臭氧暴露小鼠在动情周期中肺部 microRNA 表达谱分析

摘要

本文介绍了一种方法，用于评估在动情周期不同阶段暴露于臭氧或过滤空气的小鼠肺组织中miRNA的表达水平，这些miRNA被预测可调控炎症相关基因。

摘要

microRNA（miRNA）表达谱分析已引起生物学和医学各个研究领域科研人员的关注。目前的研究表明，miRNA在肺部疾病的诊断与治疗中具有广阔的应用前景。本文旨在建立一种miRNA表达谱分析实验方案，用于检测在臭氧诱导的气道炎症小鼠模型肺组织中，预测可调控炎症相关基因的一组miRNA的相对丰度。由于已有研究显示，循环性激素水平可能影响雌性个体肺部固有免疫的调控，因此本方法的目的在于建立适用于雌性小鼠的炎症相关miRNA表达谱分析流程，并在臭氧暴露时充分考虑每只动物所处的动情周期阶段。此外，我们还介绍了利用R/Bioconductor软件limma进行miRNA发现与靶基因预测的生物信息学分析方法，以及通过功能分析软件解析差异表达miRNA所涉及的生物学背景及相关信号通路的方法。

引言

microRNA（miRNA）是一类短链（19至25个核苷酸）的天然非编码RNA分子。miRNA序列在不同物种间具有进化保守性，表明其在调控生理功能中具有重要作用¹。microRNA表达谱分析已被证实有助于鉴定在多种生物学过程调控中发挥关键作用的miRNA，包括免疫应答、细胞分化、发育过程以及细胞凋亡²。近年来，miRNA在疾病诊断与治疗中的潜在应用价值也逐渐受到关注。对于研究基因调控机制的科研人员而言，检测miRNA的表达水平有助于构建系统层面的调控网络模型，尤其是在将miRNA信息与mRNA表达谱及其他基因组尺度数据整合分析时，效果更为显著³。另一方面，研究表明miRNA在多种样本类型中比mRNA更稳定，且其检测灵敏度高于蛋白质⁴。这些特性促使miRNA作为生物标志物在包括肺部疾病在内的多种分子诊断应用中受到广泛关注。

在肺脏中，miRNA 在发育过程和维持内环境稳态方面发挥着重要作用。此外，其异常表达已被证实与多种肺部疾病的发生和发展相关⁵。由空气污染诱发的炎症性肺部疾病在雌性个体中表现出更严重的病情和更差的预后，表明激素和动情周期可调节肺部固有免疫及 miRNA 表达，以应对环境刺激⁶....

方案

本文所述所有方法均已获得宾夕法尼亚州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 动情周期阶段的评估

1. 使用 Machholz 等人所述的单手小鼠固定技术，正确固定一只雌性 C57BL/6 小鼠（8–9 周龄）¹⁰。
2. 用 10 μL 超纯水填充无菌塑料移液管。
3. 将塑料移液管的管尖插入阴道。
4. 轻柔冲洗液体 4–5 次以收集样本。
5. 将含有阴道液的最终冲洗液滴加至载玻片上。
6. 在光学显微镜下使用 20 倍物镜观察未染色的阴道冲洗液。
   注意：由于假孕或其他原因导致动情周期不规律的动物需从实验中剔除。建议连续至少三个动情周期每日进行阴道分泌物检查，以确认周期规律性。

2. 臭氧暴露

1. 将最多4只小鼠放入两个1.2 L的玻璃容器中，容器顶部为金属网盖，并提供自由饮用的水。
2. 将一个玻璃容器放入臭氧暴露舱，另一个放入过滤空气暴露舱。
3. 调节臭氧浓度至2 ppm，并定期监测臭氧水平。
   注意： 臭氧装置可提供受控的气流（>30次/小时换气），并控制温度（25 °C）和相对湿度（50%）。....

结果

通过观察涂片中不同类型的细胞可确定小鼠动情周期的阶段（图1）。这些细胞根据其形态学特征进行识别。在动情前期，细胞几乎均为圆形、结构完整且有核的上皮细胞簇（图1A）。当小鼠处于动情期时，细胞为角化的鳞状上皮细胞，呈密集堆积的簇状（图1B）。在动情后期，可见角化上皮细胞和多形核白细胞（图1C）。在动情间期，白细胞（小细胞）通常占主导地位（图1D）。

我们按照先前描述的方案从四只小鼠肺组织中提取了RNA。核酸浓度（ng/µL）介于1197.9至2178.1之间，平均值为1583.1 ± 215（表1）。A260/A280比值在2........

讨论

microRNA 表达谱分析是一种在疾病诊断和机制研究中均具有优势的技术。在本研究中，我们建立了一种实验方案，用于评估在不同动情周期阶段暴露于臭氧的雌性小鼠肺组织中，预测可调控炎症相关基因的 miRNA 的表达水平。已有文献描述了确定动情周期的方法，例如肉眼观察法¹⁶。然而，这些方法依赖于单次测量，因此可靠性较低。为了准确识别具有规律动情周期的雌性小鼠所经历的所有动情周期阶段，建议采用本文所述的方法。此外，这一简单方案还可用于间接估算小鼠每日的激素水平波动。为避免因阴道刺激引发不必要的炎症反应，采样应每天仅进行一次。由于动情周期长度存在个体差异，并可能受到饲养环境的影响，因此在将动物用于涉及动情周期阶段的实验前，建议先连续执行该方案两到三个完整的动情周期。

为了成功提取肺组织中的 RNA，精确的操作流程至关重要。本方案描述了一种可在一天内完成的肺组织 RNA 分离方法，能够获得高质量的 RNA。为有效提取肺组织中的 RNA，需对试剂盒说明书中的操作步骤进行若干改进。我们在加入洗涤缓冲液后增加了一次额外的离心步骤，以尽可能彻底地去除缓冲.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	000664	8 周龄
超纯水	赛默飞世尔科技	10813012
无菌塑料移液管	Fisher Scientific	13-711-25	容量：1.7 mL
磨砂显微镜载玻片	赛默飞世尔科技	2951TS
光学显微镜	显微镜世界	MW3-H5	10倍和20倍物镜
氯胺酮注射液（美国药典）	Henry Schein 动物健康	55853	90 mg/kg。受控药物。
赛拉嗪无菌溶液	Lloyd Laboratories	139-236	10 mg/kg。管制药品。
乙醇	Fisher Scientific	BP2818100	用水将乙醇稀释至70%。
21 号针头	BD 生物科学	305165
注射器	Fisher Scientific	329654	1 mL
使用剪刀	世界精密仪器公司	501221, 504613	14 厘米，尖/钝头，弯曲；9 厘米，直型，细尖头
镊子工具包	世界精密仪器公司	504616
光谱 Bessman 组织研磨器	Fisher Scientific	08-418-1	载样量：10 至 50 mg
无RNase的微量离心管	赛默飞世尔科技	AM12400	1.5 mL
TRIzol试剂	赛默飞世尔科技	15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus	Zymo Research	R2071
NanoDrop	赛默飞世尔科技	ND-ONE-W
miScript II RT试剂盒	Qiagen	218161
小鼠炎症反应 & 自身免疫 miRNA PCR 芯片	Qiagen	MIMM-105Z
薄壁、无DNase、无RNase的PCR管	赛默飞世尔科技	AM12225	20 μL反应
miRNeasy 血清/血浆内参对照	Qiagen	219610
Microsoft Excel	微软公司		https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity 信号通路分析	Qiagen		https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R 软件	R 基金会		https://www.r-project.org/
PCR仪或制冷/加热模块	通用实验耗材供应商
微型离心机	通用实验耗材供应商
实时荧光定量PCR仪	通用实验耗材供应商
多通道移液器	通用实验耗材供应商
RNA 洗涤缓冲液	Zymo Research	R1003-3-48	48 mL
DNA消化缓冲液	Zymo Research	E1010-1-4	4 mL
RNA预洗缓冲液	Zymo Research	R1020-2-25	25 mL
紫外臭氧分析仪	Teledyne API	Model T400	http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
质量流量控制器	Sierra Instruments 公司	Flobox 951/954	http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html