Summary
Isolement des cellules acineuses primaire, modulation expression ou l’activité de protéines, la culture et des applications en aval sont abondamment utiles ex vivo étude de métaplasie acineux-à-canalaire (SMA), un événement précoce dans le développement du cancer du pancréas.
Abstract
La différenciation des cellules acineuses de canalaire au cours de la pancréatite et dans le développement précoce du cancer du pancréas est un processus essentiel qui nécessite une étude plus approfondie. Pour comprendre les mécanismes de régulation métaplasie acineux-à-canalaire (SMA), ex vivo culture 3D et différenciation des cellules acineuses primaires aux cellules canalaires offre de nombreux avantages par rapport aux autres systèmes. Avec la technique ci-après, modulation de l’expression de la protéine est simple et rapide, nécessitant un seul jour d’isoler, stimuler ou virale infecter et commencer la mise en culture des cellules acineuses primaires afin d’étudier le processus d’ADM. Contrairement à l’utilisation de la matrice de la membrane basale, l’ensemencement des amas de cellules acineuses en collagène I matrice extracellulaire, permet aux cellules acineuses de conserver leur identité acineuse avant toute manipulation. C’est très important lors de l’essai de la contribution des diverses composantes de l’induction de l’ADM. Non seulement les effets des cytokines ou d’autres facteurs de façon ectopique administrées testables grâce à cette technique, mais la contribution de la commune des mutations, expression de la protéine accrue ou précipitation d’expression de la protéine est testable par infection virale du cellules acineuses primaires, à l’aide des vecteurs adénovirus ou des gènes. En outre, les cellules peuvent être ré-isolés du collagène ou de la matrice de la membrane basale au point de terminaison et analysés pour l’expression de la protéine.
Introduction
Métaplasie acineux-à-canalaire (SMA) est un mécanisme de protection au cours de la pancréatite et un processus clé de développement de cancer du pancréas1 qui nécessite une vision mécaniste complémentaire au volant. Alors que l’inflammation induite par la SMA est réversible2, oncogène KRAS mutations, qui sont présentes dans 90 % des cas de cancer du pancréas3, empêchent la différenciation vers un phénotype acineuses4,,5, 6. Culturing et la différenciation des cellules acineuses primaires dans des cellules canalaires en culture 3D permet d’étudier les mécanismes moléculaires régissant le processus d’ADM, qui est difficile à étudier in vivo. Ces ex vivo études permettent la visualisation en temps réel du SMA, ses pilotes et ses régulateurs. Plusieurs pilotes de processus de SMA, et le mécaniste insight sur leurs voies de signalisation en aval, ont été identifiés ou vérifiées à l’aide de l’ici décrit la méthode. Il s’agit d’induction de SMA par TGF-α (alpha de facteur de croissance transformant)-médiée par l’expression de MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) et l’activation de l’encoche7, ainsi que RANTES (réglée sur activation, cellule normale de T exprimée et sécrétée ; également connu chemokine ligand 5 ou CCL5) et TNFα (facteur de nécrose tumorale alpha)-induite par ADM grâce à l’activation de NF-κB (nuclear factor-κB)8. Un médiateur supplémentaire du SMA est oncogène KRas9,10, ce qui provoque une augmentation de stress oxydatif qui améliore le processus de SMA par augmentation de l’expression de l’EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique) et ses ligands, EGF ( facteur de croissance épidermique) et TGF-α11.
Alors que l’utilisation de lignées cellulaires de cancer du pancréas est commune pour des études in vitro, cultures de cellules primaires offrent de nombreux avantages. Par exemple, les cellules acineuses primaires de souris non-transgéniques ou souris associées à des mutations initiatrice, commeG12Dde Kras, sont le modèle le plus approprié pour l’étude de l’événement début du SMA parce que les cellules présentent des mutations rares et contrôlées, qui sont connus pour être présents au début du développement d’un cancer du pancréas. Il s’agit en revanche de nombreuses lignées cellulaires de cancer du pancréas qui présentent des mutations multiples et variées d’expression selon le passage numéro12. En outre, les voies de signalisation identifiés par de tels moyens ont été vérifiées par les études chez l’animal. Une mise en garde de l’utilisation des cellules acineuses primaires, c’est qu’ils ne peuvent pas transfecter possible de lignées cellulaires cancéreuses typique.
La méthode ci-après détaille les techniques d’isolement de cellules acineuses, culture 3D qui imite le SMA en ajoutant des stimulants ou en modulant l’expression de la protéine par infection adénovirale ou des gènes, ainsi que re-isolement de cellules au point de terminaison pour approfondir les analyses.
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Protocol
Tous les travaux d’animaux a été approuvé par la Mayo Clinic IACUC.
1. préparation des matières, Solutions et Bases de matrice 3D
- Couper 500 µm et 105 µm en polypropylène maillages en 76 mm par carrés de 76 mm. Plier chaque carré en deux deux fois pour créer un plus petit carré plié. Place un 500 µm et le µm un 105 maillage carré dans une pochette autoclavable.
- Le filet en polypropylène autoclave places, ainsi que deux paires de ciseaux et pinces.
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Faire 100 mL 10 x solution de Waymouth. Incorporez 1 flacon (14 g) de poudre de Waymouth de 50 mL d’eau désionisée de (DI) et, lors de la dissolution, ajouter 30 mL de bicarbonate de sodium 7,5 % (75 g/L). Amener le volume final de 100 mL à l’aide de DI l’eau et filtre à stériliser.
- Médias de magasin 10 x Waymouth à 4 ° C et permet de préparer des gels collagène et 1 x Waymouth. Lorsque précipite forme, jeter.
- Faire 50 mL de 1 x support complet de Waymouth par pancréas en ajoutant 125 µL d’inhibiteur trypsique du soja 40 mg/mL, 12,5 µL de dexaméthasone 4 mg/mL et 500 µL de sérum fœtal (SVF). Stériliser par filtration et utiliser moins de 48 h.
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Préparer les bases de matrice 3 dimensions à l’aide de la matrice de collagène ou membrane basale (voir Table des matières pour des informations produit). Lors du pipetage à la base, placer la plaque sur la glace, d’éviter les bulles et faire pivoter la plaque immédiatement après chaque pipetage volume de chaque puits afin d’assurer une couverture complète.
- Créer des bases de collagène en mélangeant les éléments suivants sur la glace dans une hotte de vitroplants : 5,5 mL de type j’ai rat tail collagène, 550 µL de 10 x Media de Waymouth et 366.6 µL de 0,34 M de NaOH (filtré).
Remarque : Il s’agit de suffisamment de solution pour rendre les bases de collagène pour une plaque 24 puits, puits de 12 ou 6 puits. Une plaque est suffisamment isolant acineuses du un pancréas. - Utiliser les volumes suivants de la base de collagène sur plaque : 80 µL (lame de verre de 8 puits), 200 µL (plaque 24 puits), 400 µL (plaque de 12 puits) ou 800 µL (plaque 6 puits).
- Pour la membrane basale des bases de matrice, pipette la matrice sans tous les composants supplémentaires. Utiliser les volumes suivants pour chaque puits : 50 µL (lame de verre de 8 puits), 120 µL (plaque 24 puits), 240 µL (plaque de 12 puits) ou 600 µL (plaque 6 puits).
- Laissez les bases solidifier pendant au moins 30 minutes dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2) avant de créer une deuxième couche de matrice avec cellules embarqués sur le dessus de ces bases (étape 4).
- Créer des bases de collagène en mélangeant les éléments suivants sur la glace dans une hotte de vitroplants : 5,5 mL de type j’ai rat tail collagène, 550 µL de 10 x Media de Waymouth et 366.6 µL de 0,34 M de NaOH (filtré).
- En préparation pour l’isolement acineuse garder trois tubes de 50 mL, un bécher de 600 mL, un autoclavés paire de ciseaux, un autoclave paire de pinces et un seau de glace sous le capot avec trois bateaux de pesée. Ensuite, faire 30 mL de HBSS avec 300 µL de 100 x la pénicilline-streptomycine, mettre 10 mL dans chacun des deux bateaux de peser et de garder les derniers 10 mL dans un tube de 50 mL (pour une utilisation dans les étapes 1.8.2 et 2.1.4).
- Faire 40 mL de HBSS + 5 % FBS, 20 mL de HBSS + 30 % FBS et 5 mL de collagénase de 2 mg/mL dans HBSS. Stériliser la collagénase par filtration (0,22 µm pore) et conserver à température ambiante. Chacune des solutions HBSS sur glace garder.
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Monter un espace de travail pour la dissection du pancréas, qui peut être faite sur un banc de laboratoire.
- Place un tampon absorbant sur la table, avec un couvercle en polystyrène recouverte en papillote. Puis placer une serviette en papier avec 4 broches sur le dessus de la feuille.
- Gardez les éléments suivants à portée de l’espace de travail de dissection : un sac d’incinération, un jeu de ciseaux stérilisés à l’autoclave et forceps, un vaporisateur avec l’éthanol à 70 % et un seau à glace (avec le tube de 50 mL de HBSS contenant de la pénicilline-streptomycine étape 1.6).
- La valeur d’une centrifugeuse à 4 ° C et un agitateur à 37 ° C.
2. acineuses cellulaire Isolation
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Sacrifier la souris via CO2 induction et effectuer la dislocation cervicale. Immédiatement disséquer le pancréas. Pour disséquer le pancréas, la première épingle les pattes de la souris sur le couvercle en polystyrène, orienter la souris tels que la queue soit tourné vers le chercheur et l’abdomen de pulvérisation avec l’éthanol à 70 %.
Remarque : la souris utilisée dans les résultats représentatifs était une femelle âgée de 12 semaine non transgénique avec fond de C57BL/6. Sélection de la souris est plus en détail à la section « discussion ».- À l’aide d’un ensemble de ciseaux stérilisés à l’autoclave et forceps, soulevez la fourrure/peau à l’aide de la pince sur la ligne médiane et utiliser les ciseaux pour faire une incision à travers la fourrure et la peau contre le méat urétral à la zone de diaphragme/cage thoracique.
- Faire des incisions supplémentaires à gauche et à droite, telle que la fourrure/peau est coupée pour créer une vision claire de la cavité abdominale. Ensuite, découper le revêtement péritonéal (vers le bas au milieu et à droite et à gauche) et l’éloigner des organes, comme l’a fait avec la fourrure/peau.
- Soulevez les intestins à l’aide de la pince et mettez-le sur le côté gauche de la souris, création d’espace pour visualiser le pancréas, qui est lumière rose en couleur et attaché à la rate, qui est un ovale rouge foncé. Le tissu pancréatique se distingue par sa texture douce et spongieuse. Découper le pancréas qui se déroulera le long de l’estomac et s’entrelacent avec les intestins.
- Séparer la rate pancréas. Ensuite, mettre le pancréas dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de HBSS avec 1 x pénicilline-streptomycine et parvenir à la hotte à flux laminaire.
Remarque : Les étapes restantes du protocole doivent être effectués en utilisant une technique stérile dans une hotte à flux laminaire.
- Versez le pancréas et HBSS (avec la pénicilline-streptomycine) dans un vide bateau de peser, avec une pincette, laver le pancréas en agitant il. Puis, déplacez le pancréas avec la pince à une seconde peser barque contenant HBSS (avec la pénicilline-streptomycine). Encore une fois, laver le pancréas en agitant.
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Déplacer le pancréas à la troisième HBSS (avec la pénicilline-streptomycine)-contenant la pesée en bateau et commencer le pancréas de coupe en petits morceaux de 5 mm ou moins. Ensuite, versez les morceaux de pancréas et HBSS dans un tube à vide de 50 mL.
- Pour ce faire, utilisez la pince pour déplacer les morceaux de pancréas dans le liquide, comme le bateau de pesée est en pointe. Versez une fois tous les morceaux ne sont plus attachées au bateau de pesée. Ramasser tous les morceaux restant avec la pince et laver la pince dans le tube de 50 mL contenant le pancréas HBSS avec la pénicilline-streptomycine.
- Centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 ° C et ensuite Enlevez le HBSS (et tout le gras qui flottent) en pipettant également, il éteint avec une pipette de 5 mL.
- Ajouter 5 mL de collagénase (diluée dans HBSS dans étape 1.7) dans le pancréas. Assurer un couvercle scellé en enveloppant le tube de 50 mL en film plastique paraffine et puis placez-le dans un incubateur à agitation à 220 tr/min pendant 20 min à 37 ° C.
Remarque : Le temps de digestion de collagénase peut varier, comme mentionné dans la discussion. À la fin de l’incubation, devrait rester sans gros morceaux de tissu. - Pour arrêter la dissociation, placer le tube contenant du pancréas sur glace et ajouter 5 mL de froid HBSS + 5 % FBS. Centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 ° C, puis la pipette hors le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL.
- Resuspendre dans 10 mL de HBSS + 5 % FBS et centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 ° C. Pipette off le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL et répétez cette étape avec un autre 10 mL de HBSS + 5 % FBS.
- Remettre en suspension dans 5 mL de HBSS + 5 % FBS et, en utilisant un P1000, transférer 1 mL à la fois au travers d’une maille de 500 µm dans un tube de 50 mL. Ajouter 5 mL d’HBSS + 5 % supplémentaire FBS à travers les mailles avec un P1000 pour laver toutes les cellules du pancréas restants à travers les mailles.
- Mettre la suspension cellulaire de la maille de 500 µm à travers les mailles de 105 µm par pipetage 1 mL à la fois à l’aide d’un P1000. Ensuite, doucement pipette la suspension de cellules dans un tube contenant HBSS + 30 % FBS. Une couche de suspension de cellules se forme sur le dessus ; après centrifugation, les cellules acineuses descendra pour former une boulette.
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Centrifuger à 233 x g pendant 2 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 1 x support complet de Waymouth.
- Si procéder directement à un enfoncement de cellules de collagène ou de matrice de la membrane basale, remettre en suspension dans un volume de 7 mL par le pancréas. Si procéder à infection adénovirale ou des gènes, resuspendre dans 4 mL par le pancréas.
3. virose
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Puisqu’un pancréas est suffisante pour deux infections virales (contrôle et expérimental, par exemple, la valeur null et la cre), diviser la suspension cellulaire entre les couvercles des deux plaques de 35 mm. En utilisant le couvercle des plaques permet une infection en suspension et donc faciliter le mouvement sur le substrat définitif plus tard.
- Lorsque vous travaillez avec virus, tremper tous les bouts de pipette usagés 10 % eau de Javel pendant au moins 15 minutes.
Remarque : Utilisation des plaques 35 mm et le volume de 4 mL convient parfaitement pour les cellules de souris non-transgéniques entre 8 et 16 semaines. La taille de la plaque et le volume peuvent devoir être ajustée pour animaux avec pancréas inférieure ou supérieure.
- Lorsque vous travaillez avec virus, tremper tous les bouts de pipette usagés 10 % eau de Javel pendant au moins 15 minutes.
- Pour infection adénovirale, ajouter le virus (avec un titre d’au moins 107 TU/mL) à une dilution de 1 : 1 000 sur le couvercle de chaque plaque et agiter (Figure 2, adénovirus GFP). Placer les plaques dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2) et agiter toutes les 15 minutes pendant 1 h d’incubation Continue pendant 2 h supplémentaires et passer ensuite à un enfoncement de cellules dans la matrice de collagène ou de la membrane basale.
- Après l’exécution des travaux virale dans la hotte, tremper tous les composants dans la hotte avec 10 % eau de Javel pendant au moins 15 minutes et ensuite bien nettoyer l’eau de Javel à l’aide d’éthanol à 70 %.
4. un enfoncement de cellules de collagène ou de matrice de la Membrane basale
- Gel de collagène de faire sur la glace en combinant 7 mL de type I collagène de queue de rat (3,3 mg/mL) et 700 µL de 10 x support de Waymouth 466,6 µL de 0,34 M de NaOH.
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Prendre des quantités égales de suspension gel et cellules de collagène, mélanger doucement. Si vous ajoutez un stimulus ou un inhibiteur, combinez cela avec la suspension de collagène-cellule. Un puits de la plaque à la fois (plaques de l’étape 1.5.3) ; garder la plaque sur la glace, agiter pour répartir uniformément la couche de collagène-cellule.
- Dans chaque puits, ajouter le texte suivant volume de suspension cellulaire-collagène : 200 µL (lame de verre de 8 puits), 500 µL (plaque 24 puits), 1000 µL (plaque de 12 puits) ou 2000 µL (plaque 6 puits). Notez que ADM est induite par la stimulation avec le TGF-α (50 ng/mL) à la Figure 2.
- Pour un enfoncement des cellules dans la matrice de la membrane basale, mélanger la matrice de membrane de sous-sol d’une partie avec deux parties suspension cellulaire. Comme avec le collagène, maintenir la suspension de la cellule de la matrice ainsi que la plaque sur la glace. Ajouter un bien à la fois avec les mêmes volumes a noté en 4.2.1 et tourbillon pour une répartition uniforme.
- Placer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2) pendant 30 min pour solidifier puis ajoutez 1 x support complet de Waymouth avec n’importe quel stimulus ou inhibiteur (Figure 2 utilisations TGF-α à 50 ng/mL). Modifier les médias (avec stimulation ou inhibiteur) le lendemain et puis tous les deux jours. Selon le stimulus, ADM peut être observée entre J3 et J5.
5. récolte des cellules de collagène ou de la matrice de la Membrane basale
- Collecter les matériaux suivants nécessaires pour la récolte des cellules de collagène : 30 mL de collagénase de 1 mg/mL dilué dans HBSS, 40 mL de HBSS froid, 31 mL de PBS froid, deux spatules, deux tubes de 50 mL et glace. Ajuster le nombre de spatules, de tubes et de quantité de solutions si en comparant les conditions de culture plus de deux (où chaque condition est ½ d’une plaque). La valeur de la centrifugeuse à 4 ° C et régler l’agitateur incubateur à 37 ° C.
- Retirez le support et utiliser des spatules pour retirer les disques de collagène avec cellules incorporés. Pour chaque condition, mettre les disques dans un séparé, vider le tube de 50 mL.
- Ajouter 10 mL de collagénase de 1 mg/mL dans HBSS dans chaque tube de 50 mL. Envelopper les tubes avec film plastique paraffine et mettre dans un 37 ° C, agitation incubateur à 225 t/mn jusqu'à 45 minutes. Surveiller la digestion et retirer les tubes quand il n’y a pas plus visible collagène.
- Centrifuger à 233 g à 4 ° C pendant 2 min avec une décélération minimale. Décoller le surnageant et remettre en suspension dans la solution de collagènase de 5 mL par tube. Digérer dans un 37 ° C, agitation incubateur à 225 tr/min pendant 10 min ou jusqu'à ce qu’il n’y a aucun collagène visible.
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Arrêter la digestion en ajoutant 5 mL de HBSS froid et par la suite centrifugation à 233 x g pendant 2 min à 4 ° C, avec une décélération minimale.
- Resuspendre dans 15 mL de HBSS froid et centrifuger à nouveau à 233 x g pendant 2 min à 4 ° C, avec une décélération minimale. Répéter les étapes.
- Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS et passer au tube de 1,5 mL. Centrifuger dans un seau de swing à 233 x g pendant 2 min à 4 ° C, avec une décélération minimale. Retirez le surnageant et clin d’oeil-congélation dans l’azote liquide ou sur la glace sèche.
Remarque : Le culot cellulaire peut être conservé à-70 ° C ou utilisé immédiatement dans les applications en aval. - Pour récolter la membrane basale incorporé matrice cellules, médias de pipette de chaque puits dans un tube de 50 mL sur la glace. Ensuite, ajouter la solution de récupération de matrice membrane basale dans chaque puits et racler le mélange cellulaire-gel dans le tube de 50 mL.
Remarque : Le volume de solution de récupération de matrice de membrane basale d’ajouter à chaque puits est comme suit : 150 µL (lame de verre de 8 puits), 420 µL (plaque 24 puits), 845 µL (plaque de 12 puits) et 2 000 µL (plaque 6 puits). - Rincez bien deux fois avec la solution de récupération de matrice membrane basale, ajoutant des rinçages au tube de 50 mL.
Remarque : Le volume de solution de récupération de matrice de membrane basale pour chaque rinçage est comme suit : 150 µL (lame de verre de 8 puits), 420 µL (plaque 24 puits), 845 µL (plaque de 12 puits) et 2 000 µL (plaque 6 puits). - Maintenir le tube sur la glace pendant 1 h ou jusqu'à ce que la matrice de la membrane basale se dissout et suivre avec centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de PBS froid (peut transférer à tube 1,5 mL si le culot cellulaire est souhaitée).
- Centrifuger à 3 500 x g pendant 3 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et soit snap geler le culot cellulaire ou ajouter le tampon de lyse et procéder directement aux applications en aval.
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Representative Results
Achèvement du protocole ci-après se produit dans la journée et lors de la stimulation, ADM se voit dans 3-5 jours. La figure 1 illustre la séquence de la méthode, auquel cas les étapes 1 à 4 sont terminés le premier jour. Cela comprend la préparation, isolation acineuse, infection virale et un enfoncement dans collagène ou de la matrice de la membrane basale. Tandis que la matrice de la membrane basale induit des ADM, les cellules acineuses dans collagène j’ai besoin d’un stimulus, tels que TGF-α, de subir la différenciation de cellules canalaires. Jour 1, dans la matrice de collagène ou de la membrane basale, les cellules ont une apparence ronde de raisin et si utilisant infection virale avec un vecteur exprimant une protéine fluorescente, efficacité de l’infection peut être vérifiée. Au jour 5, cellules de collagène forme conduits si donné une impulsion au moment d’encastrement et en complément dans les médias, ce qui sont changés aux jours 1, 3 et 5. Incorporée dans la matrice de la membrane basale des cellules formeront des conduits en l’absence d’un stimulus, mais lors de la stimulation formeront des conduits plus grands, comme on le voit à la Figure 2.
Figure 1 : Schéma de la procédure pour isoler les cellules acineuses primaires murines, modulent l’expression des protéines et/ou stimuler la métaplasie acineux-à-canalaire et incorporer des cellules dans la matrice de collagène ou de la membrane basale. Le workflow comporte d’isolement des cellules acineuses, qui comprend la dissection du pancréas, la digestion et filtration des cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats représentatifs des principales cellules acineuses plaqués au sein de la matrice de collagène ou membrane basale après stimulation avec TGF-α et infection adénovirale. Cellules acineuses primaires d’une souris non-transgéniques ont été infectés avec GFP-adénovirus, incorporé dans le collagène I ou matrice de la membrane basale et stimulée avec ou sans TGF-α (50 ng/mL). Vingt-quatre heures après l’infection par l’adénovirus de la GFP, les images ont été capturés pour montrer l’efficacité de l’infection. À cinq jours après l’infection, les images indiquent les différences dans les cellules stimulées avec ou sans TGF-α, de collagène ou de la matrice de la membrane basale. Structures ressemblant à des conduits sont indiquées par des flèches blanches et échelle représentent barres que 50 µm. les Images ont été obtenues à l’aide d’un microscope confocal avec l’objectif de ce Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La durée relativement courte pour isolement, infection et des cellules acineuses primaires de placage est un avantage de cette méthode. En revanche, cultivant des cellules acineuses d’une excroissance de l’explant nécessite peu de temps pratique, mais il faut sept jours pour l’excroissance des cellules acineuses13. Un protocole alternatif pour isolement acineuses14 note une méthode très courte pour obtenir des cellules acineuses ; Cependant, EGF est une composante essentielle de garder les cellules acineuses vivant en se limitant à l’aide de ce protocole. Puisqu’EGF stimule la différenciation des cellules acineuses de canal artériel, la méthode ci-après, qui ne nécessite pas de composants stimulant l’ADM pour la culture, est préférable pour l’étude des mécanismes d’induction ou de la régulation des ADM. Dans cette méthode, identité des cellules acineuses est maintenue au cours de la mise en culture en collagène à moins stimulé pour se différencier en cellules canalaires. En outre, les difficultés en transfectant les cellules primaires sont surmontées par manipulation d’expression de la protéine par une infection virale.
Cette procédure vous propose une étude directe du SMA, par lequel visualisation de structure canalaire induction peut se produire par l’intermédiaire de la microscopie fond clair ou immunofluorescence. Pour les applications de l’imagerie, diapositives de chambre (indiqués dans la Table des matières) sont les meilleurs. Fixation pour 15 min à 37 ° C, avec 4 % de paraformaldéhyde fixera cellules enfoui dans la matrice de membrane basale sans structures canalaires inquiétantes. Durant cette incubation, la matrice de la membrane basale se liquéfier et peut être délicatement éjectant hors avec le paraformaldéhyde. Immunofluorescence sur cellules de collagène incorporé est décrite en détail dans les protocoles additionnels15,16. Nouvelles demandes d’analyses des mécanismes de signalisation impliquées au point de terminaison de l’expérience incluent la tache occidentale qPCR et cellule activée par fluorescence triant (FACS). Un sixième d’un pancréas est suffisamment de matière pour l’analyse d’un échantillon par Western blot ou qPCR.
Limites du présent protocole découlent de l’utilisation de la matrice de collagène ou de la membrane basale, où chacun a leurs avantages et leurs inconvénients. Tandis qu’un enfoncement de cellules de collagène produira seulement conduits si les stimuli sont donnés, un enfoncement membrane basale matrice produira conduits sans stimuli additionnels. Cependant, taille canalaire dans la matrice de la membrane basale est une sortie mesurable. Une autre limite est le temps impliqué dans les procédures de récolte à l’étape 5, qui pourrait affecter l’expression des gènes. Cette limitation peut être atténuée en confirmant les résultats obtenus par Western Blot avec l’immunofluorescence, dans laquelle le temps de fixation est nettement inférieur à celui de l’époque de récolte pour qPCR ou analyse par Western blot.
En plus de l’infection adénovirale, infection des gènes peut être utilisée dans les cellules primaires. Pour l’infection des gènes, ajouter 6 µg/mL de réactif de renforceur infection virale (voir table des matières) aux cellules et doucement agiter les plaques. Ajouter par la suite, le lentivirus (avec un titre d’au moins 107 TU/mL) à une dilution de 1 : 1 000 et encore une fois, agiter doucement. Incuber pendant 3-5 h (37 ° C, 5 % de CO2), puis continuer à un enfoncement de cellules dans la matrice de collagène ou de la membrane basale. Pour générer des lentivirus avec un plasmide d’intérêt, utilisez le mélange des gènes emballage il est indiqué dans le tableau des matériaux.
Autre modification peut inclure l’isolement des cellules de souris exprimant KrasG12D. Chez ces souris, qui ont déjà des zones fibreuses avec lésions SMA et Panine, digestion de collagénase prend plus de temps. Prudent de surveillance de la digestion de collagénase, tel que décrit dans les étapes critiques et de dépannage, est nécessaire. Le tissu anormal plus une souris a, de plus la digestion aura (environ une heure pour un p48Cre de de douze semaines ; LSL-KrasG12D souris). Car il peut y avoir d’écart immense entre souris du même âge, nous conseillons d’isoler les cellules acineuses d’une souris LSL -KrasG12D et effectuer une infection adénovirale ou des gènes utilisant cre pour obtenir oncogène KRas expression. Il devrait également noter que notre protocole est optimisée pour l’isolement de cellules acineuses pour enquêter sur le processus d’ADM. L’isolement des cellules de SMA et Panine de KrasG12D-exprimant la souris pour la culture organoïde exige modifié des protocoles.
Une étape critique est la quantité de temps que le pancréas haché passe à collagénase. Le temps de digestion de collagénase idéal peut varier de souris à la souris et entre les lots de collagénase de la même entreprise. Le temps indiqué dans le protocole est approprié pour pancréas pesant environ 0,250 g. trop longtemps peut endommager et tuer les cellules, tandis que trop peu de temps se traduira par une digestion incomplète et par conséquent moins de cellules qui le fera à travers le processus de filtrage sur le plaque finale. Vérifier la dissociation visuellement par la recherche de panne des morceaux hachés-up pancréas ; la solution devrait tourner nuageuse. En outre, avant d’arrêter la réaction de collagénase avec HBSS froid, la solution peut être absorbée avec une pipette de 5 mL, où la facilité avec laquelle la solution peut être absorbée indique il s'convient d’arrêter la réaction. Une autre considération est le nombre de pancréas récoltés. Si plus d’un pancréas est isolé en même temps, la procédure fonctionne mieux lorsque le pancréas sont séparées.
Un autre point important pour assurer une culture saine des cellules acineuses primaires, c’est qu’il faut lors du pipetage la solution de cellules acineuses. Pipetage vigoureux peut causer des dommages aux cellules et entraîner un manque de formation de la gaine, même avec l’ajout des inducteurs de SMA connus, tels que TGF-α. En outre, s’il y a des problèmes de viabilité, la centrifugation en étapes 2.4, 2.6 et 2.7 peut être prise à 300 x g pour produire une boulette de plus douce.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de R01 (CA200572) du NIH au PS Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut National du Cancer ou les instituts nationaux de Health.The bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans étudier la conception, la collecte de données et l’analyse, décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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