Summary
Primaire acinaire cel isolatie, eiwit expressie of activiteit modulatie, cultuur en stroomafwaarts toepassingen zijn heel nuttig in de ex vivo studie van acinaire-naar-ductaal metaplasie (ADM), een vroege evenement in de ontwikkeling van alvleesklierkanker.
Abstract
De differentiatie van acinaire cellen naar ductaal cellen tijdens pancreatitis en in de vroege ontwikkeling van pancreatic kanker is een belangrijke proces dat verdere studie vereist. Om te begrijpen van de mechanismen biedt reguleren acinaire-naar-ductaal metaplasie (ADM), ex vivo 3D cultuur en differentiatie van primaire acinaire cellen naar ductaal cellen vele voordelen ten opzichte van andere systemen. Met de techniek hierin is modulatie van eiwit expressie eenvoudig en snel, waarbij slechts één dag te isoleren, stimuleren of viraal besmetten, en beginnen met het kweken van primaire acinaire cellen om te onderzoeken het ADM-proces. In tegenstelling tot via kelder membraan matrix, het zaaien van acinaire cellen clusters in collageen ik extracellulaire matrix, kunt acinaire cellen te behouden hun acinaire identiteit voor manipulatie. Dit is cruciaal bij het testen van de bijdrage van de verschillende onderdelen aan de inductie van ADM. Niet alleen zijn de gevolgen van cytokines of andere ectopically door de overheid gereguleerde factoren testbare via deze techniek, maar de bijdrage van de gemeenschappelijke mutaties, verhoogde eiwit expressie of knockdown van eiwit expressie is testbare via virale infectie van primaire acinaire cellen, met behulp van adenovirale of lentivirale vectoren. Bovendien cellen kunnen worden opnieuw afgezonderd van collageen of kelder membraan matrix op het eindpunt en geanalyseerd voor eiwit expressie.
Introduction
Acinaire-naar-ductaal metaplasie (ADM) is een beschermend mechanisme tijdens pancreatitis en een belangrijke proces rijden van pancreatic kanker ontwikkeling1 waarvoor verdere mechanistische inzicht. Ontsteking-geïnduceerde ADM weliswaar omkeerbare2, oncogene KRAS mutaties, die in 90% van pancreatic kanker gevallen3aanwezig zijn, te voorkomen dat differentiatie terug naar een acinaire fenotype4,5, 6. Culturing en differentiatie van primaire acinaire cellen in ductaal cellen in 3D cultuur zorgt voor de studie van de moleculaire mechanismen tot regeling van het ADM-proces, dat is moeilijk om te studeren in vivo. Dergelijke ex vivo studies inschakelen visualisatie in real time van ADM, de bestuurders en de regelgevers. Diverse stuurprogramma's van de ADM-proces, evenals de mechanistische inzicht op hun downstream signaalroutes, zijn geïdentificeerd of geverifieerd met behulp van de hier beschreven methode. Deze omvatten ADM inductie door TGF-α (alpha-transformatie groeifactor)-gemedieerde uitdrukking van MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) en activering van Inkeping7, evenals RANTES (geregeld op activering, normale T cel uitgedrukt en uitgescheiden; ook bekend Als chemokine ligand 5 of CCL5) en TNFα (tumor necrose factor Alfa)-geïnduceerde ADM via activering van NF-recombination (nucleaire factor-recombination)8. Een extra bemiddelaar van ADM is oncogene KRas9,10, waardoor een stijging van de oxidatieve stress die vergroot het ADM-proces door middel van de verhoogde expressie van EGFR (epidermale groeifactor receptor) en de liganden, EGF) epidermale groeifactor) en TGF-α11.
Terwijl het gebruik van pancreatic kanker cellijnen is gebruikelijk voor in vitro studies, bieden primaire celculturen vele voordelen. Bijvoorbeeld, primaire acinaire cellen van niet-transgene muizen of muizen herbergen initiatiefnemende mutaties, zoals KrasG12D, zijn het meest geschikte model voor het bestuderen van de vroege gebeurtenis van ADM, omdat de cellen enkele en gecontroleerde mutaties hebben, die bekend is dat ze aanwezig zijn in het begin van pancreatic kankerontwikkeling. Dit is in tegenstelling tot vele alvleesklierkanker cellijnen die meerdere mutaties hebben en gevarieerd expressie gebaseerd op passage nummer12. Bovendien zijn de signaalroutes geïdentificeerd door daartoe geverifieerd door dierproeven. Een waarschuwing van het gebruik van primaire acinaire cellen is dat ze niet kunnen zijn transfected als typische kanker cellijnen kunnen.
De methode hierin een overzicht van de technieken van acinaire cel isolatie, 3D cultuur die ADM bootst door het toevoegen van stimulerende middelen of modulerende eiwit expressie via adenovirale of lentivirale infectie, evenals opnieuw isolatie van cellen op het eindpunt voor verdere analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de Mayo kliniek IACUC.
1. voorbereiding van de materialen, oplossingen en 3-dimensionale Matrix Bases
- Gesneden 500 µm en 105 µm polypropyleen mazen in 76 mm door 76 mm pleinen. Elk vierkant doormidden tweemaal maken een kleinere gevouwen square fold. Plaats een 500 µm en een 105 µm mesh plein in een autoclaaf etui.
- Autoclaaf polypropyleen mesh pleinen, evenals twee paar van schaar en pincet.
-
Breng 100 mL 10 x Waymouth de oplossing. Roer 1 ampul (14 g) Waymouth de poeder in 50 mL gedeïoniseerd water (DI) en is opgelost, Voeg 30 mL natriumbicarbonaat 7,5% (75 g/L). Breng het eindvolume tot 100 mL met behulp van DI water en filter steriliseren.
- Winkel 10 x Waymouth de media bij 4 ° C en gebruik te bereiden collageen gels en 1 x Waymouth. Wanneer precipitaten formulier, verwijderen.
- Breng 50 mL 1 x Waymouth de volledige media per alvleesklier door toevoeging van 125 µL van 40 mg/mL soja trypsine remmer, 12,5 µL van 4 mg/mL dexamethason en 500 µL van foetale runderserum (FBS). Steriliseren door filtratie en gebruik binnen 48u.
-
Bereiden van 3-dimensionale matrix honken met behulp van collageen of kelder membraan matrix (zie tabel van materialen voor productinformatie). Wanneer de base pipetteren, plaats de plaat op ijs, vermijden bubbels en draaien de plaat onmiddellijk na pipetteren van elk putje volume om ervoor te zorgen volledige dekking.
- Collageen honken maken door het mengen van de volgende onderdelen op ijs in een weefselkweek kap: 5,5 mL van type ik rat staart collageen, 550 µL van 10 x Waymouth van Media en 366.6 µL van 0,34 M NaOH (gefilterd).
Opmerking: Dit is genoeg oplossing om collageen grondslagen voor een 24-well, 12-well of 6-well plaat. Ene plaat is voldoende voor acinaire isolatie uit één alvleesklier. - Gebruik de volgende volumes aan de plaat van de collageen-base: 80 µL (8-well glasplaatje), 200 µL (24-well plaat), 400 µL (12-well plaat) of 800 µL (6-well plaat).
- Voor het membraan van de kelder baseert matrix, Pipetteer de matrix zonder enige aanvullende onderdelen. Gebruik de volgende hoeveelheden voor elk putje: 50 µL (8-well glasplaatje), 120 µL (24-well plaat), 240 µL (12-well plaat) of 600 µL (6-well plaat).
- Laat de honken stollen gedurende ten minste 30 min. in een cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) voordat u een tweede laag van matrix met ingesloten cellen op de top van deze bases (stap 4).
- Collageen honken maken door het mengen van de volgende onderdelen op ijs in een weefselkweek kap: 5,5 mL van type ik rat staart collageen, 550 µL van 10 x Waymouth van Media en 366.6 µL van 0,34 M NaOH (gefilterd).
- Houd een bekerglas van 600 mL, drie 50 mL tubes, een gesteriliseerde met autoclaaf paar van schaar, een gesteriliseerde met autoclaaf paar pincet en een ijsemmer onder de motorkap met drie wegen boten ter voorbereiding van acinaire isolatie. Controleer vervolgens 30 mL HBSS met 300 µL van 100 x penicilline-streptomycine, elk van twee wegen boten 10 mL ingebruikneming en het houden van de laatste 10 mL in een tube van 50 mL (voor gebruik in stap 1.8.2 en 2.1.4).
- Breng 40 mL HBSS + 5% FBS, 20 mL HBSS + 30% FBS, en 5 mL 2 mg/mL collagenase in HBSS. De collagenase steriliseren door filtratie (0,22 µm porie) en houden bij kamertemperatuur. Houd elk van de oplossingen van de HBSS op ijs.
-
Monteren van een werkruimte voor dissectie van de alvleesklier, die kan worden gedaan op een bankje lab.
- Plaats een absorberend stootkussen op tafel, samen met een deksel van polystyreen bedekt met folie. Plaats dan een papieren handdoek met 4 pinnen op de top van de folie.
- De volgende items te houden binnen het bereik van de dissectie-werkruimte: een tas van verbranding, één set gesteriliseerde met autoclaaf schaar en pincet, een spray fles met 70% ethanol en een ijsemmer (met de tube van 50 mL van HBSS met penicilline-streptomycine uit stap 1.6).
- Stel in een centrifuge op 4 ° C en een shaker tot 37 ° C.
2. acinaire cel isolatie
-
De muis via CO2 inductie offeren, en het uitvoeren van cervicale dislocatie. Onmiddellijk ontleden de alvleesklier. Ontleden van de alvleesklier, de eerste pin de poten van de muis om het deksel van polystyreen, oriënteren van de muis, zodanig dat de staart wordt geconfronteerd met de onderzoeker en de buik spuiten met 70% ethanol.
Opmerking: de muis gebruikt in de representatieve resultaten was een 12 - weken oude niet-transgene vrouw met C57BL/6 achtergrond. Muis selectie wordt verder besproken in de sectie discussie.- Met behulp van een set van gesteriliseerde met autoclaaf schaar en pincet, lift de vacht/huid met de verlostang op de middellijn en met de schaar te maken van een incisie door de vacht en huid van de urethrale opening naar het middenrif/ribbenkast gebied.
- Maak extra insnijdingen links en rechts, zodat de vacht/huid wordt gesneden weg naar het maken van een duidelijk beeld van de buikholte. Vervolgens snijd in de peritoneale bekleding (in het midden en naar rechts en naar links) en trek hem uit de buurt van de organen, zoals werd gedaan met de vacht/huid.
- Til de darmen met de pincet en zet het aan de linkerkant van de muis ruimte om te zien de alvleesklier, die is licht roze van kleur, en gekoppeld aan de milt, oftewel een donker rode ovaal. De alvleesklier weefsel wordt gekenmerkt door zijn zachte, sponsachtige textuur. Knip de alvleesklier die zal lopen langs de maag en verstrengelen met de darmen.
- De milt te scheiden van de alvleesklier. Vervolgens zet de alvleesklier in een tube van 50 mL met 10 mL HBSS met 1 x penicilline-streptomycine en breng dit aan de laminaire flow kap.
Opmerking: De resterende stappen van het protocol moeten worden gedaan met behulp van steriele techniek in een laminaire flow-kap.
- Giet de alvleesklier en HBSS (met penicilline-streptomycine) in een lege wegen boot en, met behulp van Tang, de alvleesklier wassen door het zwenken. Vervolgens verplaatst u de alvleesklier met de verlostang naar een tweede wegen boot met HBSS (met penicilline-streptomycine). Nogmaals, de alvleesklier wassen door zwenken.
-
Verplaats de alvleesklier naar de derde HBSS (met penicilline-streptomycine)-Weeg met boot en beginnen de alvleesklier snijden in kleine stukjes van 5 mm of minder. Giet vervolgens de alvleesklier stukken en HBSS in een lege 50 mL-buis.
- Om dit te doen, gebruik de verlostang de alvleesklier om stukken te verplaatsen in de vloeistof zoals de weeg-boot is wordt getipt. Giet zodra alle stukken zijn niet langer gekoppeld aan de weeg-boot. Pikken van eventuele resterende stukken met de pincet en wassen van de verlostang in de tube van 50 mL, met de alvleesklier in HBSS met penicilline-streptomycine.
- Centrifugeer bij 931 x g gedurende 2 min bij 4 ° C en de HBSS (en geen vet die zweeft) waarbij het af met een 5 mL-pipet.
- Voeg 5 mL van collagenase (verdund in HBSS in stap 1.7) om de alvleesklier. Zorgen voor een gesloten deksel door inwikkeling van de tube van 50 mL in kunststof paraffine film en plaats het dan in een broedmachine schudden bij 220 omwentelingen per minuut gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: De tijd van de spijsvertering collagenase variëren, zoals in de discussie. Aan het eind van de incubatie, moeten geen grote stukken van weefsel blijven. - Om te stoppen met de dissociatie, plaatst u de alvleesklier-bevattende buis op ijs en voeg 5 mL koude HBSS + 5% FBS. Centrifugeer bij 931 x g gedurende 2 min bij 4 ° C en vervolgens Pipetteer af de bovendrijvende vloeistof met behulp van een pipet 5 mL.
- Resuspendeer in 10 mL HBSS + 5% FBS en centrifuge op 931 x g gedurende 2 minuten bij 4 ° C. Pipetteer af van het supernatans dat met behulp van een 5 mL-pipet en herhaal deze stap met een ander 10 mL HBSS + 5% FBS.
- Resuspendeer in 5 mL HBSS + 5% FBS en, met behulp van een P1000, breng 1 mL tegelijkertijd via een maaswijdte van 500 µm in een tube van 50 mL. Voeg een extra 5 mL HBSS + 5% FBS via de Maas met een P1000 te wassen van alle resterende pancreatic cellen via de Maas.
- Zet de celsuspensie van de 500 µm Maas door de mazen van 105 µm door pipetting 1 mL tegelijk met behulp van een P1000. Volgende, pipet zachtjes de celsuspensie in een buis met HBSS + 30% FBS. Een laag van celsuspensie zal vormen aan de bovenkant; bij centrifugeren, zal de acinaire cellen dalen tot een pellet.
-
Centrifugeer bij 233 x g gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 x Waymouth de volledige media.
- Als de procedure rechtstreeks naar verankering van cellen in collageen of kelder membraan matrix, resuspendeer in een volume van 7 mL per alvleesklier. Als u adenovirale of lentivirale infectie, resuspendeer in 4 mL per alvleesklier.
3. virale infectie
-
Zoals een alvleesklier voldoende voor twee virale infecties is (controle en experimentele, bijvoorbeeld null en cre), splitsen de celsuspensie tussen de deksels van twee 35 mm platen. Met behulp van het deksel van de platen zorgt voor infectie in opschorting en daarom gemakkelijk verkeer op het definitieve substraat later.
- Bij het werken met virus, geniet u alle gebruikte Pipetteer tips in 10% bleekwater voor ten minste 15 minuten.
Opmerking: Gebruik van de 35 mm platen en het volume van de 4 mL werkt goed voor cellen van niet-transgene muizen tussen 8 en 16 weken oud. De grootte van de plaat en het volume moet mogelijk worden aangepast voor dieren met kleinere of grotere pancreata.
- Bij het werken met virus, geniet u alle gebruikte Pipetteer tips in 10% bleekwater voor ten minste 15 minuten.
- Toevoegen voor adenovirale infectie, het virus (met een titer van ten minste 107 TU/mL) bij een verdunning van de 1:1,000 op het deksel van elke plaat en swirl (Figuur 2, GFP adenovirus). Plaats de platen in een cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) en swirl van elke 15 minuten voor 1 h. doorgaan incubatie voor een extra 2 h en vervolgens overgaan tot verankering van cellen in collageen of kelder membraan matrix.
- Na het voltooien van virale werk in de kap, geniet van alle componenten in de kap met 10% bleekwater voor ten minste 15 minuten en vervolgens grondig schoon het bleekmiddel uitschakelen met behulp van 70% ethanol.
4. verankering van cellen in collageen of kelder membraan Matrix
- Make collageen gel op ijs door het combineren van 7 mL typ ik rat staart collageen (3.3 mg/mL), 700 µL van 10 x Waymouth van media en 466.6 µL van 0,34 M NaOH.
-
Nemen van gelijke hoeveelheid collageen gel en cel schorsing, voorzichtig mengen. Als een stimulans of remmer toevoegen, kunt u dit combineren met de collageen-celsuspensie. Een goed plaat tegelijk (platen uit stap 1.5.3); houden van de plaat op ijs, swirl om de collageen-cellaag gelijkmatig te verdelen.
- In elk putje, Pipetteer de volgende hoeveelheid collageen-celsuspensie: 200 µL (8-well glasplaatje), 500 µL (24-well plaat), 1000 µL (12-well plaat) of 2000 µL (6-well plaat). Merk op dat ADM wordt geïnduceerd via stimulatie met TGF-α (50 ng/mL) in Figuur 2.
- Meng voor de verankering van cellen in kelder membraan matrix, één-delige kelder membraan matrix met twee-onderdelen celsuspensie. Zoals met collageen, houden de matrix-celsuspensie evenals de plaat op ijs. Pipetteer een goed tegelijk gebruik van de dezelfde volumes in 4.2.1 en swirl voor gelijkmatige verdeling hebt genoteerd.
- Plaats de plaat in een cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 30 minuten om te stollen en voeg vervolgens 1 x Waymouth de volledige media met een stimulans of remmer (Figuur 2 gebruikt TGF-α bij 50 ng/mL). Wijzig de media (met stimulans of remmer) de volgende dag en dan elke andere dag. Afhankelijk van de stimulus, ADM waarneembaar tussen dag 3 en dag 5.
5. het oogsten van cellen uit collageen of kelder membraan Matrix
- Verzamelen van de volgende materialen die nodig zijn voor het oogsten van cellen uit collageen: 30 mL 1 mg/mL collagenase verdund in HBSS, 40 mL koude HBSS, 31 mL koud PBS, twee spatels, twee buizen van 50 mL en ijs. Pas het aantal spatels, buizen en hoeveelheid oplossingen als vergelijking van meer dan twee kweekomstandigheden (waarbij elke voorwaarde is ½ van een plaat). De centrifuge ingesteld op 4 ° C en de schudden incubator tot 37 ° C.
- Verwijder het medium en spatels voor het verwijderen van de collageen-schijven met ingesloten cellen gebruiken. Voor elke voorwaarde, zetten de schijven in een afzonderlijke, lege tube 50 mL.
- Voeg 10 mL 1 mg/mL collagenase in HBSS aan elke 50 mL-buis. Wikkel de buizen met kunststof paraffine film en zet in een 37 ° C incubator schudden bij 225 t/min voor maximaal 45 minuten. Controleren van de spijsvertering en buizen verwijderen wanneer er niet meer zichtbaar collageen is.
- Centrifugeer bij 233 x g bij 4 ° C gedurende 2 min met minimale vertraging. Opstijgen het supernatant en resuspendeer in 5 mL collagenase oplossing per buis. Verteren in een 37 ° C incubator schudden bij 225 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten of zolang er geen geen zichtbare collageen.
-
Stop de spijsvertering door toevoeging van 5 mL koude HBSS en vervolgens centrifugeren bij 233 x g gedurende 2 min bij 4 ° C met minimale vertraging.
- Resuspendeer in 15 mL koude HBSS en opnieuw Centrifugeer bij 233 x g gedurende 2 min bij 4 ° C met minimale vertraging. Herhaal deze procedure.
- Resuspendeer de pellet in 1 mL PBS en verplaats naar 1,5 mL-buis. Centrifugeer in een emmer swing bij 233 x g gedurende 2 min bij 4 ° C met minimale vertraging. Verwijder supernatant en module-freeze in vloeibare stikstof of droog ijs.
Opmerking: De pellet cel kan worden opgeslagen bij-70 ° C of onmiddellijk in stroomafwaarts toepassingen gebruikt. - Om te oogsten kelder membraan matrix-embedded cellen, Pipetteer media uit elke bron in een 50 mL-buis op ijs. Vervolgens kelder membraan matrix de oplossing van de gegevensterugwinning toevoegen aan elk putje en schraap het mengsel van cel-gel in de tube van 50 mL.
Opmerking: Het volume van de oplossing van de gegevensterugwinning van de matrijs van de kelder membraan om toe te voegen aan elk putje is als volgt: 150 µL (8-well glasplaatje), 420 µL (24-well plaat), 845 µL (12-well plaat) en 2.000 µL (6-well plaat). - Spoel elk goed tweemaal met de kelder membraan matrix oplossing van de gegevensterugwinning, het toevoegen van de spoelen aan de tube van 50 mL.
Opmerking: Het volume van de oplossing van de gegevensterugwinning van de matrijs van de kelder membraan voor elke spoeling is als volgt: 150 µL (8-well glasplaatje), 420 µL (24-well plaat), 845 µL (12-well plaat) en 2.000 µL (6-well plaat). - Verlaten van de buis op ijs gedurende 1 uur of totdat de kelder membraan matrix oplost en volgen met centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL koude PBS (mag overdragen tot 1,5 mL koker als cel pellet is gewenst).
- Centrifugeer bij 3500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en ofwel module bevriezen de cel pellet of toevoegen van lysis-buffermengsel en direct overgaan tot de downstream toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voltooiing van het protocol hierin treedt op binnen één dag en na stimulatie, ADM wordt gezien in 3-5 dagen. Figuur 1 toont de volgorde van de methode, waarbij stappen 1 t/m 4 zijn voltooid op de eerste dag. Dit omvat de voorbereiding, de acinaire isolatie, de virale infectie en de verankering in collageen of kelder membraan matrix. Terwijl de kelder membraan matrix ADM induceert, acinaire cellen binnen collageen ik nodig een stimulans, zoals TGF-α, ondergaan differentiatie naar ductaal cellen. Op dag 1, cellen in collageen of kelder membraan matrix hebben een druif-achtige ronde uitstraling en als gebruik makend van virale infectie met een vector uiting van een fluorescente proteïne, infectie-efficiëntie kan worden gecontroleerd. Door dag 5, zal de cellen collageen leidingen vormen als een stimulans gegeven op het moment van verankering en als een aanvulling in de media, die op de dagen 1, 3 en 5 wordt gewijzigd. Cellen die zijn ingesloten in kelder membraan matrix leidingen bij gebrek aan een stimulans zal vormen, maar op stimulatie grotere buizen vormen, zoals te zien in Figuur 2.
Figuur 1 : Schema van de procedure te isoleren lymfkliertest primaire acinaire cellen moduleren eiwit expressie en/of stimuleren acinaire-naar-ductaal metaplasie en insluiten van cellen in collageen of kelder membraan matrix. De workflow bevat Isolatievan acinaire cellen, waaronder dissectie van de alvleesklier, spijsvertering en filtratie van de cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatieve resultaten van primaire acinaire cellen verguld binnen collageen of kelder membraan matrix na adenovirale infectie en stimulatie met TGF-α. Primaire acinaire cellen van een niet-transgene muis besmet waren met GFP-adenovirus, ingebed in collageen ik of kelder membraan matrix en gestimuleerd met of zonder TGF-α (50 ng/mL). Vierentwintig uur na besmetting met adenovirus GFP, beelden werden gevangen genomen om weer te geven van de efficiëntie van de infectie. Op vijf dagen na infectie duiden de beelden de verschillen in de cellen gestimuleerd met of zonder TGF-α in collageen of kelder membraan matrix. Buis-achtige structuren worden aangegeven door witte pijlpunten en bars vertegenwoordigen die 50 µm. beelden werden verkregen met behulp van een confocal microscoop met de doelstelling van de EG Plan-Neofluar 10 x / 0.3 M27 schalen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De relatief korte hoeveelheid tijd voor isolatie, infectie en primaire acinaire cellen plating is een voordeel van deze methode. Daarentegen weinig hands-on tijd kweken acinaire cellen van een uitvloeisel explant vereist, maar het duurt zeven dagen voor de uitgroei van acinaire cellen13. Een alternatieve protocol voor acinaire isolatie14 merkt een zeer korte methode voor het verkrijgen van acinaire cellen; EFG is echter een essentiële component in de acinaire cellen bij geïsoleerd met behulp van dat protocol levend te houden. Aangezien EGF differentiatie van acinaire cellen naar ductaal cellen stimuleert, is de methode hierin, die geen ADM-stimuleren onderdelen voor cultuur vereist, beter voor de studie van de mechanismen van inductie of regulering van ADM. Bij deze methode wordt acinaire cel identiteit gehandhaafd tijdens het kweken in collageen tenzij gestimuleerd om te differentiëren in ductaal cellen. Bovendien zijn moeilijkheden in transfecting primaire cellen via eiwit expressie manipuleren overwonnen door virale infectie.
Deze procedure biedt directe studie van ADM, door welke visualisatie van ductaal structuur inductie via helderveld en/of immunofluorescentie microscopie optreden kan. Voor imaging-toepassingen, zijn kamer slides (vermeld in de Tabel van materiaal) best. Fixatie gedurende 15 minuten bij 37 ° C met 4% paraformaldehyde zal cellen ingebed in kelder membraan matrix zonder storende ductaal structuren bevestigen. Tijdens deze incubatie, de kelder membraan matrix zal Uitvloeien en met de paraformaldehyde zachtjes af kan worden pipetted. Immunofluorescentie op collageen ingesloten cellen wordt in detail in de aanvullende protocollen15,16beschreven. Verdere toepassingen voor analyses van betrokken signalering mechanismen op het eindpunt van het experiment zijn westelijke vlek, qPCR en fluorescentie-activated cell sorting (FACS). Één zesde van een alvleesklier is voldoende materiaal voor één monster analyse via de westelijke vlek of qPCR.
Beperkingen van dit protocol voortvloeien uit het gebruik van collageen of kelder membraan matrix, waar elk hun voor- en nadelen heeft. Terwijl verankering van cellen in collageen alleen buizen produceren zal als prikkels worden gegeven, zal kelder membraan matrix verankering leidingen zonder extra prikkels produceren. Ductaal grootte in kelder membraan matrix is echter een meetbare uitgang. Een extra beperking is de tijd die betrokken zijn bij de oogst procedures in stap 5, die de genexpressie kunnen beïnvloeden. Deze beperking kan worden verzacht door de bevestiging van de resultaten van het westelijke bevlekken met immunofluorescentie, waarin de tijd fixatie aanzienlijk minder dan die van de rooitijd voor qPCR of westelijke vlekkenanalyse is.
Naast adenovirale infectie, kan lentivirale infectie worden gebruikt in elektrische elementen. Voor lentivirale infectie, toevoegen 6 µg/mL virale infectie enhancer reagens (zie tabel van materialen) aan de cellen en voorzichtig swirl van de platen. Voeg vervolgens de lentivirus (met een titer van ten minste 107 TU/mL) bij een verdunning 1:1,000 en weer, zachtjes wervelen. Incubeer gedurende 3-5 uur (37 ° C, 5% CO2) en gaat u verder met de verankering van cellen in collageen of kelder membraan matrix. Voor het genereren van lentivirus met een plasmide van belang, de mengeling van de lentivirale verpakking vermeld in de tabel van materialen te gebruiken.
Verdere wijziging kunt isolatie van cellen uit muizen uiting van KrasG12Dopnemen. In deze muizen, die reeds fibrotische gebieden met ADM en PanIN laesies, duurt collagenase vertering langer. Zorgvuldige monitoring van collagenase de spijsvertering, zoals beschreven in de kritische stappen en oplossen van problemen, is vereist. Het meer abnormale weefsel een muis heeft, hoe langer de vertering vindt (ongeveer een uur voor een twaalf-week-oude p48Cre; LSL-KrasG12D muis). Aangezien er kunnen enorme variatie tussen muizen van dezelfde leeftijd, adviseren wij om te isoleren acinaire cellen van een muis LSL -KrasG12D en adenovirale of lentivirale infectie met behulp van cre om te verkrijgen oncogene KRas expressie uitvoeren. Ook moet opgemerkt worden dat ons protocol is geoptimaliseerd voor isolatie van acinaire cellen om de ADM-proces te onderzoeken. Het isolement van ADM en PanIN cellen van KrasG12D-protocollen uiting van muizen voor organoid cultuur vereist gewijzigd.
Een essentiële stap is de hoeveelheid tijd die de gehakte alvleesklier in collagenase besteedt. De ideale collagenase spijsvertering tijd kan variëren van muis tot muis en tussen veel collagenase uit hetzelfde bedrijf. De tijd vermeld in het protocol is geschikt voor pancreata met een gewicht van over 0.250 g. te veel tijd kan beschadigen en doden de cellen, terwijl te weinig tijd leiden onvolledige spijsvertering tot zal en dus minder cellen die zal maken door middel van het filterproces op de laatste plaat. De dissociatie visueel controleren door te kijken naar de verdeling van de stukken gehakt-up alvleesklier; de oplossing moet wenden bewolkt. Bovendien, voordat u de collagenase reactie met koude HBSS stopt, kan de oplossing worden genomen met een 5 mL-pipet, waar het gemak waarmee de oplossing kan worden overgenomen zal aangeven als is geschikt om te stoppen met de reactie. Een extra overweging is het aantal pancreata geoogst. Als er meer dan is één alvleesklier geïsoleerd op hetzelfde moment, de procedure werkt het best wanneer de pancreata worden apart gehouden.
Een ander belangrijk punt om gezonde cultuur van primaire acinaire cellen is dat zorg moet worden genomen wanneer de acinaire cell oplossing pipetteren. Krachtig pipetteren kan veroorzaken celbeschadiging en leiden tot een gebrek aan de vorming van de buis, zelfs met de toevoeging van bekende ADM inductoren, zoals TGF-α. Verder, als er problemen zijn levensvatbaarheid, het centrifugeren in stap 2.4, 2.6 en 2.7 kan men tot 300 x g zich produceren een zachtere pellet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de R01 (CA200572) van de NIH naar Psalm De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van het National Cancer Institute of financiers had geen rol in de nationale instituten van Health.The ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besluit om te studeren publiceren, of de bereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
