Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает переходных генной инженерии Стоматологическая стволовых клеток, извлеченные из человеческих зубов фолликула. Прикладной-вирусных модификации стратегия может стать основой для улучшения продуктов терапевтического стволовых клеток.

Abstract

На сегодняшний день, несколько типов стволовых клеток на разных этапах своего развития находятся в центре внимания для лечения дегенеративных заболеваний. Тем не менее некоторые аспекты, такие как первоначальный массивные клеточной смерти и низкий терапевтический эффект, нарушение их широкого клинического перевод. Генной инженерии стволовых клеток до трансплантации возникла как перспективный метод для оптимизации эффекты терапевтического стволовых клеток. Однако по-прежнему отсутствуют гена безопасных и эффективных систем доставки. Таким образом разработка подходящих методов могут обеспечить подход к решению текущих проблем в терапии на основе стволовых клеток.

Настоящий Протокол описывает добычи и характеристика человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток (hDFSCs) а также их не вирусная генетическая модификация. Послеродовой Стоматологическая фолликула обнародовал как источник перспективных и легко доступны для уборки Multipotent с экстрактами стволовых клеток обладающих высоким распространением потенциал. Процедуре описано изоляции представляет простой и надежный способ для сбора hDFSCs от Ретинированные зубы мудрости. Также этот протокол включает методы для определения характеристик стволовых клеток изолированных клеток. Для генной инженерии hDFSCs оптимизированный Катионный липидных трансфекции стратегия представлен стимулирующей внедрение высокоэффективных микроРНК не вызывая цитотоксических эффектов. МикроРНК, подходящих кандидатов для манипуляции переходных клеток, эти небольшие поступательные регуляторов управления судьбу и поведением стволовых клеток без опасности стабильной генома интеграции. Таким образом этот протокол является безопасной и эффективной процедуры для техники hDFSCs, которые могут оказаться важными для оптимизации их терапевтической эффективности.

Introduction

Человеческих зубов фолликула это рыхлой соединительной ткани, ectomesenchymally производные, окружающих развивающихся зуба1,2. Помимо своей функции по координации osteoclastogenesis и Остеогенез для процесса извержения зуба эта ткань затаивает стволовых и прогениторных клеток, особенно для развития периодонт3,4,5. Таким образом Стоматологическая фолликула рассматривается как альтернативного источника для сбора стволовых клеток человека взрослых6,7.

Несколько исследований показали, что человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток (hDFSCs) способны дифференцироваться в линии пародонта, включая остеобластов, связки фибробластов и cementoblasts8,9,10 . Кроме того, эти клетки были показаны для соответствия всех характеристик мезенхимальных стромальных клеток (МСК) включая самостоятельного обновления потенциала, пластиковые присоединения, выражения конкретных поверхностных маркеров (например, CD73, CD90, CD105) также как остеогенные, адипогенном и хондрогенном дифференциация потенциальных11,12,13. Другие исследования также показали нейронных дифференциация потенциал hDFSCs2,14,,1516,17,18.

Благодаря их перспективных свойств и легкий доступ hDFSCs стала недавно соответствующие ткани инженерных19,,2021. Первые исследования сосредоточены на потенциал DFSCs для регенерации костей, пародонта и зуб корни,19,,2223,24,25,26 27,28,29,30. Знание нейрогенный возможности hDFSCs их применение в качестве потенциальных лечение нейродегенеративных заболеваний после исследованы31,,3233. HDFSCs также приобрели важное значение в связи с регенерации других тканей (например, эпителий роговицы)34,35. Терапевтический потенциал hDFSC основан не только на их потенциал прямых дифференциации, но и на их ответные действия. Недавно было показано hDFSCs выделяют множество биологически активных факторов, таких как матрицы металлопротеиназ (MMPs), инсулин подобный фактор роста (IGF), Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основные фибробластический фактор роста (bFGF) и роста гепатоцитов фактор (HGF), которые играют решающую роль по ангиогенез, иммуномодуляция, Ремоделирование дополнительных клеточных матриц и репаративные процессы36.

Однако широкого клинического перевод стволовых клеток до сих пор препятствует ряд проблем, таких, как массовые первоначальная клеточная смерть и низкой выгодно стволовых клеток эффекты37,38. Генной инженерии обеспечивает перспективные стратегии для решения этих проблем и поэтому могут значительно повысить терапевтическую эффективность стволовых клеток38,,3940. Для манипуляции переходных клеток микроРНК (Мирс) являются подходящими кандидатами, как эти небольшие поступательные регуляторов управления судьбу и поведением стволовых клеток без опасности стабильным геномом интеграции41,42, 43. до настоящего времени, были определены несколько полезных Мирс, поощрение распространения стволовых клеток, выживание, головка самонаведения, паракринными деятельность, а также их дифференцировку в несколько линий44. К примеру мир 133а инженерии MSCs, показало увеличение выживаемости и приживления в сердцах infarcted крысы, что приводит к улучшению функции сердца, по сравнению с неизмененной MSCs45. Кроме того мир 146А избытком MSCs были продемонстрированы секретировать VEGF, который в свою очередь привело к расширенной терапевтическую эффективность при ишемии ткани46большее количество.

Эта рукопись представляет подробный протокол для селективного извлечения и генной инженерии hDFSCs. Для этой цели мы описали, сбора урожая и ферментативные пищеварения человека Стоматологическая фолликулов, а также последующие изоляции hDFSCs. Для того чтобы характеризовать изолированных клеток, были включены в соответствии с руководящими принципами международного общества для клеточной терапии13важные инструкции для проверки свойств MSC. Кроме того мы предоставляем подробное описание для поколения мир модифицированных hDFSCs, применяя стратегию Катионный липидных transfection и оценки эффективности transfection и цитотоксичность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HDFSCs изолированы от стоматологических фолликулов предоставляемые Департаментом оральных и челюстно-лицевой пластической хирургии медицинского центра Университета Ростока зубов мудрости. Осознанного согласия и письменное согласие было получено от всех больных. Это исследование было санкционировано местными Этический Комитет университета г. Росток (разрешение № A 2017-0158).

1. изоляция hDFSCs

Примечание: Для предотвращения бактериального загрязнения, зубы мудрости не быть вспыхнули до извлечения

  1. Подготовка необходимых решений
    1. Подготовить фосфат амортизированное saline (PBS) / пенициллин-стрептомицином-глютамин (P-S-G) решение: смешать 495 мл PBS с 5 мл раствора P-S-G. Хранить аликвоты 50 мл при 4 ° C.
    2. Подготовка hDFSC питательной среды: микс 445 мл базальной среды с 5 мл антибиотик агента и 50 мл плода бычьим сывороточным (ФБС). Хранить при 4 ° C.
    3. Подготовить коллагеназы типа я складе раствор (30 мг/мл): разбавлять 300 мг коллагеназы типа я в 10 мл базальной среды дополняется 1% антибиотиков агента. Энергично mix решение. Фильтр решения с помощью фильтра 0,2 мкм. Магазин аликвоты 500 мкл коллагеназы типа я Стоковый раствор при температуре-20 ° C.
    4. Подготовить раствор Dispase II (40 мг/мл): разбавлять 40 мг в 10 мл базальной среды с 1% антибиотиков агент по Dispase II. Энергично mix решение. Фильтр решения с помощью фильтра 0,2 мкм. Хранить аликвоты 500 мкл Dispase II Стоковый раствор при температуре-20 ° C.
  2. Хирургическая процедура
    1. Придать достаточное количество (максимум: 2 мл) из местного анестетика.
    2. Создание и приподнять клапан 3 сторонняя mucoperiosteal. Повышение лингвальные заслонки не требуется.
    3. Защищайте языковой аспект с периостальная Лифт.
    4. Аккуратно стана Щечной и дистальных костей с круглой жесткий металлический заусенцев.
    5. Ослабьте ткань фолликула с периостальная Лифт. Осторожно удалите полный зуба (зародыш) и фолликул, потянув из короны (и фолликула) с задней (третьего моляра) щипцами.
    6. Предотвращать и орошать сокета тщательно раствором NaCl.
    7. Замените клапан mucoperiosteal Викрил швов (см. Таблицу материалы).
    8. Удаление зуба фолликул из ротовой полости и поместите их в Алиготе 50 мл раствора PBS/P-S-G.
      Примечание: Образец может храниться при температуре 4 ° C до дальнейшей обработки.
  3. Ферментативный пищеварения фолликула зуба
    1. Предварительно теплой hDFSC питательной среды и PBS/P-S-G решения до комнатной температуры (RT).
    2. Оттепель один Алиготе каждого коллагеназы типа I и Dispase II акций решения. Приготовляют раствор пищеварение 3 мг/мл коллагеназы типа I и 4 мг/мл Dispase II, добавив 500 мкл каждого коллагеназы типа I и Dispase II раствор до 4 мл базальной средних содержащий 1% антибиотиков агента.
    3. Место извлечения фолликула в стерильных Петри и добавить 10 мл раствора PBS/P-S-G мыть извлеченные ткани. Повторите этот шаг Стиральная дважды.
    4. Фарш извлеченные фолликула на кусочки около 1 мм x 1 мм с стерильным скальпель в пределах Петри, содержащие 10 мл раствора PBS/P-S-G.
    5. Передача фарш из ткани и PBS/P-S-G решение от Петри в 50 мл конические пластиковых пробирок. Вымойте Петри с 10 мл раствора PBS/P-S-G и передача решения в том же трубку.
    6. Центрифуга конические пластиковых пробирок для 10 мин на 353 x g в RT и удалить супернатант.
    7. Добавьте 5 мл раствора пищеварение гранулированных ткани. Аккуратно перемешать решения и ткани. Инкубируйте смеси при 37 ° C и 5% CO2 на 2 ч в тряску инкубатора.
    8. Центрифуга переваривается ткани клеток подвеска на 353 x g 10 мин на RT. удалить супернатант и вновь приостановить полученные гранулы в 6 мл hDFSC питательной среды.
    9. Суспензию клеток семян в 25 см2 клетки культуры колбу и инкубации клеток при 37 ° C, 5% CO2 и 20% O2.
      Примечание: Если ткань не усваивается полностью, передать колбу культуры клетки также оставшиеся ткани.
    10. Изменения среднего тщательно 24 ч после заполнения ячейки. После изменения среднего каждые три дня до confluency.
      Примечание: HDFSCs должно быть пластик сторонник 24 ч после посева клеток и может быть отделена от non сторонник клетки и компонентов крови, просто изменив носитель.
  4. Клетки для сбора урожая
    1. Предварительно теплой hDFSC питательной среды, PBS/P-S-G решения и трипсина/Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) решение RT.
    2. Отменить супернатант от культуры колбу и мыть вырожденная клетки с 5 мл раствора PBS/P-S-G.
    3. Добавить 1 мл раствора трипсина/ЭДТА в колбу культуры и Инкубируйте 3 мин при 37 ° C. Остановите процесс пищеварения, добавления культуры флакон 3 мл hDFSC питательной среды.
    4. Передача суспензию клеток в 15 мл конические центрифуги и центрифуги подвеска для 10 мин на 353 x g на RT. удалить супернатант и вновь приостановить гранулы в соответствующее количество hDFSC питательной среды.
    5. Подсчитать ячейки: осторожно смешать 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл раствора Трипановый синий. Применить 10 мкл в Счетной палате и подсчитать количество ячеек hDFSC.

