरिक्त तरीका है कि सहज उत्परिवर्तन दर को मापने के लिए नियोजित किया जा सकता है एक उत्परिवर्तन संचय प्रयोग22है । इस विश्लेषण में, उत्परिवर्तन आवृत्ति व्यापक विकास के बाद कोशिकाओं के लिए निर्धारित किया जाता है और उत्परिवर्तन दर के लिए गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । गहरी अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के साथ एक उत्परिवर्तन संचय प्रयोग के युग्मन एक शक्तिशाली उपकरण के जीनोम में उत्परिवर्तन दर और विशिष्टता का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया गया है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अपने काम और प्रोटोकॉल से संबंधित चर्चा के लिए सभी वर्तमान और पूर्व Kunkel लैब के सदस्यों को धंयवाद और reused डेटा यहां प्रस्तुत किया । यह कार्य नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH), राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) के अंदर अनुसंधान के प्रभाग से T.A.K. करने के लिए परियोजना Z01 ES065070 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
YPD media 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.
COM plates 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate.
CAN plates 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.
5-FOA plates 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.
L-Canavanine sulfate US Biological C1050
5-FOA US Biological F5050
20 mL glass culture tube Any brand
Culture rotator in 30 °C incubator Shaker incubator can be used instead
96 well round bottom plates Sterile, any brand
3 mm glass beads Fisher Scientific 11-312A Autoclave before use
12-channel pipettes Any brand
Ex Taq DNA Polymerase TaKaRa RR001
Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit Epicenter MPY80200
3 M sodium acetate Sigma-Aldrich S7899
100% ethanol
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866 Newer model available
dsDNA BR Assay kit Invitrogen Q32850
KOH Sigma-Aldrich 221473
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Ficoll 400 Dot Scientific Inc. DSF10400
Bromocresol green Eastman 6356
Xylene cyanol FF International Technologies Inc. 72120
NaOH Sigma-Aldrich S8045
1 M Tris-HCl (pH 8.0) Teknova T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Invitrogen S11494
UV transilluminator
Amersham Nylon membrane Hybond-N+ GE Healthcare RPN303B
3 MM CHR Chromotography paper Whatman 3030-392
NaCl Caledon 7560-1
Stratalinker 1800 Stratagene
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
G-25 spin column GE Healthcare 27-5325-01
1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) Sigma-Aldrich NaH2PO4 (S9638);
Na2HPO4 (S9390)
SDS Sigma-Aldrich L4522
BSA Sigma-Aldrich A3059
Formamide Sigma-Aldrich 47671
Geiger counter

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References

  1. Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
  2. Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
  3. Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
  4. Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
  5. Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
  6. Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
  7. Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
  8. Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
  9. Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
  10. Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  11. Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
  12. Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
  13. Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
  14. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
  15. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
  16. Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
  17. Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
  18. Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
  19. Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
  20. Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
  21. Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
  22. Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).

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Zhou, Z. X., Williams, J. S., Kunkel, T. A. Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis. J. Vis. Exp. (137), e58020, doi:10.3791/58020 (2018).

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