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Genetics

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

Abstract

날짜 하려면, 서로 다른 발달 단계에서 여러 줄기 세포 유형 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 초점에 있습니다. 그러나, 초기 대규모 세포 죽음 및 낮은 치료 효과 등의 특정 양상 그들의 광범위 한 임상 번역 손상. 유전 공학 이식 전에 줄기 세포의 줄기 세포 치료 효과 최적화 하는 유망한 방법으로 등장. 그러나, 안전 하 고 효율적인 유전자 전달 시스템은 여전히 부족 합니다. 따라서, 적당 한 방법의 개발 줄기 세포 기반 요법에서 현재의 과제를 해결 하는 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

현재 프로토콜은 그들의 비 바이러스 성 유전자 조작 뿐만 아니라 추출 및 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs)의 특성을 설명합니다. 출생 후 치과 여 포는 높은 확산 잠재력을 보유 하는 성인 multipotent 줄기 세포를 수확 한 유망 하 고 쉽게 접근할 수 있는 소스로 발표 했다. 설명된 격리 절차 영향 을된 지혜의 이빨에서 hDFSCs 수확 간단 하 고 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 또한이 프로토콜 구성 고립 된 세포의 줄기 세포 특성을 정의 하는 방법. HDFSCs의 유전 공학에 대 한 최적화 된 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략 세포 독성 효과 유발 하지 않고 사용 하면 매우 효율적인 예측에 관한 소개를 제공 됩니다. 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합의 위험 없이 줄기 세포의 행동 MicroRNAs 과도 셀 조작에 대 한 적합 한 후보자는. 따라서,이 프로토콜 최적화 그들의 치료 효능에 대 한 중요 한 될 수 있습니다 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 안전 하 고 효율적인 절차를 나타냅니다.

Introduction

인간의 치과 여 포 개발 치아1,2를 둘러싼 느슨한 ectomesenchymally 파생 결합 조직 이다. Osteoclastogenesis 및 골 치아 분화 과정에 대 한 조정 하는 기능 옆에 있는이 조직 특히 periodontium3,,45의 개발에 대 한 줄기와 조상 세포를 항만. 따라서, 치과 여 포는 인간 성인 줄기 세포6,7을 수확 하 대체 소스로 간주 됩니다.

여러 연구 결과 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs) osteoblasts, 인 대 섬유 아 세포, cementoblasts8,,910 을 포함 한 치 주 혈통으로 차별화 할 수 있다 설명 했다 . 또한, 이러한 세포 mesenchymal stromal 세포 (MSCs)의 자기 갱신 용량, 플라스틱 준수, 표현의 특정 표면 마커를 포함 하 여 모든 특성에 맞게 표시 했다 (예:, CD73, CD90, CD105)으로 osteogenic 뿐만 adipogenic 및 chondrogenic 분화 잠재적인11,,1213. 다른 연구는 또한 hDFSCs2,,1415,16,,1718의 신경 감 별 법 잠재력을 계시 했다.

그들의 유망한 속성 및 쉬운 접근, hDFSCs 최근 조직 공학19,,2021관련 되었다. 첫 번째 연구는 치 주 뼈 생성에 DFSCs의 잠재력에 집중 하 고 치아 뿌리19,22,23,,2425,26, 27,,2829,30. HDFSCs의 neurogenic 기능의 지식, 신경 퇴행 성 질환에 대 한 잠재적인 치료로 그들의 응용 프로그램은 이후 조사31,,3233. HDFSCs 또한에 중요성을 얻고 있다 고 다른 조직 (예: 각 막 상피)34,35의 재생. HDFSC의 치료 잠재력은 그들의 paracrine 활동에 뿐만 아니라 그들의 직접적인 감 별 법 잠재력에만 근거 하지 않는다. 최근, hDFSCs 보였다 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 인슐린과 같은 성장 인자 (IGF), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) hepatocyte 성장 등 생리 활성 요인의 분 비 인수 (HGF), 신생, immunomodulation, 개장 하는 엑스트라 세포 매트릭스 및 회복 과정36에 대 한 중요 한 역할입니다.

그러나, 줄기 세포 치료의 광범위 한 임상 번역은 여전히 대규모 초기 세포 죽음 및 낮은 도움이 줄기 세포 효과37,38등 여러 문제에 의해 손상 된다. 유전 공학 이러한 과제를 해결 하기 위해 유망 전략을 제공 하 고 따라서 매우 줄기 세포38,,3940의 치료 효능을 강화할 수 있다. 변이 세포 조작, microRNAs (미르)는 적합 한 후보자, 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합41,42, 의 위험 없이 줄기 세포의 행동으로 43. 날짜, 여러 가지 유익한 미르 확인 된 줄기 세포 증식, 생존, 유도, paracrine 활동 뿐만 아니라 여러 계보44로 그들의 차별화 홍보. 예를 들어, 미르 133a 설계 MSCs 수정 되지 않은 MSCs45에 비해 향상 된 심장 기능의 결과로 infarcted 쥐 마음에 증가 생존 및 engraftment를 보여주었다. 마찬가지로, 미르-146a overexpressing MSCs 분 비 허 혈 성 조직46에서 향상 된 치료 효율 주도 차례에 VEGF의 더 높은 금액을 표시 했다.

이 원고는 선택적 추출 및 hDFSCs의 유전 공학에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 목적을 위해 우리 인간의 치과 여 포의 수확과 효소 소화 뿐만 아니라 hDFSCs의 후속 격리를 설명합니다. 고립 된 세포의 성격을 나타내기 위하여 MSC 속성의 확인에 대 한 중요 한 지침13세포 치료 대 한 국제 사회의 지침에 따라 포함 되었습니다. 또한, 우리는 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략과 transfection 효율 및 세포 독성 평가 적용 하 여 미르 수정 hDFSCs의 생성에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다.

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Protocol

HDFSCs 부의 구강 및 악 안 면 성형 수술으로 스톡 대학 의료 센터에서 제공 하는 추출 된 사랑니의 치과 여 포에서 격리 됩니다. 동 및 서 면된 승인 모든 환자에서 얻은 했다. 이 연구는로 스톡 대학 (권한 No. 2017-0158)의 로컬 윤리 위원회에 의해 허가 했다.

1입니다. hDFSCs의 격리

참고: 세균 오염을 방지 하기 위해, 사랑니 해야 하지 추출 하기 전에 발생 될

  1. 필요한 솔루션의 준비
    1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비 / 페니실린-스-글루타민 (P-S-G) 솔루션: P-S-G 솔루션의 5 mL PBS의 495 mL 혼합. 4 ° c.에 50 mL의 aliquots를 저장
    2. HDFSC 문화 매체를 준비: 혼합 기저 매체의 445 mL 5 mL 항생제 에이전트와 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL와 함께. 4 ° c.에 게
    3. 콜라 종류 준비 솔루션 (30 mg/mL)을 재고: 콜라 유형 나 기저 매체의 10 mL에 1% 항생제 에이전트와 보충의 300 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 콜라의 500 µ L의 스토어 aliquots 유형 I-20 ° c.에 재고 솔루션
    4. Dispase II 재고 솔루션 (40 mg/mL) 준비: 1% 항생제 에이전트 보충 기저 매체의 10 mL에 Dispase II의 40 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. -20 ° c.에 Dispase II 재고 솔루션의 500 µ L의 aliquots를 저장
  2. 외과 절차
    1. 충분 한 양의 주사 (최대: 2 mL) 로컬 마 취의.
    2. 만들고 3 면 mucoperiosteal 플랩 발생 합니다. 언어 플랩 높이 필요 하지 않습니다.
    3. Periosteal 엘리베이터가 언어 측면을 보호 합니다.
    4. 부드럽게 밀 볼 및 원심 뼈와 함께 라운드 하드 금속 버.
    5. Periosteal 엘리베이터와 뿌리의 조직을 풉니다. 조심 스럽게 후부 (제 3-모 랄) 집게와 완전 한 치아 (세균)와 왕관을 철수 하 여 여 포 (및 뿌리) 제거.
    6. Debride 하 고 철저 하 게 NaCl 용액으로 소켓을 관개.
    7. Mucoperiosteal 플랩을 vicryl 봉합 ( 재료의 표참조) 바꿉니다.
    8. 구강에서 치아 뿌리를 제거 하 고 PBS/P-S-G 솔루션 50 mL의 약 수에 그들을 배치.
      참고: 샘플 추가 처리까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. 치아 뿌리의 효소 소화
    1. 미리 따뜻한 hDFSC 문화 매체와 실내 온도 (RT) PBS/P-S-G 솔루션.
    2. 나 및 Dispase II 재고 솔루션 각 콜라 종류의 한 약 수를 녹여. 각 콜라의 500 µ L 타입 I과 기저 중간 포함 1% 항생제 에이전트의 4 ml Dispase II 재고 솔루션을 추가 하 여 3 mg/mL 콜라 종류의 소화 솔루션 어 4 mg/mL Dispase II 준비.
    3. 멸 균 페 트리 접시에 추출 된 뿌리를 놓고 추출 된 조직 씻어 PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.
    4. 약 1 m m x 1 m m PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 포함 하는 페 트리 접시 내 살 균 메스의 조각에 추출 된 뿌리를 말하다.
    5. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 페 트리 접시에서 다진된 조직 및 PBS/P-S-G 솔루션을 전송. PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 페 트리 접시를 세척 하 고 동일한 관으로 솔루션을 전송.
    6. 원뿔 원심 분리기 튜브 RT에서 353 x g 에서 10 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.
    7. 수송과 조직에 소화 솔루션의 5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 솔루션 및 조직. 떨고 인큐베이터에 2 h 37 ° C, 5% CO2 혼합물을 품 어.
    8. 원심 분리기에서 실시간 삭제는 상쾌한 10 분 353 x g 세포/조직 정지를 소화 하 고 다시 hDFSC 문화 매체의 6 mL에서 얻은 펠 릿을 일시 중단.
    9. 25 cm2 종자 세포 현 탁 액 문화 플라스 크 셀 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 20% O2에 셀을 품 어.
      참고: 조직을 완전히 소화 되지 않습니다 경우 나머지 조직 셀 뿐만 아니라 문화 플라스 크에 전송.
    10. 중간 신중 하 게 24 시간 후 바꿀 셀 시드. 나중에 매체 confluency까지 3 일 마다 변경 합니다.
      참고: HDFSCs는 플라스틱 부착 24 h 셀 시드 후 고 단순히 매체를 변경 하 여 비 부착 한 세포 및 혈액 구성 요소에서 분리 될 수 있다.
  4. 셀 수확
    1. 미리 따뜻하게 hDFSC 문화 매체, PBS/P-S-G 솔루션 및 실시간 트립 신/Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션
    2. 문화 플라스 크에서 상쾌한 삭제 하 고 PBS/P-S-G 솔루션의 5 mL confluent 셀을 씻어.
    3. 문화 플라스 크를 1 mL의 트립 신/EDTA 솔루션을 추가 하 고 37 ° c.에 3 분 동안 품 어 문화 플라스 크를 hDFSC 문화 매체의 3 mL를 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다.
    4. 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실시간 삭제는 상쾌한에 353 x g 에서 10 분 동안 현 탁 액을 원심 hDFSC 문화 매체의 적절 한 금액에 펠 릿을 다시 일시 중단.
    5. 셀: 부드럽게 Trypan 블루 솔루션의 10 µ L 10 µ L 세포 현 탁 액의 혼합. 세 실로 10 µ L을 적용 하 고 hDFSC 셀 금액 계산.

2입니다. hDFSCs의 특성

  1. Immunophenotyping
    1. 셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비
      1. 필요한 솔루션의 준비
        1. PBS/EDTA (2mm) 준비: 996 mL PBS의 EDTA (0.5 M)의 4 mL와 혼합.
        2. 얼룩 버퍼 준비: BSA의 5 g 995 mL PBS/EDTA (2 mM)의 혼합. 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 솔루션을 필터링 하 고 사용까지 4 ° C에서 저장 합니다.
        3. 준비 paraformaldehyde (PFA) 재고 솔루션 (4%): 4 g PFA PBS의 100 ml에서를 희석 하 고 열 80 ° c 솔루션 솔루션을 혼합 하 고 pH 값 7.3 조정. 약 수 사용까지 해당 금액 (1.5 mL)에-20 ° C에서 저장소 PFA 솔루션을 얻을.
          주의: PFA 연기 독성 때문에, 통풍이 증기 두건에서 PFA 솔루션을 준비 합니다.
      2. 셀 (1.4)를 수확, 후 1.5 mL microcentrifuge 튜브 14 5 x 104 의 세포 샘플을 전송 합니다. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한.
        참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 셀 및 얼음에 시 약을 계속.
      3. 다시 셀 얼룩 버퍼 (4 ° C)의 특정 금액을 일시 중단 하 고 FcR 시 (4 ° C)을 차단 하는 표 1에 표시 된 대로 추가 합니다.
      4. 표 1에 표시 된 대로 각 샘플의 안쪽에 다음 항 체를 추가: Allophycocyanin (APC) 마우스 안티 인간 CD29; APC 마우스 IgG1 κ isotype 제어; Peridinin-엽록소 단백질 (PerCP)-Cyanine5.5 마우스 안티 인간 CD44; PerCP-Cyanine5.5 마우스 IgG2b κ isotype 제어; V500 마우스 안티 인간 CD45; V500 마우스 IgG1 κ isotype 제어; Phycoerythrin (PE) 마우스 안티 인간 CD73; PE 마우스 IgG1 κ isotype 제어; PerCP-Cyanine5.5 마우스 안티 인간 CD90; PerCP-Cyanine5.5 마우스 IgG1 κ isotype 제어; 반대로 인간의 CD105 마우스: 알 렉 사 Fluor (AF) 488; IgG1 부정적인 제어 마우스: AF488; PE-Cyanine7 마우스 안티 인간 CD117; PE-Cyanine7 마우스 IgG1, κ isotype 제어 합니다. 각 샘플에 항 체를 추가한 후 항 체 아래로 회전 하 고 부드럽게 혼합. 4 ° c.에서 10 분에 대 한 솔루션을 품 어
      5. 1 mL의 PBS (4 ° C)를 추가 하 고 샘플을 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 폐기는 상쾌한.
      6. 다시 100 µ L의 PBS (4 ° C)에 있는 셀을 일시 중단 하 고 PFA (4%)의 33 µ L를 추가 합니다. 솔루션을 믹스와 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장 합니다.
    2. 셀의 흐름 cytometric 측정
      참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 측정까지 얼음에 셀을 계속.
      1. 표현의 표면 항 원 검사, 튜브 흐름 cytometric 측정을 위한 적합 한 샘플을 전송.
      2. 적어도 2 × 104 이벤트 흐름 cytometer를 사용 하 여 측정 합니다. 그림2에서와 같이 분석.
  2. HDFSCs multipotent 차별화 가능성
    1. 상업적으로 이용 가능한 인간 중간 엽 줄기 세포 기능 식별 키트를 사용 하 여 adipogenic, osteogenic 및 hDFSCs의 chondrogenic 감 별 법 잠재력을 확인 하. 적용 지방산 의무적인 단백질 4 (FABP4)의 얼룩에 대 한 당나귀 안티 염소 AF488 이차 항 체와 aggrecan osteocalcin의 얼룩에 대 한 당나귀 반대로 마우스 AF488 이차 항 체에 뿐만 아니라. 핵의 얼룩, 설치 매체와 함께 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 사용 합니다.
      참고: 현미경 분석에 대 한 부정적인 컨트롤로 기본 항 체 없이 샘플을 준비 합니다.
    2. 레이저 공초점 현미경을 스캐닝 하 여 단백질의 표현 분석. 현미경 설정: 기름 침수;와 40 x 목표 (AF488)에 대 한 여기 레이저 488 nm 및 405 nm (DAPI)에 대 한.

3입니다. hDFSCs의 transfection

  1. 셀 (1.4) 수확 후 24-잘 셀 문화 접시 transfection 이전 24 시간에 hDFSCs 씨.
    참고: 잘 당 약 4 x 104 셀은 셀 밀도 시작. 세포는 transfection 요일에 ~ 80% 합류가 되어야만 합니다.
    참고: 종자 하나 추가 셀 샘플 제어 흐름 cytometric 분석에 대 한.
  2. Transfection 복합물의 준비
    참고: 오염을 방지 하기 위해 RNases에서, 직접 transfection 단지 RNase 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 준비 하기 전에 작업 영역을 청소. RNase 소재 및 솔루션을 사용 합니다.
    참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다.
    1. 준비 하는 미르 재고 솔루션 (50 µ M): 다시 Cy3 표시 전조 미르 (5 nmol) 100 µ L nuclease 무료 물에서 중단. 약 수를 취득 해당 금액 (5 µ L) 미르 재고 솔루션 저장소-20 ° C에서 어둠 속에서 사용까지.
    2. 미르 (50 µ M 미르 재고 솔루션의 0.8 µ L) 감소 된 혈 청 매체의 66.7 µ L에서의 40 pmol 희석. 부드럽게 솔루션 혼합
    3. 감소 된 혈 청 매체의 66.7 µ L에서 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 0.67 µ L를 희석. 솔루션을 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어
    4. 부 화, 후 미리 희석된 미르를 미리 희석된 transfection 시 약을 추가 합니다. 솔루션을 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어
  3. 직접 셀에 문화 매체에 dropwise 준비 transfection 단지를 추가 합니다. 24 잘 셀 문화 접시와 락으로 부드럽게 혼합.
  4. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 24 h에 대 한 20% O2 에 셀을 품 어.

4입니다. Transfection 분석

참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다.

  1. 세포 transfection 후 수확
    참고: 모든 셀 솔루션 같은 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 하나의 샘플을 수집 합니다.
    1. transfection, 후 24 h 각각 원심 분리기 튜브 샘플의 상쾌한을 수집 합니다.
    2. 셀 1 mL의 PBS로 세척, 각각 원심 분리기 관으로 PBS를 전송 및 추가 500 µ L 트립 신/EDTA (RT) 셀에. 37 ° c.에 3 분에 대 한 솔루션을 품 어
    3. 문화 매체 (RT)의 1 mL을 추가 하 여 셀을 각각 원심 분리기 관으로 전송 솔루션 trypsinization를 중지 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 세포
      참고: 이 시간에서 달리 명시 하지 않는 한 셀 및 얼음에 시 약 유지.
  2. 셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비
    1. 폐기는 상쾌한. 다시 셀 얼룩 버퍼 (4 ° C) 및 전송 셀 솔루션 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 100 µ L 일시 중단 합니다.
    2. 라이브와 죽은 세포를 구별 하기 위해 샘플에 아민 반응성 염료의 0.5 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 솔루션 및 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어
    3. 셀을 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 1 mL의 PBS (4 ° C)를 추가 폐기는 상쾌한.
    4. 다시 100 µ L의 PBS (4 ° C)에 있는 셀을 일시 중단 하 고 PFA (4%)의 33 µ L를 추가 합니다. 솔루션을 믹스와 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장 합니다.
  3. 셀의 흐름 cytometric 측정
    참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 측정까지 얼음에 셀을 계속.
    1. 흐름 cytometric 측정을 위한 적합 한 튜브 샘플을 전송 합니다.
    2. 세포 생존 능력 및 미르 통풍 관 효율 교류 cytometer를 사용 하 여 검사 합니다. 적어도 2 × 104 이벤트를 측정 합니다. 그림 4에 묘사 된 제어 전략을 사용 합니다.
      참고: 부정적인 통제로 untransfected 세포를 사용 하 여 Cy3 긍정적인 셀 게이팅 정렬 하 고 계산 transfection에 기인한 세포 죽음.

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Representative Results

여기, 우리 인간의 치과 여 포 조직에서 hDFSCs을 수확 하는 상세한 격리 명령을 제시. 일상적인 수술 동안 치과 여 포의 쉬운 접근으로 성체 줄기 세포의 추출에 대 한 유망한 근원 이다.

격리 된 hDFSCs MSCs13의 정의 대 한 설명 하는 모든 특성을 보였다. 사실, 셀 플라스틱 부착 했다 아래 문화 상태를 설명 하 고 표시 구와 같은 형태 (그림 1). 흐름 cytometric 분석 hDFSCs 등 CD29, CD44, CD73, CD90 CD105, CD45 CD117 했다 (그림 2)에 결 석 하는 동안 특정 표면 항 원의 패널을 표현 밝혔다. 또한, adipogenic, osteogenic 및 특정 체 외에서 세포의 chondrogenic 감 별 법 잠재력 문화 조건 지방산 의무적인 단백질 4의 immunostaining (FABP4), osteocalcin aggrecan (그림 3)에 의해 확인 되었다.

설명된 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략 hDFSCs ~ 100% 실행 가능한 셀 24 h 후 transfection (그림 4B)의 미르 통풍 관으로의 효율적인 과도 유전 수정 사용할 수 있습니다. 또한, transfected (그림 4A)와 untransfected (그림 4C) 샘플 부드러운 셀 처리 상태를 증명 하는 죽은 세포의 유사한 금액을 보였다.

Figure 1
그림 1: 대표적인 빛 hDFSCs의 현미경 사진. 셀 표시 표준 문화 조건 구와 같은 형태학.

Figure 2
그림 2: hDFSCs의 대표적인 흐름 cytometric immunophenotyping. 특정 세포 표면 마커 (파란색)에 대 한 얼룩 후 셀의 흐름 cytometric 분석. 해당 isotype 컨트롤 부정적인 컨트롤 (회색)으로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: osteogenic adipogenic와 hDFSCs의 chondrogenic 감 별 법 잠재력의 대표 확인. 차별화, 후 adipocytes, osteocytes chondrocytes immunostaining (A) 지방산 의무적인 단백질 4의 (FABP4) (녹색), (B) osteocalcin (녹색) 및 (C) aggrecan (녹색)에 의해 확인 되었다. 핵 (파란색)와 DAPI 얼룩이 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: transfection의 분석에 대 한 전략을 게이팅 대표. 게이팅 (A) 세포 독성의 정량화에 대 한 사용 되는 전략의 도식 표현 (파란색: 죽은 세포)와 (B) Cy3 표시 된 미르 통풍 관 효율 (빨간색: Cy3+ 세포) 24 h 후 transfection. Untransfected 셀 (C,D) 제어로 사용 되었다.

맥 FcR 항 체 [µ L] Isotype 컨트롤 [µ L]
샘플 버퍼 차단 CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
[µ l] 시 [µ l] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37.5 10 2.5
3 37.5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37.5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37.5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37.5 10 2.5

표 1: Pipetting immunophenotyping hDFSCs의 레이아웃.

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Discussion

성인 줄기 세포는 현재 여러 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 집중에 있습니다. 특히, 뼈 골 수 (BM)-줄기 세포, 조 혈 줄기 세포 (HSCs)를 포함 하 여 파생 된 MSCs, 집중 임상 조사47그리고. 그러나, BM 수확 기부 사이트에 통증을 일으키는 침략 절차 이며48부작용 이어질 수 있습니다. 최근, 출생 후 치과 조직 줄기 세포에 대 한 소스를 쉽게 접근할 수 있는 고로 떠오르고 있다. 이 치과 줄기 세포는 모든 MSC 특성에 맞게 표시 되었고 BM 파생 된 줄기 세포49높은 확산 능력을 보여주었다. 여기, 우리는 추출, 특성화 및 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 상세한 프로토콜을 제시.

이 조직 일반적으로 추출 하 고 의료 폐기물19로 처분 설명된 격리 절차의 영향 을된 지혜의 이빨, 인간의 치과 낭에 개발 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 치과 펄프50,51, 치 주 인 대52, 낙 엽이 피부 박피53, 그리고 루트 꼭대기 시54를 포함 하 여 다른 치과 조직 치과 줄기의 추출에 이용 될 수 있다 셀입니다.

미르를 삽입 하 여 줄기 세포의 유전 공학 줄기 세포 기반 요법, 낮은 줄기 세포 생존43,55,,5657등 특정 어려움을 극복 하기 위해 새로운 전략 이다. 이 프로토콜은 상용 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 hDFSCs로 합성 미르의 효율적인 도입에 대 한 중요 한 지침을 제시. 치료 시 약, 마약, 핵 산 등의 배달에 대 한 양이온 자주 공식의 응용 프로그램 수많은 임상 시험58,59조사 했다. 그러나, 양이온 리는 유전자 식59,,6061 에서 세포 막 또는 변경의 무결성에 예를 들어, 손상을 초래 하 여 잠재적으로 세포 독성 복용량 의존 방식 . 따라서, transfection에 의해 유도 된 세포에 독성 효과에 특별 한 주의 지불 한다.

특히, 표시 된 transfection 조건 효율성과 세포 독성에 대 한 hDFSCs의 유전 수정 미르 중재에 대 한 최적화 되었습니다 했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 다른 연구 다른 세포 유형62,63, 에 추가 핵 산의, 포함 한 플라스 미드 DNA, mRNA, siRNA, 배달에 대 한이 transfection 시 약의 성공적인 응용 프로그램 시연 64 , 65 , 66 , 67 , 68.이 연구 결과 밝혀 이상적인 배달 조건 상당히 다양 하 고 각 셀 형식에 대해 정의 해야.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품의 젖은 기초 (2016-11)로 스톡 대학 의료 센터 (889018)와 FORUN 프로그램에 의해 지원 되었다. 또한, 오후 R.D. BMBF (VIP + 00240)에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

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References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

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유전학 문제점 141 줄기 세포 치과 여 포 줄기 세포 중간 엽 줄기 세포 비 바이러스 성 수정 유전 공학 과도 transfection 예측에 관한
절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의
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Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

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