2. характеристика hDFSCs

  1. Иммунофенотипирование
    1. Подготовка для анализа потока гранулярных клеток
      1. Подготовка необходимых решений
        1. Подготовить PBS/ЭДТА (2 мм): смешать 996 мл PBS с 4 мл ЭДТА (0,5 М).
        2. Подготовить окрашивание буфера: смешать 995 мл PBS/ЭДТА (2 мм) с 5 г BSA. Фильтр решения с помощью блок фильтра 0.22 мкм и хранить при 4 ° C до использования.
        3. Подготовить раствор параформальдегида (PFA) (4%): разбавляют 4 g ПФА в 100 мл PBS и тепла решение до 80 ° C. Mix решение и отрегулируйте значение рН 7.3. Алиготе получил решение ПФА в соответствующих сумм (1,5 мл) и хранить при температуре от-20 ° C до использования.
          Предупреждение: Потому что ПФА газы являются токсичными, подготовьте решение ПФА в вентилируемых зонта.
      2. После уборки урожая (1.4) ячейки передача 14 образцов 5 х 104 клеток в 1,5 мл пробирок microcentrifuge. Центрифуга для подвески на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
        Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени. Держите клетки и реагенты на льду, если не указано иное.
      3. Вновь приостановить клетки в определённых количествах окрашивание буфера (4 ° C) и добавить FcR блокирование реагента (4 ° C), как указано в таблице 1.
      4. Добавьте следующие антител на внутренней стороне соответствующих образцов, как указано в таблице 1: аллофикоцианин (APC) мыши против человека CD29; APC мыши элемент управления изотипа IgG1 κ; Peridinin хлорофилл белка (PerCP)-Cyanine5.5 мышь борьбе человека CD44; PerCP-Cyanine5.5 мышь IgG2b κ изотипа управления; V500 мыши античеловеческие CD45; V500 мыши элемент управления изотипа IgG1 κ; Фикоэритрин (PE) мыши античеловеческие CD73; PE мыши элемент управления изотипа IgG1 κ; PerCP-Cyanine5.5 мышь борьбе человека CD90; PerCP-Cyanine5.5 мышь элемента управления изотипа IgG1 κ; мышь антинародным CD105: Alexa Fluor (AF) 488; отрицательный контроль IgG1 мыши: AF488; PE-Cyanine7 мышь борьбе человека CD117; PE-Cyanine7 мышь IgG1, κ изотипа управления. После того, как антитела были добавлены для каждого образца, спина вниз антител и осторожно перемешать. Инкубировать решения для 10 мин при 4 ° C.
      5. Добавьте 1 mL PBS (4 ° C) и Центрифугуйте образцы на 300 g x 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
      6. Вновь приостановить клетки в 100 мкл PBS (4 ° C) и 33 мкл PFA (4%). Смешать решения и хранить на льду или на 4 ° C до гранулярных анализ потока.
    2. Измерение расхода гранулярных клеток
      Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени. Держите клетки на льду до измерения.
      1. Для изучения экспрессии поверхностных антигенов, передачи образцов в трубы, пригодные для измерения расхода гранулярных.
      2. Мера по крайней мере 2 х 104 события с помощью проточный цитометр. Проанализируйте, как показано на рисунке 2.
  2. Потенциал Multipotent с дифференциации hDFSCs
    1. Используйте коммерчески доступных человека мезенхимальных стволовых клеток функциональную идентификации комплект для подтверждения адипогенном, остеогенные и хондрогенном дифференциация потенциал hDFSCs. Применить осла анти козье AF488 вторичное антитело для окрашивания белок, связывающий жирные кислоты 4 (FABP4) и Аггрекан а также осел анти мыши AF488 вторичное антитело для окрашивания остеокальцина. Для окрашивания ядер, используйте монтажа средних с 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Примечание: Подготовка образцов без первичного антитела как негативный контроль для микроскопического анализа.
    2. Проанализировать экспрессию белков лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Микроскопия параметры: 40 x цель с погружения нефти; возбуждения лазерный 488 нм (для AF488) и 405 нм (для DAPI).

3. transfection hDFSCs

  1. После сбора урожая (1.4) ячейки семена hDFSCs на плите культуры клеток 24-Ну за 24 часа до transfection.
    Примечание: Начиная плотность клеток является примерно 4 х 104 клетки на хорошо. Клетки должны достичь слияния ~ 80% на день transfection.
    Примечание: Семя один образец дополнительные ячейки как элемент управления для анализа гранулярных потока.
  2. Подготовка трансфекции комплексов
    Примечание: Для предотвращения загрязнения от полиадениновый, очистите область непосредственно перед приготовлением трансфекции комплексов с помощью РНКазы обеззараживания решения. Используйте только РНКазы бесплатные материалы и решения.
    Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени.
    1. Подготовить раствор (50 мкм) мир: вновь приостановить Cy3-помечены прекурсоров мир (5 нмоль) в 100 мкл нуклеиназы свободной воды. Алиготе получил мир Стоковый раствор в соответствующих количествах (5 мкл) и хранить в темноте при температуре-20 ° C до использования.
    2. Разбавьте 40 пмоль мир (0,8 мкл раствора Фондовый мир 50 мкм) в 66,7 мкл сокращение сыворотке среды. Осторожно перемешать раствор
    3. Разбавьте 0,67 мкл Реагента Катионный липидных трансфекции в 66,7 мкл сокращение сыворотке среды. Mix решение осторожно и инкубировать в течение 5 мин на RT.
    4. После инкубации добавьте предварительно разбавленного трансфекции реагент предварительно разбавленного мир. Mix решение осторожно и Инкубируйте 15 мин на RT.
  3. Добавьте подготовленные трансфекции комплексы каплям непосредственно питательной среды на клетки. Смешайте нежно покачиваясь пластину культуры клеток 24-ну взад и вперед.
  4. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2и 20% O2 за 24 ч.

4. анализ Transfection

Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени.

  1. Уборка после transfection клетки
    Примечание: Соберите все ячейки решения одного образца в же 15 мл конические пластиковых пробирок.
    1. 24 ч после трансфекции, собирать супернатант образцов в соответствующих пробирок.
    2. Вымыть клетки с 1 мл раствора PBS, передача PBS в соответствующих пластиковых пробирок и 500 мкл трипсина/ЭДТА (RT) клеток. Инкубировать решения для 3 мин при 37 ° C.
    3. Остановите trypsinization, добавив 1 мл питательной среды (RT) клетки и передачи решения в соответствующих пластиковых пробирок. Центрифуга клетки на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
      Примечание: От этого времени держите клетки и реагенты на льду, если не указано иное.
  2. Подготовка для анализа потока гранулярных клеток
    1. Выбросите супернатант. Вновь приостановите клетки в 100 мкл буфера окрашивание (4 ° C) и передачи ячейки решения пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    2. Добавьте 0.5 мкл Амин реактивной красителя образцы для того, чтобы различать живые и мертвые клетки. Аккуратно перемешать раствор и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C.
    3. Добавьте 1 mL PBS (4 ° C) в клетки и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    4. Вновь приостановить клетки в 100 мкл PBS (4 ° C) и 33 мкл PFA (4%). Смешать решения и хранить на льду или на 4 ° C до гранулярных анализ потока.
  3. Измерение расхода гранулярных клеток
    Примечание: Выполните следующие работы в комнате довольно тени. Держите клетки на льду до измерения.
    1. Передача образцов в трубы, пригодные для измерения расхода гранулярных.
    2. Изучите жизнеспособность клеток и эффективность поглощения мир с помощью проточный цитометр. Мера4 события по крайней мере 2 x 10. Использование стробирования стратегия, изображенные на рисунке 4.
      Примечание: Используйте untransfected клетки как отрицательный контроль устроить стробирования для позитивных клеток Cy3 и гибели клеток, вызванные transfection вычисления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы представляем подробную изоляции инструкция урожай hDFSCs из ткани человека Стоматологическая фолликула. Из-за легкий доступ Стоматологическая фолликул во время обычной операции это перспективный источник для извлечения стволовых клеток.

Изолированные hDFSCs показал все характеристики, описанные для определения MSCs13. В самом деле, клетки были пластик сторонник под описаны условия, культуру и отображаются фибробластоподобных морфологии (рис. 1). Потока гранулярных анализы показали, что hDFSCs выразили группе некоторых поверхностных антигенов, в том числе CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105, в то время как CD45 и CD117 отсутствовали (рис. 2). Кроме того, адипогенном, остеогенные и потенциал хондрогенном дифференцировки клеток под конкретные в пробирке культуры условий было подтверждено иммуноокрашивания белок, связывающий жирные кислоты 4 (FABP4), остеокальцина и Аггрекан (рис. 3).

Описанные Катионный липидных трансфекции стратегии позволило эффективных переходных генетической модификации hDFSCs с мир поглощение в ~ 100% жизнеспособных клеток 24 ч после трансфекции (рис. 4B). Кроме того transfected (рис. 4A) и untransfected (рис. 4 c) образцы показали сопоставимых количество мертвых клеток, доказав условия обработки нежный клеток.

Figure 1
Рисунок 1: представитель свет Микроскоп картину hDFSCs. Клетки показывают фибробластоподобных морфология условиях стандартных культуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель потока гранулярных Иммунофенотипирование hDFSCs. Анализ потока гранулярных клеток после окрашивания для определенных ячеек поверхностных маркеров (синий). Соответствующие элементы изотипа использовались как негативный контроль (серый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель проверка адипогенном, остеогенные и хондрогенном дифференциация потенциал hDFSCs. После дифференциации адипоциты, остеоциты и хрящевые клетки были определены иммуноокрашивания белок, связывающий жирные кислоты (A) 4 (FABP4) (зеленый), (B) остеокальцин (зеленый) и (C) Аггрекан (зеленый). Ядер окрашивали DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: представитель стробирования стратегия для анализа transfection. Схематическое представление стробирования стратегия используется для количественной оценки (A) цитотоксичности (синий: мертвые клетки) и (B) эффективность поглощения Cy3-меченых мир (красный: Cy3+ клетки) 24 ч после transfection. Untransfected клетки (C,D) были использованы в качестве контроля.

МАКИ FcR Антитела [мкл] Isotype контроля [мкл]
Пример буфер Блокировка CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
[мкл] Реагент [мкл] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37,5 10 2.5
3 37,5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37,5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37,5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37,5 10 2.5

Таблица 1: Дозирование макет для Иммунофенотипирование hDFSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Взрослые стволовые клетки в настоящее время в фокусе для лечения ряда дегенеративных заболеваний. В частности, костного мозга (BM)-стволовые клетки, включая гемопоэтических стволовых клеток (СКК) и MSCs, находятся под интенсивным клиническое исследование47. Однако BM уборки инвазивные процедуры, вызывая боль в месте введения пожертвование и может привести к48неблагоприятные события. Недавно послеродовой зубной ткани стал Роман и легко доступного источника для стволовых клеток. Эти стоматологических стволовые клетки были показано для удовлетворения всех характеристик MSC и показал выше распространения потенциала как BM-производные стволовые клетки49. Здесь мы представили подробный протокол для извлечения, характеристика и техники hDFSCs.

Был разработан процедуре описано изоляции на человека Стоматологическая фолликулов Ретинированные зубы мудрости, как эта ткань часто извлекается и утилизации медицинских отходов19. Тем не менее другие тканей зуба, включая пульпы зуба50,51, периодонтальной связки52, вспученный молочных зубов53и корень апикальной сосочка54, могут быть использованы для извлечения Стоматологическая стволовых клетки.

Генная инженерия стволовых клеток, вставив Мирс является роман стратегию для преодоления некоторых трудностей в терапии на базе стволовых клеток, таких как низкая стволовых клеток выживания43,55,,5657. Этот протокол представил важнейшим инструкции для эффективного введения синтетических мир в hDFSCs, использование коммерчески доступных Катионный липидных трансфекции реагента. Приложение Катионный липосомальных составов для доставки терапевтических реагентов, таких как наркотики и нуклеиновые кислоты, была исследована в многочисленных клинических испытаний58,59. Однако Катионный липосомы потенциально цитотоксических в зависимости от дозы, вызывая например, ущерб целостности клеточной мембраны или изменения в ген выражение59,,6061 . Таким образом особое внимание должно уделяться токсические эффекты на индуцированных transfection клетки.

В частности указывается трансфекции условия были оптимизированы для мир опосредованной генетической модификации hDFSCs в отношении эффективности и цитотоксичность. Тем не менее другие исследования продемонстрировали успешное применение этого трансфекции реагента для доставки дополнительных нуклеиновых кислот, включая плазмида ДНК, мРНК и siRNA, в различных клеточных типов62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. Результаты этих исследований показали, что условия идеально поставки существенно различаются и должны быть определены для каждого типа клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана программа FORUN медицинский центр университета Ростока (889018) и Фондом влажной (2016-11). Кроме того, часов и р.д. поддерживаются BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Tags

Генетика выпуск 141 стволовых клеток стоматологическая фолликула стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток -вирусных модификации генная инженерия переходных трансфекции микроРНК
Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, P., Ekat, K.,… More

Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter