在暴露于臭氧的小鼠的弹性周期中的肺微 rna 分析

微 rna (mirna) 是短的 (19 到25个核苷酸), 自然存在的, 非编码 rna 分子。mirna 的序列在物种间是进化守变的, 这表明 mirna 在调节生理功能方面的重要性¹。微 rna 表达谱已被证明有助于识别在调节各种过程中非常重要的 mirna, 包括免疫反应、细胞分化、发育过程和凋亡²。最近, mirna 因其在疾病诊断和治疗中的潜在用途而被认为是公认的。对于研究基因调控机制的研究人员来说, 测量 mirna 表达可以启发系统级调控过程模型, 特别是当 mirna 信息与 mrna 特征分析和其他基因组规模数据^合并时3。另一方面, mirna 在一系列标本类型中也被证明比 mirna 更稳定, 并且也比蛋白质⁴具有更大的灵敏度。这引起了人们对 mirna 作为包括肺部疾病在内的各种分子诊断应用的生物标志物的开发的极大兴趣。

在肺中, mirna 在发育过程中起着重要作用, 维持稳态。此外, 它们的异常表达与各种肺病的发展和进展有关⁵。空气污染引起的炎症性肺病在女性中表现出更大的严重程度和更差的预后, 这表明激素和雌激素循环可以调节肺先天免疫和 mirna 的表达, 以应对环境挑战⁶. 在本议定书中, 我们利用臭氧接触----空气污染的一个主要组成部分----在没有适应性免疫力的情况下, 在雌性小鼠中诱发某种形式的肺部炎症。通过使用臭氧, 我们正在诱导气道高反应性的发展, 这与气道上皮细胞损伤和增加中性粒细胞和炎症介质在近端气道 7.目前, 还没有描述良好的协议来描述和分析整个有光泽的周期的 mirna 暴露在臭氧暴露的小鼠。

下面, 我们描述了一个简单的方法来识别有偏离周期阶段和 mirna 表达的女性小鼠的肺组织暴露臭氧。我们还讨论了 mirna 发现和目标识别的有效生物信息学方法, 重点是计算生物学。我们使用limma分析微阵列数据, limma 是一个 r/bicom导体软件, 它为分析基因表达实验8中的数据提供了一个集成的解决方案^.在使用少量 arrays2 样本比较表达时, 对limma pcr 阵列数据的分析在功率优于基于 t 检验的程序方面具有优势。为了理解 mirna 表达结果的生物学背景, 我们使用了功能分析软件。为了了解调节转录变化的机制并预测可能的结果, 该软件结合了 mirna 表达集和文献⁹中的知识。与只在与 mirna 集合重叠的情况下寻求统计丰富的软件相比, 这是一个优势。

这里描述的所有方法都得到了宾州立大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 对激烈循环阶段的评估

1. 使用 machholz 等人描述的单手小鼠约束技术, 适当约束雌性 c57bl6 小鼠 (8-9周大).
2. 用10μl 的超纯水填充无菌塑料移液器。
3. 将塑料移液器的尖端引入阴道。
4. 轻轻冲洗液体4-5 以收集样品。
5. 将含有阴道液的最后冲洗放在玻璃滑梯上。
6. 观察未染色的阴道冲洗在光显微镜下与20x 的目标。
   请注意:由于伪随机或其他原因而不显示正常周期的动物需要排除在实验之外。建议每天进行阴道分泌物至少连续三个周期, 以确认环度。

2. 接触臭氧

1. 将最多4只小鼠放入两个 1.2 l 玻璃容器中, 容器配有金属网盖和水。
2. 将一个玻璃容器放在臭氧室中, 另一个放在过滤后的空气暴露室中。
3. 将臭氧浓度调整为 2 ppm, 并定期监测臭氧水平。
   请注意:臭氧装置提供调节气流 (和 gt;30 空气变化), 可控制温度 (25°c) 和相对湿度 (50%)。如上文^所述, 该系统通过放电臭氧发生器产生臭氧, 该臭氧片由紫外线臭氧分析仪和质量流量控制器进行监测和控制。
4. 在经过3年的空气暴露后取出玻璃容器。将动物送回笼子里, 放上床上用品、食物和水。

3. 肺收集

1. 接触4小时后, 麻醉动物, 在腹腔内注射酮胺/木糖鸡尾酒 (90 mg/kg 氯胺酮, 10 mg/kg xylazine)。
   请注意:为了确认适当的麻醉水平, 检查鼠标是否有踏板反射 (坚定的脚趾捏), 并根据需要调整麻醉。
2. 用70% 的乙醇使老鼠皮肤变湿。
3. 用手术剪刀和手术推拿器做一个2厘米的中线切口, 以暴露静脉。
4. 通过静脉静脉和主动脉的横断来牺牲小鼠。如果需要, 在肾静脉上方的静脉中插入 21 g 规格针, 以便在失血过多前收集血液。或者, 按照标准协议, 通过心脏穿刺采集血液。
5. 使用手术剪刀切开腹腔, 切除皮肤上肌肉, 向上移动到肋骨。
6. 使用手术剪刀刺穿横隔膜。
   请注意:肺会从隔膜上塌陷。
7. 用手术剪刀切除胸腔, 露出心脏和肺。
8. 使用钳子, 取一个 1.5 ml 无 rnase 的微离心管, 并将其浸入液氮中, 以填充管。
   请注意:使用护目镜和防护手套处理液氮。
9. 取出肺部, 将其放入不含 rnase 的微离心机 1.5 ml 管中, 其中装有液氮, 可对组织进行冷冻, 并等待几秒钟, 直到液体蒸发。
10. 关闭管盖, 并将组织存放在-80°c, 直到使用。

4. rna 制备

1. 使用不锈钢组织粉碎机使整个肺部粉碎。
   请注意:组织粉碎机在使用前需要放置在液氮中。每次使用 rnase 解决方案后, 请清洁粉碎机。
2. 将粉碎的肺分裂成两个 1.5 ml 管 (每个半肺)。
3. 在每个样品管中加入500μl 的硫氰酸酯, 并进行混合。 每个样品分别使用 18 g、21 g 和 23 g 针进行同质化。
   请注意:在进行提取之前, 可以用 5.6 x 10 8份小 rna 尖峰控制 (来自不同物种) 的样本进行激增。
4. 在每个样品和涡旋中加入500μl 乙醇, 时间为15秒。
5. 将混合物装入收集管中的旋转柱中, 离心机以 12, 000 x g的速度装载1分钟。
6. 用于 dnase i 治疗 (列内);
   1. 在 12, 000 x g 处加入 400μl rna 洗涤缓冲液和离心机, 每次1分钟。
   2. 在无 rnase 的试管中, 加入5μl 的 dnase i 和75μl 的 1x dna 消化缓冲液并混合。将混合直接添加到列矩阵中。
   3. 在室温下孵化15分钟。
7. 在色谱柱和离心机中加入400μl 的 rna 预冲洗液, 以 12, 000 x 克的速度, 持续 1分钟. 丢弃流经并重复此步骤。
8. 在色谱柱和离心机中加入 700μl rna 洗涤缓冲液, 每次 12, 000 x克, 1分钟。
9. 离心以 12, 000 x g的速度进行2分钟的离心, 以去除剩余的缓冲液。将柱转移到无 rnase 的管中。
10. 为了清除 rna, 将35微米的 dnasis\ 无 rnase 水直接添加到色谱柱基质中, 离心机以 12, 000 x克的速度, 以1.5 分钟的速度。
11. 使用分光光度计测量总 rna 浓度 (260 纳米) 和纯度。按照说明在1.5μl 样本中进行 rna 定量。用用于洗脱的 dnasise/rnase 水将仪器空白。
    请注意:26/280 的 ~ 2.0 比一般被接受为 rna 的 "纯"。典型的 rna 浓度通常在750到 2, 500 ng/μl 之间。
12. 存放在-80°c。

5. mirna 分析

1. 要回顾性转录小 rna, 请使用总 rna 的200纳。
   1. 在冰上制备逆转录化反应混合物 (每次反应的总体积为 20μl)。对于每个反应, 加入4μl 的5倍缓冲液、2μl 的10倍核苷酸混合物、2μl 的逆转录酶和2μl 的无 rnase 水。将所有组分和等位物混合在600μl 无 rnain 塑料管中 (每次反应为10μl 的混合)。
      请注意:逆转录酶主组合包含第一链 cdna 合成所需的所有成分, 模板 rna 除外。
      请注意:在准备主混音时计算多余的体积 (10%)。
   2. 在每个含有逆转录化大师混合物的试管中加入模板 rna (200 纳克 (10μl)。在 1, 000 x 克的情况下混合离心器 15秒, 并将其储存在冰上, 直到放置在热囊或干块中。
   3. 在37°c 下孵化60分钟。
   4. 在95°c 下孵化 5分钟, 并将管子放在冰上。
   5. 在每20μl 逆转录酶反应中加入200μl 的无 rnase 水, 稀释 cdna。
2. 利用小鼠炎症反应和自体免疫 mirna pcr 阵列进行实时 pcr。
   1. 准备反应混合物 (总体积 1100μl): 对于每个反应, 添加550μl 的 2x pcr 主混合, 110μl 的10倍通用底漆混合, 340μl 的无 rnase 水, 和340μl 模板 cdna (从步骤5.1.5 稀释的反应)。
   2. 使用多通道移液器将10μl 的反应混合物添加到预装 mirna pcr 阵列的每一口井中。
   3. 用光学胶粘膜密封 mirna pcr 阵列板。
   4. 在室温下以 1, 000 x克的温度离心板 1分钟, 以去除气泡。
   5. 在95°c 下编程实时循环器, pcr 初始激活步骤 15分钟, 在94°c 下包含变性15秒的3步循环, 在55°c 下退火 30秒, 在70°c 下延长 30秒, 用于40个循环数。
      请注意:按照制造商的循环条件说明设置实时循环器。执行实时循环软件中内置的离解曲线步骤。
   6. 执行数据分析。

6. 数据分析

1. 从实时 pcr 软件中提取每个样本的 ct 值到分析软件中。
   请注意:ct 值34被视为截止值。如果样本包含尖峰控制 (例如, cel-mir-39), 则将 ct 值归一化到每个样本的控制尖峰。可能需要手动设置阈值。基线值将自动设置。
2. 将 ct 值归化为 6个 mirna 内部管理控制的平均 ct: snord61、snord68、snord72、snord95、snord96a、rnu6-2, 使用以下公式:
   ct = (ct _ target-ct _ 家政)
3. 对于折叠变化计算, 使用特定样本作为控件, 使用相对表达式方程¹²计算 ct 值:
   mirna 的相对表达:
   2^-ct, 其中-ct =-[ct 测试-ct 控制]
   请注意:折叠变化200被认为是截止。
4. 在生物导体8中, 用石灰体^包对 r 进行统计分析。
5. 正确使用 benjamini-hochberg 方法¹³进行多次比较。
   请注意: r 脚本的副本可在 http://psilveyra.github.io/silveyralab/. 数据集和分析数据也可在 gse111667 号下的基因表达综合。

7. 数据分析: 功能分析软件

1. 排列数据集。包含带有各自表达式日志比率和 p 值的 mirna。有关特定数据集格式, 请参阅表 1 。
2. 打开功能分析软件 (版本 01-10)。
3. 使用以下格式上传数据集: "灵活格式"、包含列标题: "是"、选择标识符类型: "mirbase (成熟)"、用于实验的阵列平台: 选择阵列平台。
   请注意:接受的文件格式是. txt (选项卡分隔的文本文件)、. xls (excel 文件) 和. diff (袖口文件)。
4. 选择 "输入观察" 并验证实验组标记是否正确。
5. 转到 "数据集摘要" 以修改映射和未映射的 mirna 的总量。
6. 点击程序左上角的 "新" 按钮。选择 "新的微 rna 目标筛选器" 并上传微 rna 数据集。
   1. 将来源设置为: tarbase, 创新专家发现, miRecords。
   2. 将置信度设置为: 实验观察或高 (预测)。
   3. 选择 "添加列" 以包括有关目标的各种生物信息, 如物种、疾病、组织、路径等。
   4. 要关注实验中表达式已更改的目标, 请选择 "添加/替换 mrna 数据集"。使用 "表达式配对" 定位具有相同或不同表达级别的微 rna。
      请注意:过滤分析将提供微 rna 名称和符号、mrna 靶标、描述目标关系的源以及预测关系的置信度 (图 2)。
7. 单击 "添加到我的路径" 将筛选的数据集发送到路径画布, 并探索更多的生物关系。
8. 使用路径设计器创建微 rna 效果的发布质量模型。
9. 另一种选择是创建核心分析。
   1. 对于核心分析类型, 选择 "表达式分析"。
   2. 对于测量类型, 请选择 "扩展日志比率"。
   3. 分析筛选器摘要: 仅考虑分子和/或关系, 其中: (物种 = 鼠标) 和 (信心 = 实验观察) 和 (数据源 = "天才专家发现", "inity 专家协助发现", "miRecords 记录", "tarbase", or "targetscan 人 ")。
   4. 选择 p 值 = 0.05 的截止时间。
   5. 运行分析。
      请注意:该报告将包括: 规范途径, 上游调节器分析, 疾病和功能, 调节器效应, 网络, 分子和更多。

在涂片中观察到的不同细胞类型用于识别小鼠的有嗅觉周期阶段 (图 1)。这些都是通过细胞形态来识别的。在前体过程中, 细胞几乎完全是圆形、形成良好的有核上皮细胞 (图 1a)。当小鼠处于雌激素阶段时, 细胞是有组织的鳞状上皮细胞, 存在于密集的集群中 (图 1 b)。在流星层, 有组织的上皮细胞和多态核白细胞被看到 (图 1c)。在双星中, 白细胞 (小细胞) 通常更为普遍 (图 1d)。

我们按照前面描述的协议从四个老鼠肺部提取 rna。核酸浓度 (ng/μl) 在1971年至21.8.1 之间, 平均为 153.1±215 (表 1)。平均 a260a280 比从2.010 到2.010 波动, 平均为2.016±0.002。另一方面, 观测到的 a260a230 比率在2.139 和2.139 之间振荡, 平均值为2.177±0.018。

表 2显示了用r 上的 limma得到的微分表达式结果。我们计算了暴露在臭氧或暴露在前列腺中的过滤空气中的小鼠之间最大的差异表达 mirna (使用命令可顶部)14。第一列给出了臭氧和过滤后的空气暴露动物之间 mirna 表达的 log2 倍变化的值。列 t 表示在比较中为每个 mirna 计算的适度 t 统计。列 p. 值和 adj.p.value 分别表示多个测试调整之前和之后的每次比较的关联 p 值。利用 benjamini 和 hochberg 的方法对错误发现率15进行了多次比较调整。列 b 表示 mirna 不同表达的对数赔率为8。

我们进行了 mirna 靶向过滤和核心分析, 其中包括浓缩途径分析。上传了14个带有显著表达记录比和 p 值的 mirnasa 列表后, 所有这些都是由 mirna 目标滤波器绘制的 (表 3)。结果被过滤和排序, 以获得某些途径, 在这种情况下, "细胞免疫反应"。核心分析提供了有关规范路径、疾病和功能、调节器和网络的信息 (表 4)。功能分析软件产生了一个网络分析, 显示了感兴趣的 mirna 与其他分子之间的关系 (图 3)。

图 1: 有光泽的周期阶段的标识.(a) 前雌激素 (主要是有核的上皮细胞);(b) 发情 (主要是无核的有组织细胞);(c) 流星 (所有三种类型的细胞);和 (d) 地系 2 (大多数白细胞)。刻度杆 = 100μm. 放大倍率 = 20x。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 功能分析软件代表性结果: mirna 目标滤波器.在有光泽的周期的不同阶段的 mirna 的综合轮廓。执行 mirna 过滤后, 该软件提供了与疾病和其他表型相关的基因和化合物的详细列表, 这些基因和化合物可以进行过滤和排序, 以获得某些途径, 在这种情况下是 "细胞免疫反应"。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 功能分析软件代表性结果: 网络.比较在有月经周期的不同阶段受过滤空气或女性臭氧接触影响的网络。暴露在过滤空气中的雌性小鼠肺部与非雌激素 (a) 或非雌激素期臭氧相关的生物网络图 (b)。fuentes 等人对这一数字作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1: 来自四只小鼠纯化肺组织样本的 rna 浓度和吸收率在260、230和280纳米的示例.用分光光度计测定了浓度。

表 2:利马在暴露于臭氧的女性中不同表达 mirna 的分析结果vs. 在前置阶段过滤过的空气.

表 3: 将数据集上载到功能分析软件的示例格式.可以将多个实验差分表达式分组到一个电子表格中并上载, 并可根据需要添加尽可能多的观察结果。列: 1) mirna id;2) 观察 1: 库分比率;3) 观察1:p 值;4) 观察 2: 库分比率;5) 观察2:p 值。

表 4: 功能分析软件非雌激素与非雌部的女性接触臭氧的摘要。功能分析软件允许分析顶级规范路径、上游调节器、疾病 & 功能、顶级功能、调节器效应网络等。该表格已从 fuentes 等人6人处修改。

提交人声明, 他们没有相互竞争的利益。