Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Det här protokollet beskriver övergående gentekniken dental stamceller utvinns ur mänskliga dentala follikeln. Tillämpad icke-virala modifiering strategin kan bli underlag för förbättring av terapeutiska stamceller produkter.

Abstract

Hittills har är flera stamceller typer i olika utvecklingsstadier i fokus för behandling av degenerativa sjukdomar. Ändå nedsatt vissa aspekter, såsom inledande massiva celldöd och låga terapeutiska effekter, deras breda kliniska översättning. Genteknik av stamceller före transplantation uppstod som en lovande metod för att optimera terapeutiska stamceller effekter. Säker och effektiv gen leveranssystem saknas dock fortfarande. Utvecklingen av lämpliga metoder kan därför ge en strategi för att lösa aktuella utmaningar i stamceller-baserade behandlingar.

Protokolls beskriver extraktion och karakterisering av mänskliga dentala follikeln stamceller (hDFSCs) samt deras icke-virala genetisk modifiering. Postnatal dentala follikeln Avtäcka som en lovande och lättillgänglig källa för skörd multipotenta stamceller från vuxna som har hög spridning potential. Förfarandet beskrivs isolering presenterar en enkel och tillförlitlig metod för att skörda hDFSCs från påverkade visdomständer. Detta protokoll omfattar också metoder för att definiera stamcellsforskning egenskaperna hos isolerade celler. För genteknik av hDFSCs presenteras en optimerad katjoniska lipid-baserade transfection strategi möjliggör högeffektiv mikroRNA introduktion utan att orsaka cytotoxiska effekter. MikroRNA är lämpliga kandidater för övergående cell manipulation, som dessa små translationell regulatorer styr ödet och beteende av stamceller utan risk för stabil genomet integration. Detta protokoll utgör därmed, ett säkert och effektivt förfarande för konstruktion av hDFSCs som kan bli viktiga för att optimera deras terapeutiska effekt.

Introduction

Mänskliga dentala follikeln är en lös ectomesenchymally-derived bindväv som omger den framkallande tand1,2. Bredvid sin funktion att samordna osteoclastogenesis och osteogenesis för tand utbrott processen, hamnar denna vävnad stamceller och stamceller celler särskilt för utvecklingen av den periodontium3,4,5. Därför, dentala follikeln är ansedd som en alternativ källa till skörd mänskliga stamceller6,7.

Flera studier visat att mänskliga dentala follikeln stamceller (hDFSCs) klarar av att skilja i den parodontala härstamning inklusive osteoblaster, ligament fibroblaster och cementoblasts8,9,10 . Dessutom dessa celler visades att matcha alla kännetecken av mesenkymala stromaceller (MSCs) inklusive själv förnya kapacitet, plast följsamhet, uttryck för specifika yta markörer (t.ex., CD73, CD90, CD105) samt som osteogent, adipogena och chondrogenic differentiering potentiella11,12,13. Andra studier visade också en neurala differentiering potential av hDFSCs2,14,15,16,17,18.

På grund av deras lovande egenskaper och enkel tillgång blev hDFSCs nyligen relevant för tissue engineering19,20,21. De första studierna koncentreras till DFSCs potential att regenerera ben, parodontala och tand rötter19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Deras tillämpning som potentiell behandling för neurodegenerativa sjukdomar har sedan kunskapen av neurogen förmåga hDFSCs, undersökta31,32,33. HDFSCs har också blivit allt viktigare med den förnyelse av andra vävnader (t.ex. hornhinneepitelet)34,35. Den terapeutiska potentialen i hDFSC bygger inte endast på deras direkta differentiering potential men också på deras parakrin aktivitet. Nyligen, hDFSCs har visat att utsöndra en mängd bioaktiva faktorer, såsom matrix metalloproteinaser (MMP), insulin-liknande tillväxtfaktor (IGF), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), basic fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) och hepatocyte tillväxt faktor (HGF), som spelar en avgörande roll för angiogenes, immunmodulering, extracellulära matrix remodeling och reparativa processer36.

Breda kliniska översättning av stamcellsterapi är dock fortfarande nedsatt av flera utmaningar, såsom massiva första celldöd och låg fördelaktigt stamceller effekter37,38. Genteknik ger en lovande strategi för att möta dessa utmaningar och därför kan kraftigt öka den terapeutiska effekten av stamceller38,39,40. För övergående cell manipulation är mikroRNA (miRs) lämpliga kandidater, som dessa små translationell regulatorer styr ödet och beteende av stamceller utan risk för stabil genomet integration41,42, 43. hittills har flera välgörande miRs har identifierats att främja stem cell spridning, överlevnad, dråpare, parakrin aktivitet samt deras differentiering till flera härstamningar44. Till exempel, konstruerad miR-133a MSCs visade en ökad överlevnad och engraftment i infarcted rat hjärtan vilket resulterar i en förbättrad hjärtfunktion jämfört med oförändrad MSCs45. Likaså visades miR-146a överuttryck MSCs att utsöndra större mängder VEGF som i sin tur ledde till en förbättrad terapeutisk effektivitet i ischemisk vävnad46.

Detta manuskript presenterar en detaljerad protokollet för selektiv extraktion och genteknik av hDFSCs. För detta ändamål beskrev vi skörd och enzymatisk nedbrytning av mänskliga dental folliklar samt efterföljande isoleringen av hDFSCs. För att karakterisera isolerade celler, har viktiga anvisningar för verifiering av MSC boenden inkluderats i enlighet med riktlinjerna från International Society for cellterapi13. Dessutom ger vi en detaljerad beskrivning för generering av miR-modifierat hDFSCs genom att tillämpa en strategi för katjoniska lipid-baserade transfection och utvärderingen av transfection effektivitet och cytotoxicitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HDFSCs är isolerade från dental folliklar av extraherade visdomständer som tillhandahålls av institutionen av Oral och Maxillofacial plastikkirurgi för Rostock University Medical Center. Informerat samtycke och skriftligt godkännande erhölls från alla patienter. Studien var godkänd av den lokala etiska kommittén av det Universitetar av Rostock (tillåtelse No. A 2017-0158).

1. isolering av hDFSCs

Obs: För att förhindra bakteriell kontamination, bör visdomständer inte vara utbröt före extraktion

  1. Beredning av krävs lösningar
    1. Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) / Penicillin-Streptomycin-glutamin (P-S-G) lösning: blanda 495 mL PBS med 5 mL P-S-G lösning. Lagra alikvoter 50 ml vid 4 ° C.
    2. Förbereda hDFSC odlingsmedium: blanda 445 mL basala medium med 5 mL av antibiotikum och 50 mL fetalt bovint serum (FBS). Förvaras vid 4 ° C.
    3. Förbereda kollagenas typ jag stamlösning (30 mg/mL): Späd 300 mg av kollagenas typ kompletterade jag i 10 mL av basala medium med 1% antibiotikum. Kraftfullt blanda lösningen. Filtrera lösningen med ett 0,2 µm filter. Store alikvoter av 500 µL av kollagenas typ I stamlösning vid-20 ° C.
    4. Förbereda Dispase II stamlösning (40 mg/mL): Späd 40 mg av Dispase II i 10 mL av basala medium kompletteras med 1% antibiotikum. Kraftfullt blanda lösningen. Filtrera lösningen med ett 0,2 µm filter. Lagra alikvoter av 500 µL av Dispase II stamlösning vid-20 ° C.
  2. Kirurgiskt ingrepp
    1. Injicera en tillräcklig mängd (max: 2 mL) av lokalbedövning.
    2. Skapa och höja en tresidig mucoperiosteal flik. Att höja en lingual luckan krävs inte.
    3. Skydda den språkliga aspekten med en periosteal hiss.
    4. Försiktigt mill buckala och distala ben med en rund hård metall burr.
    5. Lossa vävnaden i follikeln med en periosteal hiss. Ta försiktigt bort i komplett tand (groddar) och hårsäcken genom att dra ut kronan (och follikeln) med bakre (tredje-molar) pincett.
    6. Debride och vattna uttaget ordentligt med NaCl-lösning.
    7. Ersätt mucoperiosteal luckan med vicryl suturer (se Tabell för material).
    8. Ta bort tanden follikeln från munhålan och placera dem i en alikvot av 50 mL PBS/P-S-G lösning.
      Obs: Provet kan förvaras vid 4 ° C tills vidare bearbetning.
  3. Enzymatisk nedbrytning av tand follikeln
    1. Pre varma hDFSC odlingsmedium och PBS/P-S-G lösning till rumstemperatur (RT).
    2. Tina en alikvot av varje kollagenas typ jag och Dispase II stamlösningar. Förbered en matsmältningen lösning 3 mg/ml kollagenas typ jag och 4 mg/mL Dispase II genom att lägga till 500 µL av varje kollagenas typ I och Dispase II stamlösning till 4 mL av basala medium innehållande 1% antibiotikum.
    3. Placera extraherade follikeln i en steril petriskål och tillsätt 10 mL PBS/P-S-G lösning att tvätta den extraherade vävnaden. Upprepa detta tvätt två gånger.
    4. Finhacka den extraherade follikeln att bitar ca 1 x 1 mm med en steril skalpell inom petriskål innehållande 10 mL PBS/P-S-G lösning.
    5. Överföra malet vävnad och PBS/P-S-G lösning från petriskål i en 50 mL konisk centrifugrör. Tvätta petriskål med 10 mL PBS/P-S-G lösning och överför lösningen till en och samma tub.
    6. Centrifugera det koniskt centrifugröret i 10 min vid 353 x g vid RT och kasta bort supernatanten.
    7. Tillsätt 5 mL av matsmältningen lösning till pelleterat vävnaden. Blanda försiktigt lösningen och vävnaden. Inkubera blandningen vid 37 ° C och 5% CO2 för 2 h i en skakande inkubator.
    8. Centrifug rötas cell/vävnad suspension vid 353 x g i 10 min vid RT. Kassera supernatanten och slamma erhållna pelleten i 6 mL hDFSC odlingsmedium.
    9. Cellsuspension utsäde i en 25 cm2 cell kultur kolv och inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 och 20% O2.
      Obs: Om vävnaden inte är helt smält, överföra återstående vävnaden till cell kultur kolven också.
    10. Ändra medium noggrant 24 h efter cell sådd. Därefter ändra medium varje tre dagar tills konfluens.
      Obs: HDFSCs bör vara plast-anhängare 24 h efter cell sådd och kan skiljas från icke-anhängare celler och blodkomponenter genom att helt enkelt ändra mediet.
  4. Cellen skörd
    1. Pre varma hDFSC odlingsmedium, PBS/P-S-G lösning och Trypsin/etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra lösningen till RT.
    2. Kassera supernatanten från kultur kolven och tvätta konfluenta celler med 5 mL PBS/P-S-G lösning.
    3. Tillsätt 1 mL Trypsin/EDTA-lösning till kultur kolven och Inkubera under 3 minuter vid 37 ° C. Stoppa rötningsprocessen genom att lägga till 3 mL hDFSC odlingsmedium kultur kolven.
    4. Överföra cellsuspension i en 15 mL koniskt centrifugrör och centrifugera suspensionen för 10 min vid 353 x g vid RT. Kassera supernatanten och resuspendera pelleten i en lämplig mängd hDFSC odlingsmedium.
    5. Räkna celler: blanda försiktigt 10 µL cellsuspension med 10 µL Trypan blå lösning. Tillsätt 10 µL in en räknande kammaren och beräkna hDFSC cell.

2. karakterisering av hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. Beredning av celler för flöde flödescytometrisk analys
      1. Beredning av krävs lösningar
        1. Förbereda PBS/EDTA (2 mM): blanda 996 mL PBS med 4 mL av EDTA (0,5 M).
        2. Förbereda färgning buffert: blanda 995 mL PBS/EDTA (2 mM) med 5 g av BSA. Filtrera lösningen med en 0,22 µm filterenhet och förvaras vid 4 ° C fram till användning.
        3. Förbereda PARAFORMALDEHYD (PFA) stamlösning (4%): Späd 4 g PFA i 100 mL PBS och värma lösningen på 80 ° C. Blanda lösningen och justera pH-värdet till 7,3. Alikvot erhålls PFA lösning i respektive belopp (1,5 mL) och förvaras vid-20 ° C fram till användning.
          Varning: Eftersom PFA ångorna är giftiga, förbereda PFA lösningen i ett ventilerat dragskåp.
      2. Efter cellen skörd (1,4), överföra 14 prover av 5 x 104 celler i 1,5 mL mikrocentrifugrör. Centrifugera upphängningarna vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
        Obs: Utför följande arbete i en ganska skuggig rum. Håll celler och reagenser på is om inte annat anges.
      3. Resuspendera cellerna i vissa mängder färgning buffert (4 ° C) och lägga till FcR blockerar reagens (4 ° C) som anges i tabell 1.
      4. Lägg till följande antikroppar på insidan av respektive provet som anges i tabell 1: från (APC) musen anti-humant CD29; APC Mus IgG1 κ isotypen kontroll; Peridinin-klorofyll protein (PerCP)-Cyanine5.5 musen anti-humant CD44; PerCP-Cyanine5.5 mus IgG2b κ isotypen kontroll; V500 musen anti-humant CD45; V500 Mus IgG1 κ isotypen kontroll; Fykoerytrin (PE) musen anti-humant CD73; PE Mus IgG1 κ isotypen kontroll; PerCP-Cyanine5.5 musen anti-humant CD90; PerCP-Cyanine5.5 Mus IgG1 κ isotypen kontroll; musen anti-humant CD105: Alexa Fluor (AF) 488; IgG1 negativa muskontroll: AF488; PE-Cyanine7 musen anti-humant CD117; PE-Cyanine7 Mus IgG1, κ isotypen kontroll. Efter antikroppar har lagts till varje prov, snurra ner antikroppar och blanda försiktigt. Inkubera i lösningar för 10 min vid 4 ° C.
      5. Tillsätt 1 mL PBS (4 ° C) och centrifugera proverna vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
      6. Resuspendera cellerna i 100 µL av PBS (4 ° C) och tillsätt 33 µL av PFA (4%). Blanda lösningarna och lagra på is eller vid 4 ° C tills flödet flödescytometrisk analys.
    2. Flödescytometrisk flödesmätning av celler
      Obs: Utför följande arbete i en ganska skuggig rum. Hålla celler på is tills mätningen.
      1. För att undersöka uttrycket av ytantigener, överföra prover in rören passar flödescytometrisk Flödesmätningarna.
      2. Mäta minst 2 x 104 händelser med hjälp av en flödescytometer. Analysera som avbildas i figur 2.
  2. Multipotenta differentiering potentialen för hDFSCs
    1. Använd ett kommersiellt tillgängliga mänsklig mesenkymala stamceller funktionella identifiering Kit för att bekräfta adipogena, Osteogena och chondrogenic differentiering potentialen hos hDFSCs. Tillämpa åsna anti get AF488 sekundär antikropp för färgning av fettsyra bindande protein 4 (FABP4) och aggrekan samt åsnan antimus AF488 sekundär antikropp för färgning av osteocalcin. För färgning av atomkärnor, använda monteringsmedium med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI).
      Obs: Förbereda prover utan primär antikropp som negativa kontroller för Mikroskopisk analys.
    2. Analysera uttrycket av proteiner av laserscanning konfokalmikroskopi. Inställningar för mikroskopi: 40 x-objektiv med oljeimmersion; magnetiseringen laser 488 nm (för AF488) och 405 nm (för DAPI).

3. transfection av hDFSCs

  1. Efter cellen skörd (1,4), utsäde hDFSCs på en 24-väl cell kultur tallrik 24 h före transfection.
    Obs: Start cell densiteten är cirka 4 x 104 celler per brunn. Cellerna bör nå ~ 80% sammanflödet dag transfection.
    Obs: Utsäde ett ytterligare cell prov som kontroll för flow flödescytometrisk analys.
  2. Beredning av transfection komplex
    Obs: För att förhindra kontaminering från RNaser, ren arbetsytan direkt före framställningen av transfection komplex med RNase sanering lösning. Använd endast RNase-fritt material och lösningar.
    Obs: Utför följande arbete i en ganska skuggig rum.
    1. Förbereda miR stamlösning (50 µM): återsuspendering Cy3-märkt föregångare miR (5 nmol) i 100 µL nuclease-gratis vatten. Alikvot erhöll miR stamlösning i respektive belopp (5 µL) och förvaras i mörker vid-20 ° C fram till användning.
    2. Späd 40 pmol Mir (0.8 µL 50 µM miR stamlösning) i 66,7 µL av minskade serum medium. Blanda lösningen försiktigt
    3. Späd 0,67 µL katjoniska lipid-baserade transfection reagens i 66,7 µL av minskade serum medium. Blanda lösningen försiktigt och inkubera i 5 min på RT.
    4. Efter inkubation, lägga till pre utspädda transfection reagensen pre utspädda miR. Blanda lösningen försiktigt och inkubera i 15 min på RT.
  3. Lägg till de förberedda transfection komplex droppvis direkt till odlingsmediet på celler. Blanda försiktigt genom att gunga 24-väl cell kultur plattan fram och tillbaka.
  4. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2och 20% O2 för 24 h.

4. analys av Transfection

Obs: Utför följande arbete i en ganska skuggig rum.

  1. Cellen skörd efter transfection
    Obs: Samla alla cell lösningar av ett prov i samma 15 mL koniska centrifugröret.
    1. 24 h efter transfection, samla supernatanten av prover i respektive centrifugrör.
    2. Tvätta cellerna med 1 mL PBS, överföra PBS i de respektive centrifugröret och tillsätt 500 µL Trypsin/EDTA (RT) till celler. Inkubera lösningarna för 3 min vid 37 ° C.
    3. Stoppa trypsinization genom att tillsätta 1 mL odlingsmedium (RT) att celler och överföra lösningen i de respektive centrifugröret. Centrifugera celler vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
      Obs: Från denna tid, hålla celler och reagenser på is om inte annat anges.
  2. Beredning av celler för flöde flödescytometrisk analys
    1. Kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i 100 µL av färgning buffert (4 ° C) och överföring cell lösning i en 1,5 mL mikrocentrifug rör.
    2. Tillsätt 0,5 µL amine reaktiva färgämne i proverna för att skilja mellan levande och döda celler. Blanda lösningen försiktigt och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C.
    3. Tillsätt 1 mL PBS (4 ° C) till celler och centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
    4. Resuspendera cellerna i 100 µL av PBS (4 ° C) och tillsätt 33 µL av PFA (4%). Blanda lösningarna och lagra på is eller vid 4 ° C tills flödet flödescytometrisk analys.
  3. Flödescytometrisk flödesmätning av celler
    Obs: Utför följande arbete i en ganska skuggig rum. Hålla celler på is tills mätningen.
    1. Överföra prover in rören passar flödescytometrisk Flödesmätningarna.
    2. Undersöka cellernas viabilitet och miR upptag effektivitet med hjälp av en flödescytometer. Mäta minst 2 x 104 händelser. Använd den portande strategi som avbildas i figur 4.
      Obs: Använd untransfected celler som negativ kontroll att ordna den gating för Cy3 positiva celler och att beräkna celldöd som orsakas av transfection.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här presenterar vi en detaljerad isolering instruktion att skörda hDFSCs från mänskliga dentala follikeln vävnad. På grund av den stora tillgången på dentala follikeln under rutinmässig operation är det en lovande källa för utvinning av vuxna stamceller.

Den isolerade hDFSCs visade alla egenskaper beskrivs för definitionen av MSCs13. I själva verket celler var plast-anhängare under beskrivs odlingsbetingelser och visas en fibroblast-liknande morfologi (figur 1). Flödescytometrisk flödesanalyser avslöjade att hDFSCs uttryckte en panel av vissa ytantigener, inklusive CD29, CD44, CD73, CD90 och CD105, medan CD45 och CD117 var frånvarande (figur 2). Dessutom den adipogena, Osteogena och chondrogenic differentiering potential celler under vissa in vitro-kultur villkor bekräftades av immunfärgning av fettsyra bindande protein 4 (FABP4), osteocalcin och aggrekan (figur 3).

Strategin beskrivs katjoniska lipid-baserade transfection aktiverat effektiv övergående genetisk modifiering av hDFSCs med en miR-upptag i ~ 100% av viabla celler 24 h efter transfection (figur 4B). Dessutom transfekterade (figur 4A) och untransfected (figur 4 c) prover visade jämförbara mängder av döda celler som styrker skonsam cell bearbetningsförhållandena.

