Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver den forbigående genteknologi af dental stamceller udvundet af menneskelige dental hårsækken. Anvendt ikke-virale modifikation-strategien kan blive grundlag for forbedring af terapeutisk stamceller produkter.

Abstract

Til dato, er flere stamcelle typer på forskellige udviklingsstadier i fokus for behandlingen af degenerative sygdomme. Men visse aspekter, såsom indledende massiv celledød og lave terapeutiske virkninger, forringet deres bred klinisk oversættelse. Gensplejsning af stamceller før transplantation fremstod som en lovende metode til at optimere terapeutisk stamceller effekter. Sikker og effektiv gen leveringssystemer mangler dog stadig. Derfor, udvikling af egnede metoder kan give en tilgang til at løse aktuelle udfordringer i stamcelle-baseret terapi.

Denne protokol beskriver udvinding og karakterisering af menneskelige dental follikel stamceller (hDFSCs) samt deres ikke-virale genetisk modifikation. Den postnatale dental follikel afsløret som en lovende og let tilgængelig kilde til høst Multipotente stamceller fra voksne besidder høj spredning potentiale. Proceduren beskrevet isolation præsenterer en enkel og pålidelig metode til at høste hDFSCs fra påvirket visdom tænder. Denne protokol omfatter også metoder til at definere stamcelle Karakteristik af isolerede celler. Genteknologi i hDFSCs præsenteres en optimeret kationiske lipid-baserede Transfektion strategi aktivering højeffektive mikroRNA Introduktion uden at forårsage cytotoksiske virkninger. MicroRNA er egnede kandidater til forbigående celle manipulation, da disse små translationel tilsynsmyndigheder styrer den skæbne og opførsel af stamceller uden fare for stabil genom integration. Denne protokol udgør således, en sikker og effektiv procedure for konstruktion af hDFSCs, der kan blive vigtigt for at optimere deres terapeutiske virkning.

Introduction

Den menneskelige dental hårsækken er en løs ectomesenchymally-afledte bindevæv omkring den tredje tand1,2. Ved siden af sin funktion at koordinere osteoclastogenesis og osteogenesis for tand vulkanen proces, havne denne væv stilk og stamfader celler især for udviklingen af parodontiet3,4,5. Derfor, dental hårsækken er betragtes som en alternativ kilde til høst menneskelige stamceller fra voksne6,7.

Flere undersøgelser viste, at menneskelige dental follikel stamceller (hDFSCs) er i stand til at differentiere i parodontale slægt herunder osteoblaster, ligament fibroblaster og cementoblasts8,9,10 . Desuden, disse celler blev vist til at matche alle Karakteristik af mesenchymale stromale celler (MSCs) herunder selvstændig fornyelse kapacitet, overholdelse af plast, udtryk for specifikke overflade markører (f.eks., CD73, CD90, CD105) så godt som osteogenic, adipogenic og chondrogenic differentiering potentielle11,12,13. Andre undersøgelser viste også et neurale differentiering potentiale af hDFSCs2,14,15,16,17,18.

På grund af deres lovende egenskaber og nem adgang blev hDFSCs for nylig relevante for tissue engineering19,20,21. De første undersøgelser koncentreret om DFSCs potentiale til at regenerere knogle, parodontale og tand rødder19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Viden om neurogen evne til hDFSCs, deres anvendelse som potentiel behandling af neurodegenerative sygdomme siden undersøgte31,32,33. HDFSCs har også fået betydning med hensyn til den regenerering af andre væv (fx hornhindens epitel)34,35. Det terapeutiske potentiale i hDFSC er ikke kun baseret på deres direkte differentiering potentiale, men også på deres paracrine aktivitet. For nylig har hDFSCs vist sig at udskille et væld af bioaktive faktorer, såsom matrix metalloproteinases (MMPs), insulin-lignende vækstfaktor (IGF), vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), basic fibroblast vækstfaktor (bFGF) og hepatocyt vækst faktor (HGF), som spiller en afgørende rolle for angiogenese, immunomodulation, ekstra cellulære matrix remodellering og reparative processer36.

Dog er bred klinisk oversættelse af stamcelleterapi stadig svækket af flere udfordringer, såsom massive indledende celledød og lav gavnlige stamcelle effekter37,38. Genteknologien giver en lovende strategi for at imødegå disse udfordringer og derfor kan i høj grad øge den terapeutiske virkning af stamceller38,39,40. For forbigående celle manipulation er MicroRNA (miRs) egnede kandidater, som disse små translationel tilsynsmyndigheder styrer den skæbne og opførsel af stamceller uden fare for stabil genom integration41,42, 43. til dato, der er konstateret flere gavnlige miRs fremme stamcelle spredning, overlevelse, målsøgende, paracrine aktivitet samt deres differentiering i flere slægter44. For eksempel, manipuleret miR-133a MSCs viste en øget overlevelse og engraftment i infarcted rotte hjerter resulterer i en forbedret hjertefunktion sammenlignet med ikke-modificerede MSC'er45. Ligeledes, miR-146 overekspression MSCs blev vist til at udskille større mængder af VEGF, hvilket igen førte til en øget terapeutisk effektivitet i iskæmiske væv46.

Dette manuskript præsenterer en detaljeret protokol for selektiv ekstraktion og gensplejsning af hDFSCs. Til dette formål beskrev vi høst og enzymatiske fordøjelsen af menneskelige dental follikler og den efterfølgende isolation af hDFSCs. For at karakterisere isolerede celler, er vigtige instruktioner til verifikation af MSC egenskaber medtaget i overensstemmelse med retningslinjerne fra det internationale samfund for cellulære terapi13. Derudover giver vi en detaljeret beskrivelse af generation af miR-ændret hDFSCs ved at anvende en kationiske lipid-baserede Transfektion strategi og evalueringen af Transfektion effektivitet og cytotoksicitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HDFSCs er isoleret fra dental follikler af uddraget visdom tænder fra afdeling for Oral og Maxillofacial plastikkirurgi i Rostock University Medical Center. Informeret samtykke og skriftlig godkendelse blev opnået fra alle patienter. Denne undersøgelse blev godkendt af det lokale etiske udvalg af Universitet i Rostock (tilladelse No. A 2017-0158).

1. isolering af hDFSCs

Bemærk: For at forhindre bakteriel forurening, bør ikke være udbrød visdom tænder før udvinding

  1. Forberedelse af nødvendige løsninger
    1. Forberede fosfatbufferet saltopløsning (PBS) / Penicillin-Streptomycin-glutamin (P-S-G) løsning: 495 mL PBS blandes med 5 mL af P-S-G løsning. Store delprøver af 50 mL ved 4 ° C.
    2. Forberede hDFSC næringssubstratet: 445 ml af basal medium med 5 mL af antibiotika agent og 50 mL af føtal bovint serum (FBS). Opbevares ved 4 ° C.
    3. Forberede Collagenase type jeg lagerfører løsning (30 mg/mL): Fortynd 300 mg af Collagenase type jeg i 10 mL af basal medium suppleret med 1% antibiotika agent. Energisk Bland løsningen. Filtrer løsning ved hjælp af en 0,2 µm filter. Store delprøver af 500 µL af Collagenase type I stamopløsningen i-20 ° C.
    4. Forberede Dispase II stamopløsning (40 mg/mL): Fortynd 40 mg Dispase II i 10 mL af basal medium suppleret med 1% antibiotika agent. Energisk Bland løsningen. Filtrer løsning ved hjælp af en 0,2 µm filter. Store delprøver af 500 µL af Dispase II stamopløsning ved-20 ° C.
  2. Kirurgisk procedure
    1. Indsprøjtes en tilstrækkelig mængde (maksimal: 2 mL) af lokalbedøvelse.
    2. Oprette og hæve en tre-sidet mucoperiosteal klap. Raising en flersproget klap er ikke påkrævet.
    3. Beskytte den flersprogede aspekt med en periosteal elevator.
    4. Forsigtigt mill bukkal og distale knogler med en runde hårde metal burr.
    5. Løsne væv af hårsækken med en periosteal elevator. Fjern forsigtigt komplet tand (Kim) og follikel ved at trække kronen (og follikel) med posterior (tredje-molar) pincet.
    6. Debridér og overrisle socket grundigt med NaCl løsning.
    7. Udskift mucoperiosteal klap med vicryl suturer (Se Tabel af materialer).
    8. Fjern tand follikel fra mundhulen og placere dem i en alikvot af 50 mL PBS/P-S-G løsning.
      Bemærk: Prøven kan opbevares ved 4 ° C indtil videre forarbejdning.
  3. Enzymatisk nedbrydning af tand hårsækken
    1. Pre varm hDFSC næringssubstratet og PBS/P-S-G løsning til stuetemperatur (RT).
    2. Tø en delprøve af hver type, Collagenase, jeg og Dispase II stamopløsninger. Forbered en fordøjelsen løsning af 3 mg/mL Collagenase type jeg og 4 mg/mL Dispase II ved at tilføje 500 µL af hver Collagenase skrive jeg og Dispase II stamopløsning til 4 mL af basal medium indeholdende 1% antibiotika agent.
    3. Placer udpakkede follikel i en steril petriskål og tilsættes 10 mL PBS/P-S-G at vaske den udpakkede væv. Gentag trinnet vask to gange.
    4. Hakkekød udpakkede hårsækken til at stykker af ca 1 mm x 1 mm med en steril skalpel i petriskålen indeholdende 10 mL PBS/P-S-G løsning.
    5. Overføre hakket væv og PBS/P-S-G løsning fra en petriskål i et 50 mL konisk centrifugeglas. Vaske petriskål med 10 mL PBS/P-S-G opløsning og opløsningen overføres til det samme rør.
    6. Der centrifugeres i konisk centrifugeglas i 10 min på 353 x g på RT og supernatanten.
    7. Tilsættes 5 mL fordøjelsen på pelleted væv. Forsigtigt blandes løsningen og væv. Inkuber blanding ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 timer i en rystende inkubator.
    8. Centrifuge fordøjet celler/væv suspension ved 353 x g i 10 min. ved RT. udsmid supernatanten og genopslæmmes opnåede pellet i 6 mL af hDFSC næringssubstratet.
    9. Frø cellesuspension i en 25 cm2 celle kultur kolbe og inkuberes celler ved 37 ° C, 5% CO2 og 20% O2.
      Bemærk: Hvis væv ikke er helt fordøjet, overføres den resterende væv til celle kultur kolbe så godt.
    10. Ændre medium omhyggeligt 24 h efter celle såning. Bagefter ændre medium hver tre dage indtil confluency.
      Bemærk: HDFSCs bør være plast-tilhænger 24 h efter celle såning og kan adskilles fra ikke-tilhænger celler og blodkomponenter ved blot at ændre medium.
  4. Celle høst
    1. Pre varm hDFSC næringssubstrat, PBS/P-S-G løsning og Trypsin/ethylendiamintetra syre (EDTA) løsning til RT.
    2. Supernatanten fra kultur kolbe og vaske sammenflydende celler med 5 mL PBS/P-S-G opløsning.
    3. Kultur kolben tilsættes 1 mL Trypsin/EDTA-opløsning og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C. Stop fordøjelsesprocessen ved tilsætning af 3 mL af hDFSC næringssubstratet kultur kolben.
    4. Overføre cellesuspension i en 15 mL konisk centrifugeglas og centrifugeres suspension for 10 min på 353 x g på RT. udsmid supernatanten og genopslæmmes pellet i en passende mængde hDFSC næringssubstratet.
    5. Tælle celler: forsigtigt mix 10 µL af cellesuspension med 10 µL af Trypan blå løsning. Anvend 10 µL i en optælling kammer og beregne den hDFSC celle.

2. karakterisering af hDFSCs

  1. Immunofænotypning
    1. Forberedelse af celler til flow cytometric analyse
      1. Forberedelse af nødvendige løsninger
        1. Forberede PBS/EDTA (2 mM): 996 mL PBS blandes med 4 mL af EDTA (0,5 M).
        2. Forberede farvning buffer: 995 mL PBS/EDTA (2 mM) blandes med 5 g af BSA. Filtrer løsning ved hjælp af et 0,22 µm filterenhed og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
        3. Forberede PARAFORMALDEHYD (PFA) stamopløsning (4%): Fortynd 4 g PFA i 100 mL PBS og varme løsning til 80 ° C. Bland opløsningen og justere pH-værdien til 7,3. Alikvot opnået PFA løsning i respektive mængder (1,5 mL) og opbevares ved-20 ° C indtil brug.
          Forsigtig: Fordi PFA dampe er giftige, forberede PFA løsning i en ventileret stinkskab.
      2. Efter celle høst (1.4), skal du overføre 14 prøver af 5 x 104 celler til 1,5 mL microcentrifuge rør. Centrifugeres suspensioner ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
        Bemærk: Udføre følgende arbejder i et temmelig overdækket rum. Hold celler og reagenser på is, medmindre andet er angivet.
      3. Genopslæmmes celler i visse mængder af farvning buffer (4 ° C) og tilføje FcR blokering reagens (4 ° C), som angivet i tabel 1.
      4. Tilføj de følgende antistoffer på den indvendige side af den respektive prøve som angivet i tabel 1: Allophycocyanin (APC) mus-anti-humant CD29; APC mus IgG1 κ isotype kontrol; Peridinin-klorofyl protein (PerCP)-Cyanine5.5 mus-anti-humant CD44; PerCP-Cyanine5.5 musen IgG2b κ isotype kontrol; V500 mus-anti-humant CD45; V500 mus IgG1 κ isotype kontrol; Phycoerythrin (PE) mus-anti-humant CD73; PE mus IgG1 κ isotype kontrol; PerCP-Cyanine5.5 mus-anti-humant CD90; PerCP-Cyanine5.5 musen IgG1 κ isotype kontrol; mus-anti-humant CD105: Alexa Fluor (AF) 488; mus IgG1 negativ kontrol: AF488; PE-Cyanine7 mus-anti-humant CD117; PE-Cyanine7 musen IgG1, κ isotype kontrol. Efter antistoffer er blevet tilføjet til hver prøve, spin ned antistoffer og blandes forsigtigt. Inkuber løsninger i 10 min. ved 4 ° C.
      5. Der tilsættes 1 mL PBS (4 ° C) og centrifugeres prøver ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
      6. Genopslæmmes celler i 100 µL af PBS (4 ° C) og tilføje 33 µL af PFA (4%). Opløsninger blandes og opbevares på is eller ved 4 ° C indtil flow cytometric analyse.
    2. Cytometric flowmåling af celler
      Bemærk: Udføre følgende arbejder i et temmelig overdækket rum. Hold celler på is indtil målingen.
      1. For at undersøge udtryk for overflade antigener, overføre prøver til rør velegnet til flow cytometric målinger.
      2. Måle mindst 2 x 104 begivenheder ved hjælp af en flow Flowcytometret. Analysere som afbilledet i figur 2.
  2. Multipotente differentiering potentiale af hDFSCs
    1. Bruge et kommercielt tilgængelige menneskelige mesenkymale stamceller funktionelle identifikation Kit til at bekræfte adipogenic, osteogenic og chondrogenic differentiering potentiale for hDFSCs. Anvende æsel anti-gede AF488 sekundær antistof til farvning af fedtsyre bindende protein 4 (FABP4) og aggrecan samt æsel anti-mus AF488 sekundær antistof til farvning af osteocalcin. Farvningen af kerner, at bruge montering medium med 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Bemærk: Forberede prøverne uden primære antistof som negative kontroller for mikroskopiske analyser.
    2. Analysere udtryk for proteiner ved laser scanning Konfokal mikroskopi. Mikroskopi indstillinger: 40 x mål med immersionsolie; excitation laser 488 nm (for AF488) og 405 nm (for DAPI).

3. Transfektion af hDFSCs

  1. Efter celle høst (1,4), frø hDFSCs på en 24-godt celle kultur plade 24 timer før Transfektion.
    Bemærk: Start celle tæthed er ca 4 x 104 celler pr. brønd. Celler skal nå ~ 80% sammenløbet dag i Transfektion.
    Bemærk: Frø én ekstra celle prøve som objekt for analysen af cytometric.
  2. Forberedelse af Transfektion komplekser
    Bemærk: For at forhindre forurening fra RNases, rense workspace direkte før udarbejdelsen af Transfektion komplekser ved hjælp af RNase dekontaminering løsning. Brug kun RNase-fri materialer og løsninger.
    Bemærk: Udføre følgende arbejder i et temmelig overdækket rum.
    1. Forberede miR stamopløsning (50 µM): genopslæmmes Cy3-mærket forløber miR (5 nmol) i 100 µL nukleasen-gratis vand. Alikvot opnået miR stamopløsning i respektive beløb (5 µL) og opbevares i mørke ved-20 ° C indtil brug.
    2. Fortynd 40 pmol af miR (0,8 µL 50 µM miR stamopløsning) i 66,7 µL af reducerede serum medium. Bland løsningen forsigtigt
    3. Fortynd 0,67 µL af kationiske lipid-baserede Transfektion reagens i 66,7 µL af reducerede serum medium. Bland løsningen forsigtigt og Inkuber i 5 min på RT.
    4. Efter inkubation, skal du tilføje den forud fortyndede Transfektion reagens til den forud fortyndede miR. Bland løsningen forsigtigt og Inkuber i 15 min. ved RT.
  3. Tilføj forberedt Transfektion komplekser dråbevis direkte til næringssubstratet på celler. Bland forsigtigt af vuggende 24-godt celle kultur plade frem og tilbage.
  4. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2og 20% O2 i 24 timer.

4. analyse af Transfektion

Bemærk: Udføre følgende arbejder i et temmelig overdækket rum.

  1. Celle høst efter Transfektion
    Bemærk: Indsamle alle celle løsninger af én prøve i den samme 15 mL konisk centrifugeglas.
    1. 24 timer efter Transfektion, indsamle supernatanten af prøver i respektive centrifugeglas.
    2. Vaske cellerne med 1 mL PBS, overføre PBS i de respektive centrifugerør og tilsættes 500 µL Trypsin/EDTA (RT) til cellerne. Inkuber løsninger i 3 minutter ved 37 ° C.
    3. Stop trypsinization ved tilsætning af 1 mL af næringssubstratet (RT) til celler og overførsel løsningen i de respektive centrifugerør. Centrifuge celler ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
      Bemærk: Fra denne tid, holde celler og reagenser på is, medmindre andet er angivet.
  2. Forberedelse af celler til flow cytometric analyse
    1. Supernatanten. Genopslæmmes celler i 100 µL af farvning buffer (4 ° C) og overførsel celle løsning til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
    2. Tilføje 0,5 µL af amin reaktive farvestof til prøverne for at skelne mellem levende og døde celler. Forsigtigt blandes løsningen og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C.
    3. Der tilsættes 1 mL PBS (4 ° C) til celler og centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
    4. Genopslæmmes celler i 100 µL af PBS (4 ° C) og tilføje 33 µL af PFA (4%). Opløsninger blandes og opbevares på is eller ved 4 ° C indtil flow cytometric analyse.
  3. Cytometric flowmåling af celler
    Bemærk: Udføre følgende arbejder i et temmelig overdækket rum. Hold celler på is indtil målingen.
    1. Overføre prøver til rør velegnet til flow cytometric målinger.
    2. Undersøge cellers levedygtighed og miR optagelse effektivitet ved hjælp af en flow Flowcytometret. Måle mindst 2 x 104 begivenheder. Bruge gating strategien afbildet i figur 4.
      Bemærk: Bruge untransfected celler som negativ kontrol at arrangere gating for Cy3 positive celler og til at beregne celledød skyldes Transfektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi præsenterer her, en detaljeret isolation instruktion til at høste hDFSCs fra menneskelige dental hårsækken væv. På grund af den nemme adgang af dental hårsækken under rutinemæssig operation er det en lovende kilde til udvinding af stamceller fra voksne.

Den isolerede hDFSCs viste alle karakteristika som beskrevet for definitionen af MSCs13. I virkeligheden var celler plast-tilhænger under beskrevet dyrkningsbetingelserne og vises en fibroblast-lignende morfologi (figur 1). Flow cytometric analyser viste, at hDFSCs gav udtryk for et panel af visse overflade antigener, herunder CD29, CD44, CD73, CD90 og CD105, mens CD45 og CD117 var fraværende (figur 2). Desuden, adipogenic, osteogenic og chondrogenic differentiering potentiale celler under specifikke in vitro kultur betingelser blev bekræftet ved immunfarvning af fedtsyre bindende protein 4 (FABP4), osteocalcin og aggrecan (figur 3).

Den beskrevne kationiske lipid-baserede Transfektion strategi aktiveret effektive forbigående genetisk modifikation af hDFSCs med en miR-uptake i ~ 100% af levedygtige celler 24 h efter Transfektion (figur 4B). Desuden transfekteret (figur 4A) og untransfected (fig. 4 c) prøver viste sammenlignelige mængder af døde celler at bevise blid celle forarbejdningsbetingelserne.

Figure 1
Figur 1: repræsentative lys mikroskop billede af hDFSCs. Celler viser en fibroblast-lignende morfologi standard kultur betingelser.

Figure 2
Figur 2: repræsentative flow cytometric Immunofænotypning af hDFSCs. Flow cytometric analyse af celler efter farvning for specifikke celle overflade markører (blå). Tilsvarende isotype kontrol blev brugt som negative kontroller (grå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant verifikation af adipogenic, osteogenic og chondrogenic differentiering potentiale for hDFSCs. Efter differentiering, blev adipocytter, osteocytes og chondrocytter identificeret ved immunfarvning af (A) fedtsyre bindende protein 4 (FABP4) (grøn), (B) osteocalcin (grøn) og (C) aggrecan (grøn). Kerner blev farves med DAPI (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentative gating strategi for analyse af Transfektion. Skematisk fremstilling af gating strategi, der anvendes til kvantificeringen af (A) cytotoksicitet (blå: døde celler) og (B) Cy3-mærket miR optagelse effektivitet (red: Cy3+ celler) 24 timer efter Transfektion. Untransfected celler (C,D) blev brugt som kontrol.

MAC'ER FK Antistoffer [µL] Isotype kontrol [µL]
Stikprøve buffer blokering CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
[µl] reagens [µl] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37,5 10 2.5
3 37,5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37,5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37,5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37,5 10 2.5

Tabel 1: Pipettering layout for Immunofænotypning af hDFSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voksne stamceller er i øjeblikket i fokus til behandling af flere degenerative sygdomme. Især knogle marv (BM)-afledte stamceller, herunder hæmatopoietisk stamceller (HSCs) og MSC'er, er under intensiv kliniske undersøgelse47. Dog BM høst er en invasiv procedure, forårsager smerter i stedet for donation og kan føre til utilsigtede hændelser48. For nylig, den postnatale dental væv er opstået som en roman og let tilgængelig kilde til stamceller. Disse dental stamceller blev vist sig at opfylde alle MSC egenskaber og viste højere spredning kapacitet som BM-afledte stamceller49. Her, præsenteret vi en detaljeret protokol til udvinding, karakterisering og engineering af hDFSCs.

Proceduren beskrevet isolation er blevet udviklet på menneskelige dental follikler af påvirket visdom tænder, da dette væv er sædvanligvis udvundet og bortskaffes som medicinsk affald19. Ikke desto mindre, andre dental væv, herunder dental pulp50,51, parodontale ledbånd52, ekspanderet løvfældende tænder53og root apikale papilla54, kan udnyttes til udvinding af dental stilk celler.

Gensplejsning af stamceller ved at indsætte miRs er en roman strategi for at overvinde visse vanskeligheder i stamcelle-baserede behandlinger, såsom lav stamcelle overlevelse43,55,56,57. Denne protokol fremlagde afgørende instruktioner for effektiv indførelse af syntetiske miR i hDFSCs ved hjælp af en kommercielt tilgængelig kationiske lipid-baserede Transfektion reagens. Anvendelsen af kationiske liposomal formuleringer for levering af terapeutiske reagenser, såsom narkotika og nukleinsyrer, er blevet undersøgt i talrige kliniske forsøg58,59. Kationiske Liposomer er imidlertid potentielt cytotoksiske i en dosisafhængig måde ved at forårsage f.eks., skader integriteten af cellemembranen eller ændringer i gen expression59,60,61 . Derfor, især skal være opmærksom toksiske virkninger på celler induceret af Transfektion.

Navnlig er anført Transfektion betingelser blevet optimeret til miR-medieret genetisk modifikation af hDFSCs effektivitet og cytotoksicitet. Ikke desto mindre, andre undersøgelser vist vellykket anvendelse af denne Transfektion reagens for levering af yderligere nukleinsyrer, herunder plasmid DNA, mRNA og siRNA, i forskellige typer62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. resultaterne af disse undersøgelser afslørede at ideelle leveringsbetingelser varierede betydeligt og skal være defineret for hver celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af programmet FORUN Rostock University Medical Center (889018) og den FUGTIGE Foundation (2016-11). Derudover P.M. og R.D. understøttes af BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Tags

Genetik sag 141 stamceller dental follikel-stamceller mesenkymale stamceller ikke-virale ændring genteknologi forbigående Transfektion mikroRNA
Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, P., Ekat, K.,… More

Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter