本文介绍了一种方法，用于评估在动情周期不同阶段暴露于臭氧或过滤空气的小鼠肺组织中miRNA的表达水平，这些miRNA被预测可调控炎症相关基因。
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本文内容
摘要
摘要
microRNA（miRNA）表达谱分析已引起生物学和医学各个研究领域科研人员的关注。目前的研究表明，miRNA在肺部疾病的诊断与治疗中具有广阔的应用前景。本文旨在建立一种miRNA表达谱分析实验方案，用于检测在臭氧诱导的气道炎症小鼠模型肺组织中，预测可调控炎症相关基因的一组miRNA的相对丰度。由于已有研究显示，循环性激素水平可能影响雌性个体肺部固有免疫的调控，因此本方法的目的在于建立适用于雌性小鼠的炎症相关miRNA表达谱分析流程，并在臭氧暴露时充分考虑每只动物所处的动情周期阶段。此外，我们还介绍了利用R/Bioconductor软件limma进行miRNA发现与靶基因预测的生物信息学分析方法，以及通过功能分析软件解析差异表达miRNA所涉及的生物学背景及相关信号通路的方法。
引言
microRNA（miRNA）是一类短链（19至25个核苷酸）的天然非编码RNA分子。miRNA序列在不同物种间具有进化保守性，表明其在调控生理功能中具有重要作用1。microRNA表达谱分析已被证实有助于鉴定在多种生物学过程调控中发挥关键作用的miRNA，包括免疫应答、细胞分化、发育过程以及细胞凋亡2。近年来，miRNA在疾病诊断与治疗中的潜在应用价值也逐渐受到关注。对于研究基因调控机制的科研人员而言，检测miRNA的表达水平有助于构建系统层面的调控网络模型，尤其是在将miRNA信息与mRNA表达谱及其他基因组尺度数据整合分析时，效果更为显著3。另一方面，研究表明miRNA在多种样本类型中比mRNA更稳定，且其检测灵敏度高于蛋白质4。这些特性促使miRNA作为生物标志物在包括肺部疾病在内的多种分子诊断应用中受到广泛关注。
在肺脏中，miRNA 在发育过程和维持内环境稳态方面发挥着重要作用。此外，其异常表达已被证实与多种肺部疾病的发生和发展相关5。由空气污染诱发的炎症性肺部疾病在雌性个体中表现出更严重的病情和更差的预后，表明激素和动情周期可调节肺部固有免疫及 miRNA 表达，以应对环境刺激6。在本实验方案中，我们采用臭氧暴露（空气污染的主要成分之一）来诱导雌性小鼠发生一种不依赖适应性免疫的肺部炎症。通过臭氧暴露，可诱导气道高反应性的产生，其特征为气道上皮细胞损伤以及近端气道中中性粒细胞和炎症介质的增加7。目前尚缺乏对臭氧暴露小鼠在动情周期不同阶段 miRNA 进行系统表征与分析的完善方案。
以下，我们描述了一种简单的方法，用于鉴定暴露于臭氧的雌性小鼠发情周期各阶段及其肺组织中miRNA的表达情况。我们还探讨了miRNA发现及靶点鉴定的有效生物信息学方法，重点强调计算生物学的应用。我们使用R/Bioconductor软件limma对微阵列数据进行分析，该软件为基因表达实验数据的分析提供了集成化解决方案8。在使用少量阵列/样本比较基因表达时，采用limma分析PCR阵列数据相较于基于t检验的方法具有更高的统计效能。为了理解miRNA表达结果所处的生物学背景，我们随后使用了功能分析软件。该软件结合miRNA表达数据集与文献中的已有知识，以解析调控转录变化的潜在机制并预测可能的生物学结果9。与仅分析miRNA集合间统计富集情况的软件相比，这种方法具有明显优势。
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方案
本文所述所有方法均已获得宾夕法尼亚州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 动情周期阶段的评估
- 使用 Machholz 等人所述的单手小鼠固定技术，正确固定一只雌性 C57BL/6 小鼠（8–9 周龄）10。
- 用 10 μL 超纯水填充无菌塑料移液管。
- 将塑料移液管的管尖插入阴道。
- 轻柔冲洗液体 4–5 次以收集样本。
- 将含有阴道液的最终冲洗液滴加至载玻片上。
- 在光学显微镜下使用 20 倍物镜观察未染色的阴道冲洗液。
注意：由于假孕或其他原因导致动情周期不规律的动物需从实验中剔除。建议连续至少三个动情周期每日进行阴道分泌物检查，以确认周期规律性。
2. 臭氧暴露
- 将最多4只小鼠放入两个1.2 L的玻璃容器中，容器顶部为金属网盖，并提供自由饮用的水。
- 将一个玻璃容器放入臭氧暴露舱，另一个放入过滤空气暴露舱。
- 调节臭氧浓度至2 ppm，并定期监测臭氧水平。
注意： 臭氧装置可提供受控的气流（>30次/小时换气），并控制温度（25 °C）和相对湿度（50%）。该系统通过电晕放电式臭氧发生器产生臭氧，并由紫外臭氧分析仪和质量流量控制器进行监测与调控，具体如前所述11。 - 在臭氧或过滤空气暴露3小时后，取出玻璃容器，将动物放回饲养笼，提供垫料、食物和自由饮用的水。
3. 肺组织采集
- 暴露后4小时，通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮90 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）对动物进行麻醉。
注意：为确认麻醉深度，应检查小鼠是否存在足底反射（用力捏脚趾），并根据需要调整麻醉剂量。 - 用70%乙醇润湿小鼠皮肤。
- 使用手术剪和外科镊子沿中线做一条2 cm的切口，暴露下腔静脉。
- 通过横断下腔静脉和主动脉处死小鼠。如需采血，可在肾静脉上方将21 G针头插入下腔静脉，于放血前收集血液。或者，按照标准操作规程通过心脏穿刺采集血液。
- 使用手术剪切开腹腔并去除皮肤/上层肌肉组织，向上延伸至肋骨区域。
- 使用手术剪刺破膈肌。
注意：肺组织将从膈肌处塌陷分离。 - 使用手术剪剪除肋骨，以暴露心脏和肺脏。
- 用镊子夹取一个1.5 mL无RNase的微量离心管，将其浸入液氮中，使管内充满液氮。
注意：操作液氮时需佩戴护目镜和防护手套。 - 取出肺组织，立即放入盛有液氮的无RNase 1.5 mL微量离心管中，进行速冻处理，并等待数秒直至液氮完全蒸发。
- 盖紧管盖，将组织样本保存于-80 °C直至使用。
4. RNA 提取
- 使用不锈钢组织研磨器将整个肺组织研磨成粉。
注意：使用前需将组织研磨器置于液氮中预冷。每次使用后须用RNase溶液清洗研磨器。 - 将研磨后的肺组织均分为两份，分别放入两个1.5 mL离心管中（每管半份肺组织）。
- 每个样本管中加入500 µL硫氰酸胍溶液并混匀。 分别使用18 G、21 G和23 G针头对每个样本进行匀浆处理。
注意：在进行提取前，可在样本中添加5.6 × 108 拷贝的小RNA外参对照（来自不同物种）。 - 向每个样本中加入500 µL乙醇，并涡旋振荡15秒。
- 将混合液转移至收集管中的离心柱内，于12,000 × g 离心1分钟，弃去穿流液。
- 进行柱上DNase I处理；
- 向离心柱中加入400 µL RNA洗涤缓冲液，于12,000 × g 离心1分钟。
- 在无RNase的离心管中加入5 µL DNase I和75 µL 1× DNA消化缓冲液，混匀后直接加至离心柱基质中。
- 室温孵育15分钟。
- 向离心柱中加入400 µL RNA预洗液，于12,000 × g 离心1分钟，弃去穿流液，并重复此步骤一次。
- 向离心柱中加入700 µL RNA洗涤缓冲液，于12,000 × g 离心1分钟，弃去穿流液。
- 于12,000 × g 离心2分钟以去除残留缓冲液，将离心柱转移至无RNase的收集管中。
- 为洗脱RNA，直接向离心柱基质中加入35 µL无DNase/RNase的水，于12,000 × g 离心1.5分钟。
- 使用分光光度计测定总RNA浓度（260 nm）及纯度。按照说明对1.5 µL样本等分试样进行RNA定量。使用洗脱所用的无DNase/RNase水作为空白对照校准仪器。
注意：RNA的260/280比值约为2.0通常被视为“纯”的标准。典型的RNA浓度通常介于750至2,500 ng/µL之间。 - 于-80 °C保存。
5. miRNA 表达谱分析
- 为逆转录小RNA，请使用200 ng总RNA。
- 在冰上配制逆转录反应体系（每反应总体积为20 µL）。每个反应中加入4 µL 5x缓冲液、2 µL 10x核苷酸混合物、2 µL逆转录酶和2 µL无RNase水。混匀所有组分，并分装至600 µL无RNase塑料管中（每反应10 µL混合液）。
注意：逆转录预混液包含除模板RNA外合成第一链cDNA所需的所有组分。
注意：配制预混液时应额外计算10%的过量体积。 - 向每管含有逆转录预混液的反应管中加入模板RNA（10 µL中含200 ng）。混匀后，在1,000 x g条件下离心15秒，并置于冰上，直至放入热循环仪或干式恒温块中。
- 在37 °C孵育60分钟。
- 在95 °C孵育5分钟，然后将反应管置于冰上。
- 通过向每个20 µL逆转录反应体系中加入200 µL无RNase水来稀释cDNA。
- 在冰上配制逆转录反应体系（每反应总体积为20 µL）。每个反应中加入4 µL 5x缓冲液、2 µL 10x核苷酸混合物、2 µL逆转录酶和2 µL无RNase水。混匀所有组分，并分装至600 µL无RNase塑料管中（每反应10 µL混合液）。
- 使用小鼠炎症反应与自身免疫miRNA PCR芯片进行实时PCR。
- 配制反应混合液（总体积1100 µL）：每个反应中加入550 µL 2x PCR预混液、110 µL 10x通用引物混合液、340 µL无RNase水以及340 µL模板cDNA（来自步骤5.1.5的稀释产物）。
- 使用多通道移液器将10 µL反应混合液加入预装载的miRNA PCR芯片的每个孔中。
- 用光学粘性封膜密封miRNA PCR芯片板。
- 在室温下以1,000 x g离心1分钟，以去除气泡。
- 设置实时PCR仪程序：95 °C预变性15分钟，随后进行40个循环的三步法扩增，包括94 °C变性15秒、55 °C退火30秒和70 °C延伸30秒。
注意：请遵循制造商提供的循环条件说明来设置实时PCR仪。运行实时PCR仪软件内置的熔解曲线分析步骤。 - 进行数据分析。
6. 数据分析
- 将每个样本的实时荧光定量PCR软件中的Ct值提取至分析软件中。
注意： Ct 值 34 被视为截断值。若样本中含有内参对照（例如, cel-mir-39)，将每个样本的Ct值相对于内参对照进行归一化。阈值可能需要手动设置，基线值将自动设定。 - 使用以下公式，将 Ct 值相对于六个 miRNA 内参对照（SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95、SNORD96A、RNU6-2）的平均 Ct 值进行归一化：
ΔCt = (Ct_目的基因 − Ct_内参基因) - 对于倍数变化的计算，使用特定样本作为对照，通过相对表达量公式计算 ΔΔCt 值12:
miRNA 相对表达量
2-∆∆Ct，其中 -∆∆Ct = -[∆Ct 检测组 - ∆Ct 对照组]
注意： 以200倍的变化作为阈值。 - 将倍数变化表达值导出，以在 R 中进行统计分析 limma Bioconductor 中的包8.
- 使用 Benjamini-Hochberg 方法校正多重比较13.
注意： R 脚本的副本可从以下网址获取： http://psilveyra.github.io/silveyralab/数据集和分析后的数据也可在基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）中获取，编号为 GSE111667。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667
7. 数据分析：功能分析软件
- 整理数据集，包含 miRNA 及其相应的表达对数比值和 p 值。具体数据集格式请参见表 1。
- 打开功能分析软件（版本 01-10）。
- 使用以下格式上传数据集：文件格式：“灵活格式”，包含列标题：“是”，选择标识符类型：“miRBase（成熟体）”，实验所用芯片平台：选择相应的芯片平台。
注意：支持的文件格式包括 .txt（制表符分隔的文本文件）、.xls（Excel 文件）和 .diff（cuffdiff 文件）。 - 选择“推断观测值”，并确认实验组标签正确无误。
- 进入“数据集摘要”页面，核对已比对和未比对 miRNA 的总数。
- 点击程序左上角的“新建”按钮，选择“新建 microRNA 靶标筛选器”，并上传 microRNA 数据集。
- 设置数据来源为：TarBase、Ingenuity Experts Findings、miRecords。
- 设置置信度为：实验验证或高置信度（预测结果）。
- 选择“添加列”，以包含有关靶基因的多种生物学信息，如物种、疾病、组织、通路等。
- 若需聚焦于实验中表达发生变化的靶标，可选择“添加/替换 mRNA 数据集”，并使用“表达配对”功能查找表达水平相同或不同的 microRNA。
注意：筛选分析将提供 microRNA 名称与符号、mRNA 靶标、描述靶标关系的数据来源，以及预测关系的置信度水平（图 2）。
- 点击“添加到我的通路”，将筛选后的数据集发送至通路画布，进一步探索生物学关系。
- 使用 Path Designer 创建可用于发表的 microRNA 作用模型。
- 另一种选择是进行核心分析。
- 在核心分析类型中选择“表达分析”。
- 在测量类型中选择“Expr Log Ratio”。
- 分析筛选摘要：仅考虑满足以下条件的分子和/或关系：（物种 = 小鼠）AND（置信度 = 实验验证）AND（数据来源 = “Ingenuity Expert Findings”、“Ingenuity ExpertAssist Findings”、“miRecords”、“TarBase” 或 “TargetScan Human”）。
- 设定 p 值截断值为 0.05。
- 运行分析。
注意：报告将包括：经典通路、上游调控因子分析、疾病与功能、调控效应、分子网络、分子列表等内容。
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结果
通过观察涂片中不同类型的细胞可确定小鼠动情周期的阶段（图1）。这些细胞根据其形态学特征进行识别。在动情前期，细胞几乎均为圆形、结构完整且有核的上皮细胞簇（图1A）。当小鼠处于动情期时，细胞为角化的鳞状上皮细胞，呈密集堆积的簇状（图1B）。在动情后期，可见角化上皮细胞和多形核白细胞（图1C）。在动情间期，白细胞（小细胞）通常占主导地位（图1D）。
我们按照先前描述的方案从四只小鼠肺组织中提取了RNA。核酸浓度（ng/µL）介于1197.9至2178.1之间，平均值为1583.1 ± 215（表1）。A260/A280比值在2....
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讨论
microRNA 表达谱分析是一种在疾病诊断和机制研究中均具有优势的技术。在本研究中，我们建立了一种实验方案，用于评估在不同动情周期阶段暴露于臭氧的雌性小鼠肺组织中，预测可调控炎症相关基因的 miRNA 的表达水平。已有文献描述了确定动情周期的方法，例如肉眼观察法16。然而，这些方法依赖于单次测量，因此可靠性较低。为了准确识别具有规律动情周期的雌性小鼠所经历的所有动情周期阶段，建议采用本文所述的方法。此外，这一简单方案还可用于间接估算小鼠每日的激素水平波动。为避免因阴道刺激引发不必要的炎症反应，采样应每天仅进行一次。由于动情周期长度存在个体差异，并可能受到饲养环境的影响，因此在将动物用于涉及动情周期阶段的实验前，建议先连续执行该方案两到三个完整的动情周期。
为了成功提取肺组织中的 RNA，精确的操作流程至关重要。本方案描述了一种可在一天内完成的肺组织 RNA 分离方法，能够获得高质量的 RNA。为有效提取肺组织中的 RNA，需对试剂盒说明书中的操作步骤进行若干改进。我们在加入洗涤缓冲液后增加了一次额外的离心步骤，以尽可能彻底地去除缓冲...
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）K01HL133520（PS）和K12HD055882（PS）基金的资助。作者感谢Joanna Floros博士在臭氧暴露实验方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | 8 周龄 |
| 超纯水 | 赛默飞世尔科技 | 10813012 | |
| 无菌塑料移液管 | Fisher Scientific | 13-711-25 | 容量：1.7 mL |
| 磨砂显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 2951TS | |
| 光学显微镜 | 显微镜世界 | MW3-H5 | 10倍和20倍物镜 |
| 氯胺酮注射液（美国药典） | Henry Schein 动物健康 | 55853 | 90 mg/kg。受控药物。 |
| 赛拉嗪无菌溶液 | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg。管制药品。 |
| 乙醇 | Fisher Scientific | BP2818100 | 用水将乙醇稀释至70%。 |
| 21 号针头 | BD 生物科学 | 305165 | |
| 注射器 | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| 使用剪刀 | 世界精密仪器公司 | 501221, 504613 | 14 厘米，尖/钝头，弯曲；9 厘米，直型，细尖头 |
| 镊子工具包 | 世界精密仪器公司 | 504616 | |
| 光谱 Bessman 组织研磨器 | Fisher Scientific | 08-418-1 | 载样量：10 至 50 mg |
| 无RNase的微量离心管 | 赛默飞世尔科技 | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol试剂 | 赛默飞世尔科技 | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | 赛默飞世尔科技 | ND-ONE-W | |
| miScript II RT试剂盒 | Qiagen | 218161 | |
| 小鼠炎症反应 & 自身免疫 miRNA PCR 芯片 | Qiagen | MIMM-105Z | |
| 薄壁、无DNase、无RNase的PCR管 | 赛默飞世尔科技 | AM12225 | 20 μL反应 |
| miRNeasy 血清/血浆内参对照 | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | 微软公司 | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity 信号通路分析 | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R 软件 | R 基金会 | https://www.r-project.org/ | |
| PCR仪或制冷/加热模块 | 通用实验耗材供应商 | ||
| 微型离心机 | 通用实验耗材供应商 | ||
| 实时荧光定量PCR仪 | 通用实验耗材供应商 | ||
| 多通道移液器 | 通用实验耗材供应商 | ||
| RNA 洗涤缓冲液 | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA消化缓冲液 | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA预洗缓冲液 | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| 紫外臭氧分析仪 | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| 质量流量控制器 | Sierra Instruments 公司 | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
参考文献
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