Figure 1
Figur 1: representativa ljus Mikroskop bild av hDFSCs. Celler visar en fibroblast-liknande morfologi standard kultur villkor.

Figure 2
Figur 2: representativa flöde flödescytometrisk immunophenotyping av hDFSCs. Flöde flödescytometrisk analys av celler efter färgning för viss cell yta markörer (blå). Motsvarande isotypen kontroller användes som negativa kontroller (grå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa verifiering av adipogena, Osteogena och chondrogenic differentiering potential hDFSCs. Efter differentiering identifierades adipocyter, osteocyter och kondrocyter genom immunfärgning av (A) fettsyra bindande protein 4 (FABP4) (grön), (B) osteocalcin (grön) och (C) aggrekan (grön). Atomkärnor var fläckade av DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: representativa gating strategi för analys av transfection. Schematisk framställning av gating strategi som används för kvantifiering av (A) cytotoxicitet (blå: döda celler) och (B), Cy3-märkt miR upptag effektivitet (röd: Cy3+ celler) 24 h efter transfection. Untransfected celler (C,D) användes som kontroll.

MAC-DATORER FcR Antikroppar [µL] Isotypen kontroller [µL]
Prov buffert blockering CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
[µl] reagens [µl] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37,5 10 2.5
3 37,5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37,5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37,5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37,5 10 2.5

Tabell 1: Pipettering layout för immunophenotyping av hDFSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adulta stamceller är för närvarande i fokus för behandling av flera degenerativa sjukdomar. I synnerhet ben märg (BM)-härrör stamcellerna, inklusive hematopoetiska stamceller (Förenta) och MSCs är under intensiv klinisk undersökning47. BM skörd är dock en invasiv förfarande som orsakar smärta på platsen för donation och kan leda till biverkningar48. Nyligen, postnatal dentala vävnaden har vuxit fram som en ny och lättillgänglig källa för stamceller. Dessa tandläkare stamceller var visat sig uppfylla alla MSC egenskaper och visade högre spridning kapacitet som BM-derived stamceller49. Här presenterade vi ett detaljerat protokoll för utvinning, karakterisering och konstruktion av hDFSCs.

Förfarandet beskrivs isolering har utvecklats på mänskliga dental folliklar av påverkade visdomständer, eftersom denna vävnad är vanligen utvinns och kasseras som medicinskt avfall19. Dock kan andra dentala vävnader, inklusive tandpulpan50,51, periodontala ligament52, exfolierad mjölktänder53och rot apikal papilla54, utnyttjas för utvinning av dental stam celler.

Genteknik av stamceller genom att infoga miRs är en ny strategi för att övervinna vissa svårigheter i stamceller-baserade terapier, såsom låg stamceller överlevnad43,55,56,57. Detta protokoll presenteras avgörande instruktioner för effektiv införsel av syntetiska miR hDFSCs använder en kommersiellt tillgänglig katjoniska lipid-baserade transfection reagens. Tillämpningen av katjoniska Liposomalt formuleringar för leverans av terapeutiska reagens, såsom droger och nukleinsyror, har undersökts i flera kliniska prövningar58,59. Katjoniska liposomer är dock potentiellt cytotoxiska på ett dosberoende sätt skadar t.ex., integriteten i de cellmembran eller förändringarna i gen uttryck59,60,61 . Därför måste särskild uppmärksamhet ägnas toxiska effekter på celler som induceras av transfection.

Särskilt har angivna transfection villkor optimerats för miR-medierad genetisk modifiering av hDFSCs avseende effektivitet och cytotoxicitet. Dock visat andra studier en framgångsrik tillämpning av denna transfection reagens för distribution av ytterligare nukleinsyror, inklusive plasmid DNA, mRNA och siRNA, i olika cell typer62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. resultaten av dessa studier visade att ideala leveransvillkor varierade avsevärt och måste definieras för varje celltyp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av programmet FORUN Rostock universitet medicinska centrum (889018) och fuktig stiftelsen (2016-11). I tillägg, P.M. och R.D. stöds av BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Tags

Genetik fråga 141 Stem cell dentala follikeln stamceller mesenkymala stamceller icke-viral modifiering genteknik övergående transfection mikroRNA
Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, P., Ekat, K.,… More

Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter