Summary
Primäre acinar Zelle isoliert, Protein-Expression oder Aktivität-Modulation, Kultur und Downstream-Anwendungen eignen sich reichlich in der Ex Vivo Studie des acinar-duktale Metaplasie (ADM), einem frühen Ereignis in der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs.
Abstract
Die Differenzierung der acinar Zellen duktale Zellen bei Pankreatitis und in der frühen Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist ein Schlüsselprozess, die weitere Untersuchung erfordert. Um die Mechanismen zu verstehen bietet regulierende acinar-duktale Metaplasie (ADM), ex-Vivo-3D-Kultur und Differenzierung der primären acinar Zellen zu Duktuszellen viele Vorteile gegenüber anderen Systemen. Mit der Technik hierin ist die Modulation der Proteinexpression einfach und schnell, erfordert nur einen Tag zu isolieren, zu stimulieren oder Viral infizieren und Kultivierung der primäre acinar Zellen untersuchen die ADM-Prozess zu beginnen. Im Gegensatz zu mit Basalmembran Matrix, die Aussaat des acinar Zellcluster im Kollagen ich extrazellulären Matrix ermöglicht acinar Zellen behalten ihre acinar Identität vor Manipulation. Dies ist wichtig, beim Testen des Beitrags der verschiedenen Komponenten zur Induktion von ADM. Nicht nur sind die Effekte der Zytokine oder andere ectopically verabreichten Faktoren testbar durch diese Technik, sondern der Beitrag der gemeinsamen Mutationen, erhöhte Protein-Expression oder Knockdown von Protein-Expression ist überprüfbar über virale Infektion der primäre acinar Zellen, mit adenoviralen oder Lentivirale Vektoren. Darüber hinaus können Zellen von Kollagen oder Basalmembran Matrix am Endpunkt wieder isoliert und analysiert werden für Protein-Expression.
Introduction
Acinar-duktale Metaplasie (ADM) ist ein Schutzmechanismus bei Pankreatitis und ein Schlüsselprozess fahren Bauchspeicheldrüsenkrebs Entwicklung1 , das weitere mechanistische Einblicke erfordert. Während Entzündung induziert ADM reversibel2, Onkogene KRAS -Mutationen, die in 90 % der Bauchspeicheldrüsenkrebs Fällen3vorhanden sind, zu verhindern, dass Differenzierung zurück zu einer acinar Phänotyp4,5, 6. Culturing und Differenzierung der primäre acinar Zellen in duktale Zellen in 3D Culture ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Regulierung des ADM-Prozess, der schwierig ist, in-vivo Studie. Diese ex-Vivo-Studien ermöglichen Echtzeit-Visualisierung von ADM, seine Fahrer und ihre Aufsichtsbehörden. Mehrere Fahrer der ADM-Prozess sowie die mechanistische Einblicke auf ihre nachgeschaltete Signalwege identifiziert wurden oder verifiziert mit der hier beschriebenen Methode. Dazu gehören ADM Induktion durch TGF-α (transformierende Wachstumsfaktor Alpha)-vermittelten Expression von MMP-7 (Matrix Metalloproteinase-7) und Aktivierung des Notch-7sowie RANTES (reguliert auf Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert; auch bekannt als Chemokin Liganden 5 oder CCL5) und TNF (Tumor-Nekrose-Faktor Alpha)-induzierte ADM durch Aktivierung von NF-κB (nuclear Factor-κB)8. Ein zusätzliche Vermittler der ADM ist Onkogene KRas9,10, die einen Anstieg der oxidativen Stress verursacht, das erhöht den ADM-Prozess durch erhöhte Expression von EGFR (Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) und seinen Liganden, EGF ( epidermalen Wachstumsfaktor) und TGF-α-11.
Während der Nutzung der pankreatischen Krebszelllinien für in-vitro-Studien üblich, bieten primären Zellkulturen viele Vorteile. Zum Beispiel sind primäre acinar Zellen von nicht-transgenen Mäusen oder Mäuse beherbergen initiierende Mutationen, wie KrasG12D, das am besten geeignete Modell für das Studium der frühen Veranstaltung von ADM, weil die Zellen verfügen über nur wenige und kontrollierte Mutationen, die sind dafür bekannt, bereits während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs vorhanden sein. Dies steht im Gegensatz zu vielen pankreatischer Krebs-Zelllinien, die mehrere Mutationen haben und abwechslungsreich Ausdruck basiert auf Durchgang Nummer12. Darüber hinaus wurden die Signalwege identifiziert mit solchen Mitteln von tierexperimentellen Studien überprüft. Eine Einschränkung der Verwendung von primärer acinar Zellen ist, dass sie wie typische Krebszelllinien transfiziert werden können nicht.
Die Methode hierin beschreibt die Techniken der acinar Zelle isoliert, 3D Culture, die ADM imitiert, indem Stimulanzien oder Modulation der Proteinexpression durch adenoviralen oder Lentivirale Infektion sowie erneute Isolation von Zellen am Endpunkt für weitere Analysen.
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Protocol
Alle tierische Arbeit wurde von der Mayo Klinik IACUC genehmigt.
1. Vorbereitung des 3-dimensionalen Matrix Grundlagen, Materialien und Lösungen
- Schneiden Sie 500 µm und 105 µm Polypropylen Netze in 76 mm 76 mm Quadrate. Falten Sie jedes Quadrat in der Mitte zweimal erstelle ich ein kleiner gefalteten Quadrat. Platz 1 500 µm und eine 105 µm mesh Platz in einem Beutel autoklavierbar.
- Autoklaven Polypropylen mesh-Plätze sowie zwei Paare von Scheren und Pinzetten.
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100 mL 10 x Waymouth Lösung zu machen. Rühren Sie 1 Durchstechflasche (14 g) Waymouth Pulver in 50 mL entionisiertem Wasser (DI ein) und, als sich auflöste, 30 mL 7,5 % (75 g/L) Natriumbicarbonat. Bringen Sie das Endvolumen auf 100 mL mit DI Wasser und Filter zu sterilisieren.
- Speicher 10 X Waymouth bei 4 ° C und Nutzung, Kollagen Gele vorzubereiten und 1 X Waymouth Medien. Wenn Form, Ausscheidungen zu verwerfen.
- 50 mL 1 x Waymouths kompletten Medien pro Bauchspeicheldrüse indem 125 µL 40 mg/mL Soja-Trypsin-Inhibitor, 12,5 µL Dexamethason 4 mg/mL und 500 µL des fetalen bovine Serum (FBS) zu machen. Sterilisieren durch Filtration und innerhalb 48 h.
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3-dimensionale Matrix Basen mit Kollagen oder Basalmembran Matrix vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien für Produktinformationen). Wenn die Basis pipettieren, platzieren Sie die Platte auf dem Eis, vermeiden Sie Luftblasen und drehen Sie die Platte sofort nach dem Pipettieren des Brunnens Volumen um volle Deckung zu gewährleisten.
- Kollagen-Grundlagen zu schaffen, durch Mischen der folgenden Komponenten auf dem Eis in einer Gewebekultur Kapuze: 5,5 mL Typ ich Ratte tail, Kollagen, 550 µL 10 x Waymouths Medien und 366.6 µL von 0,34 M NaOH (gefiltert).
Hinweis: Dies ist genug Lösung Kollagen Grundlagen für eine 24-Brunnen, 12-Well oder 6-Well-Platte zu machen. Ein Teller ist ausreichend für acinar losgelöst von einem Pankreas. - Verwenden Sie die folgenden Bände um die Kollagen-Bodenplatte: 80 µL (8-Brunnen Objektträger), 200 µL (24-Well-Platte), 400 µL (12-Well-Platte) oder 800 µL (6-Well-Platte).
- Für die Basalmembran Basen Matrix, Pipettieren der Matrix ohne zusätzlichen Komponenten. Verwenden Sie die folgenden Bände für jede Vertiefung: 50 µL (8-Brunnen Objektträger), 120 µL (24-Well-Platte), 240 µL (12-Well-Platte) oder 600 µL (6-Well-Platte).
- Lassen Sie die Grundlagen für mindestens 30 min. in einem Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) erstarren vor dem Erstellen einer zweiten Schicht der Matrix mit eingebetteten Zellen auf diese Basen (Schritt 4).
- Kollagen-Grundlagen zu schaffen, durch Mischen der folgenden Komponenten auf dem Eis in einer Gewebekultur Kapuze: 5,5 mL Typ ich Ratte tail, Kollagen, 550 µL 10 x Waymouths Medien und 366.6 µL von 0,34 M NaOH (gefiltert).
- Halten Sie in Vorbereitung für acinar Isolation einem 600 mL-Becherglas, drei 50 mL Röhrchen, autoklaviert Pair Schere, eine autoklaviert paar Zangen und einem Eiskübel unter der Haube mit drei Boote wiegen. Nehmen Sie dann 30 mL HBSS mit 300 µL von 100 X Penicillin-Streptomycin, 10 mL in jeweils zwei Boote wiegen und halten die letzten 10 mL in der Tube 50 mL (für den Einsatz in den Schritten 1.8.2 und 2.1.4).
- Machen 40 mL HBSS + 5 % FBS, 20 mL HBSS + 30 % FBS und 5 mL 2 mg/mL Kollagenase in HBSS. Die Kollagenase durch Filtration (0,22 µm Pore) zu sterilisieren und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Halten Sie jede der HBSS Lösungen auf Eis.
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Montieren Sie einen Arbeitsbereich für Bauchspeicheldrüse Dissektion, die auf einem Labortisch durchgeführt werden kann.
- Ort eine saugfähige Unterlage auf dem Tisch, zusammen mit einem Styropor Deckel bedeckt in Folie. Dann legen Sie ein Papiertuch mit 4 Pins auf die Folie.
- Halten Sie die folgenden Elemente innerhalb der Reichweite der Dissektion Arbeitsbereich: eine Verbrennung-Tasche, einen Satz von autoklaviert Scheren und Pinzetten, eine Sprühflasche mit 70 % Ethanol und einem Eiskübel (mit den 50 mL Tube HBSS mit Penicillin-Streptomycin aus Schritt 1.6).
- Legen Sie eine Zentrifuge auf 4 ° C und einem Shaker auf 37 ° C.
(2) acinar Zelle isoliert
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Opfern Sie die Maus über CO2 Induktion zu, und führen Sie zervikale Dislokation. Sofort sezieren der Bauchspeicheldrüsenkrebs. Sezieren die Bauchspeicheldrüse, die ersten Pin die Pfoten der Maus auf das Styropor Deckel, die Maus zu orientieren, so dass das Heck den Forscher steht und sprühen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol.
Hinweis: die Maus in die repräsentativen Ergebnisse verwendet wurde ein 12 - Wochen alten nicht-transgenen Weibchen mit C57BL/6 Hintergrund. Mausauswahl ist weiter im Abschnitt Diskussion erörtert.- Mit einem Satz von autoklaviert Scheren und Pinzetten, heben Sie die Fell/Haut mit der Zange an der Mittellinie und verwenden Sie die Schere, um einen Schnitt durch das Fell und Haut von der Harnröhrenöffnung zum Bereich Zwerchfell/Brustkorb zu machen.
- Weitere Einschnitte nach links und rechts so gestalten, dass die Fell/Haut geritzt ist Weg, um eine klare Sicht im Bauchraum zu erstellen. Dann schneiden Sie in die peritoneale Auskleidung (in der Mitte und rechts und links) und ziehen Sie es weg von den Organen, wie mit dem Fell/Haut getan wurde.
- Heben Sie den Darm mit der Zange und legen Sie es auf der linken Seite der Maus schaffen Raum um die Bauchspeicheldrüse zu sehen, die Licht in der Farbe rosa, und befestigt, die Milz, die eine dunkle rote Oval ist. Die Bauchspeicheldrüse-Gewebe zeichnet sich durch seine weiche, schwammige Beschaffenheit. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse, die läuft entlang den Magen und verflechten sich mit dem Darm.
- Trennen Sie die Milz aus der Bauchspeicheldrüse. Dann legte der Bauchspeicheldrüsenkrebs in ein 50 mL-Tube mit 10 mL HBSS mit 1 X Penicillin-Streptomycin und bringen diese in die Laminar-Flow-Haube.
Hinweis: Die verbleibenden Schritte des Protokolls sollte unter Verwendung sterilen Technik in einem Laminar-Flow-Abzug erfolgen.
- Gießen Sie die Bauchspeicheldrüse und HBSS (mit Penicillin-Streptomycin) in ein leeres Boot wiegen und mit Pinzette, die Bauchspeicheldrüse durch Schütteln es waschen. Verschieben Sie dann die Bauchspeicheldrüse mit der Pinzette ein zweites Boot mit HBSS (mit Penicillin-Streptomycin) wiegen. Wieder, Waschen der Bauchspeicheldrüsenkrebs durch Umschwenken.
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Verschieben die Bauchspeicheldrüse, der dritte HBSS (mit Penicillin-Streptomycin)-Boot mit wiegen und beginnen, schneiden die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke von 5 mm oder weniger. Anschließend gießen Sie die Bauchspeicheldrüse Stücke und HBSS in eine leere 50 mL-Tube.
- Zu diesem Zweck, verwenden Sie die Zange die Bauchspeicheldrüse Stücke in die Flüssigkeit bewegen, wie das Wiegen Boot angespitzt wird. Gießen Sie einmal alle Stücke nicht mehr zum Wiegen Boot befestigt sind. Nehmen Sie Reststücke mit der Zange und waschen Sie die Zange in der 50 mL-Tube mit der Bauchspeicheldrüse in HBSS mit Penicillin-Streptomycin.
- 931 X g für 2 min bei 4 ° C zentrifugiert und dann die HBSS (und jedes Fett, das schwebt) entfernen, indem es Sie mit einer 5-mL-Pipette pipettieren.
- Die Bauchspeicheldrüse fügen Sie 5 mL Kollagenase (verdünnt in HBSS im Schritt 1,7 hinzu). Gewährleisten Sie einen abgedichteten Deckel durch Umwickeln der 50 mL Tube in Kunststoff Paraffin Film und dann legen Sie es in einem Inkubator Schütteln bei 220 u/min für 20 min bei 37 ° C.
Hinweis: Die Kollagenase Aufschlusszeit kann variieren, wie in der Diskussion erwähnt. Am Ende der Inkubationszeit sollte keine große Stücke des Gewebes bleiben. - Um die Dissoziation zu stoppen, das Pankreas-haltigen Rohr auf Eis legen und 5 mL kalte HBSS + 5 % FBS. Zentrifugieren Sie bei 931 X g für 2 min bei 4 ° C und dann Pipettieren aus der Überstand mit einer 5 mL pipettieren.
- Aufschwemmen Sie in 10 mL HBSS + 5 % FBS und Zentrifuge bei 931 X g für 2 min bei 4 ° C. Pipettieren der Überstand mit einer 5 mL Pipettieren ab und wiederholen Sie diesen Schritt mit einem anderen 10 mL HBSS + 5 % FBS.
- In 5 mL HBSS + 5 % Aufschwemmen FBS und mit einem P1000 übertragen 1 mL gleichzeitig durch ein Netz von 500 µm in einer 50 mL-Tube. Fügen Sie eine zusätzliche 5 mL HBSS + 5 % FBS durch das Gitter mit einem P1000, alle übrigen Zellen der Bauchspeicheldrüsen durch die Maschen zu waschen.
- Setzen Sie die Zellsuspension aus dem 500 µm-Netz durch das Gitter 105 µm durch Pipettieren 1 mL zu einem Zeitpunkt mit einem P1000. Weiter, sanft pipettieren die Zellsuspension in ein Rohr mit HBSS + 30 % FBS. Eine Zellsuspension wird an der Spitze bilden; bei der Zentrifugation sinkt die acinar Zellen um eine Kugel zu bilden.
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Zentrifuge bei 233 X g für 2 min bei 4 ° C. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen das Pellet in 1 x komplette Media Waymouth.
- Wenn Sie direkt zur Einbettung der Zellen in Kollagen oder Basalmembran Matrix fortfahren, in einem Volumen von 7 mL pro Bauchspeicheldrüse aufzuwirbeln. Wenn adenoviralen oder Lentivirale Infektion ausgehend, in 4 mL pro Bauchspeicheldrüse aufzuwirbeln.
(3) Virusinfektion
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Wie ein Pankreas ausreichend für zwei Virusinfektionen ist (Kontrolle und experimentell, z. B. Null und Cre), teilen die Zellsuspension zwischen den Deckeln aus zwei 35-mm-Platten. Des Deckels der Platten ermöglicht eine Infektion in Federung und daher leichte Bewegung auf das letzte Substrat später.
- Beim Arbeiten mit Virus einweichen Sie alle verwendeten Pipettenspitzen in 10 % Bleichmittel für mindestens 15 Minuten.
Hinweis: Nutzung von den 35-mm-Platten und 4 mL Volumen eignet sich gut für Zellen von nicht-transgenen Mäusen zwischen 8 und 16 Wochen alt. Die Plattengröße und das Volumen können für Tiere mit kleineren oder größeren Bauchspeicheldrüse angepasst werden müssen.
- Beim Arbeiten mit Virus einweichen Sie alle verwendeten Pipettenspitzen in 10 % Bleichmittel für mindestens 15 Minuten.
- Adenovirale Infektion das Virus hinzufügen (mit einem Titer von mindestens 107 TU/mL) bei einem 1:1,000 Verdünnung auf den Deckel der einzelnen Platte und wirbeln (Abbildung 2, GFP Adenoviren). Legen Sie die Platten in eine Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) und wirbeln alle 15 Minuten für 1 h weiter Inkubation für weitere 2 h und dann zur Einbettung der Zellen im Kollagen oder Basalmembran Matrix.
- Nach Abschluss der viralen arbeiten in der Kapuze, mindestens 15 Minuten einweichen Sie alle Komponenten in der Haube mit 10 % Bleichmittel und dann reinigen Sie das Bleichmittel mit 70 % igem Ethanol.
4. die Einbettung von Zellen in Kollagen oder Basalmembran Matrix
- Machen Kollagen Gel auf Eis durch die Kombination von 7 mL Typ-I-Ratte Schweif Kollagen (3,3 mg/mL), 700 µL 10 x Waymouths Medien und 466.6 µL von 0,34 M NaOH.
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Unter gleichen Volumina von Kollagen Gel und Zelle Federung, vorsichtig mischen. Wenn Sie eine Anregung oder Inhibitor hinzufügen, kombiniert mit der Kollagen-Zellsuspension. Platte einen Brunnen zu einem Zeitpunkt (Platten aus Schritt 1.5.3); halten Sie die Platte auf dem Eis, Wirbel um die Kollagen-Zellschicht gleichmäßig zu verteilen.
- In jede Vertiefung Pipettieren folgende Mengen an Kollagen-Zellsuspension: 200 µL (8-Brunnen Objektträger), 500 µL (24-Well-Platte), 1000 µL (12-Well-Platte) oder 2000 µL (6-Well-Platte). Beachten Sie, dass ADM über Stimulation mit TGF-α induziert wird (50 ng/mL) in Abbildung 2.
- Zur Einbettung der Zellen in der Basalmembran Matrix mischen Sie einteilige Basalmembran Matrix mit zwei Teile Zellsuspension. Wie bei Kollagen, halten Sie die Matrix-Zellsuspension sowie der Platte auf dem Eis. Pipettieren eine gut zu einem Zeitpunkt mit der gleichen Volumina in 4.2.1 und Wirbel für eine gleichmäßige Verteilung festgestellt.
- Platzieren Sie die Platte in eine Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) für 30 min, um zu festigen und fügen Sie dann 1 x Waymouths kompletten Medien mit Impuls oder Inhibitor (Abbildung 2 Verwendungen TGF-α bei 50 ng/mL). Wechseln Sie das Medium (mit Impuls oder Inhibitor), am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag. Je nach den Reiz kann zwischen 3 und Tag 5 ADM beobachtet werden.
5. Ernte Zellen Kollagen oder Basalmembran Matrix
- Sammeln Sie die folgenden Materialien, die für die Ernte der Zellen von Kollagen benötigt: 30 mL 1 mg/mL Kollagenase in HBSS, 40 mL kalte HBSS, 31 mL kaltem PBS, zwei Spachteln, zwei 50 mL Röhrchen und Eis verdünnt. Passen Sie die Anzahl der Spatel, Röhren und Menge an Lösungen, wenn mehr als zwei Kulturbedingungen vergleichen (wobei jede Bedingung ist ½ von einer Platte). Die Zentrifuge auf 4 ° C und schütteln Inkubator auf 37 ° C.
- Entfernen Sie das Medium und verwenden Sie Spatel, um die Kollagen-Datenträger mit eingebetteten Zellen zu entfernen. Für jede Bedingung, legen Sie die Scheiben in eine Separate leer 50 mL-Tube.
- Jeweils 50 mL-Tube 10 mL von 1 mg/mL Kollagenase in HBSS hinzufügen. Wickeln Sie die Rohre mit Kunststoff Paraffin Film und steckte in einem 37 ° C Inkubator bei 225 u/min für bis zu 45 Minuten schütteln. Überwachen Sie die Verdauung und entfernen Sie Rohre zu, wenn es nicht mehr sichtbar Kollagen ist.
- Zentrifugieren Sie bei 233 X g bei 4 ° C für 2 min mit minimaler Verzögerung. Der Überstand abnehmen und in 5 mL Kollagenase Lösung pro Röhre aufzuwirbeln. In einem 37 ° C schütteln Inkubator bei 225 u/min für 10 min oder bis es keine sichtbaren Kollagen gibt zu verdauen.
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Stoppen Sie die Verdauung durch Hinzufügen von 5 mL kalte HBSS und anschließend Zentrifugieren bei 233 X g für 2 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung.
- In 15 mL kalte HBSS Aufschwemmen und erneut Zentrifugieren bei 233 X g für 2 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung. Den Vorgang wiederholen.
- Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL PBS und nach 1,5 mL-Tube. Zentrifuge in einem Schwung Eimer bei 233 X g für 2 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung. Entfernen Sie überstand und Snap-Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis.
Hinweis: Die Zelle Pellet kann bei-70 ° C gelagert oder sofort im Downstream-Anwendungen verwendet werden. - Basalmembran Matrix eingebettet Zellen, Pipettieren Medien aus jedem Brunnen in ein 50 mL Röhrchen auf dem Eis zu ernten. Dann fügen Sie Basalmembran Matrix-Recovery-Lösung in jede Vertiefung und kratzen Sie die Zelle-Gel-Mischung in der 50 mL Tube.
Hinweis: Das Volumen der Basalmembran Matrix-Recovery-Lösung hinzufügen, zu jedem Brunnen ist wie folgt: 150 µL (8-Brunnen Objektträger), 420 µL (24-Well-Platte), 845 µL (12-Well-Platte) und 2.000 µL (6-Well-Platte). - Spülen Sie nun zweimal mit der Basalmembran Matrix-Recovery-Lösung, die 50 mL-Tube die Spülungen hinzufügen.
Hinweis: Das Volumen der Basalmembran Matrix-Recovery-Lösung für jede Spülung ist wie folgt: 150 µL (8-Brunnen Objektträger), 420 µL (24-Well-Platte), 845 µL (12-Well-Platte) und 2.000 µL (6-Well-Platte). - Lassen Sie das Rohr auf Eis für 1 h oder, bis die Basalmembran Matrix löst sich auf und folgen Sie mit Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° c Den Überstand zu entfernen und erneut das Pellet in 1 mL kaltem PBS (möglicherweise auf 1,5 mL-Tube übertragen, wenn Zelle Pellet gewünscht wird).
- Zentrifuge bei 3.500 X g für 3 min bei 4 ° C. Den Überstand zu entfernen und entweder Snap Einfrieren der Zelle Pellet oder Lyse Puffer und fahren Sie direkt mit downstream-Anwendungen.
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Representative Results
Fertigstellung des Protokolls hierin erfolgt innerhalb eines Tages und nach Stimulation, ADM ist in 3-5 Tagen zu sehen. Abbildung 1 zeigt den Ablauf des Verfahrens, wobei die Schritte 1 bis 4 am ersten Tag abgeschlossen sind. Dazu gehören Vorbereitung, acinar Isolation, Virusinfektion und Einbettung in Kollagen oder Basalmembran Matrix. Während die Basalmembran Matrix ADM induziert, acinar Zellen innerhalb Kollagen ich benötige einen Reiz, wie TGF-α, unterziehen Differenzierung duktale Zellen. Am 1. Tag Zellen in Kollagen oder Basalmembran Matrix haben eine Traube Runde aussehen und wenn virale Infektion mit einem Vektor mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins mit Hilfe, kann die Infektion Effizienz überprüft werden. Bis zum Tag 5 werden Zellen Kollagen Kanäle bilden, wenn eine Anregung zum Zeitpunkt der Einbettung und als Ergänzung in den Medien, die an den Tagen 1, 3 und 5 geändert werden. Zellen in Basalmembran Matrix eingebettet werden Kanäle bilden, in Ermangelung eines Reizes, sondern nach Stimulation größere Rohre bilden, wie in Abbildung 2dargestellt.
Abbildung 1 : Schaltplan des Verfahrens murine primäre acinar Zellen zu isolieren, modulieren Proteinexpression und/oder stimulieren acinar-duktale Metaplasie und Zellen in Kollagen oder Basalmembran Matrix einbetten. Der Workflow enthält Isolation von acinar Zellen die Dissektion der Bauchspeicheldrüse, Verdauung und Filtration von Zellen enthält. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse der primären acinar Zellen überzogen in Kollagen oder Basalmembran Matrix nach adenovirale Infektion und Stimulation mit TGF-α. Primäre acinar Zellen von einer nicht-transgenen Maus mit GFP-Adenovirus infiziert waren, eingebettet in Kollagen I oder Basalmembran Matrix und angeregt, mit oder ohne TGF-α (50 ng/mL). Vierundzwanzig Stunden nach der Infektion mit GFP Adenoviren, die Bilder wurden aufgenommen, um Infektion Effizienz zeigen. Bei fünf Tage nach der Infektion bezeichnen die Bilder die Unterschiede in den Zellen angeregt, mit oder ohne TGF-α in Kollagen oder Basalmembran Matrix. Rohr-ähnliche Strukturen sind gekennzeichnet durch weiße Pfeilspitzen und Bars stellen 50 µm. Bilder erhalten wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit dem Ziel, EC Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27 zu skalieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die relativ kurze Zeitspanne für Isolation, Infektion und Plattieren primäre acinar Zellen ist ein Vorteil dieser Methode. Im Gegensatz dazu Kultivierung acinar Zellen aus einem modellabhängigen Auswuchs erfordert wenig Arbeitsaufwand beträgt, aber es dauert sieben Tage für Auswuchs von acinar Zellen13. Ein alternatives Protokoll für acinar Isolierung14 weist eine sehr kurze Methode zur Erlangung acinar Zellen; EGF ist jedoch ein wesentlicher Bestandteil in lebendig acinar Zellen, wenn Sie isoliert unter Verwendung dieses Protokolls. Da EGF Differenzierung von acinar Zellen duktale Zellen anregt, ist die Methode, die keine ADM-stimulierenden Komponenten für Kultur erforderlich ist, besser für die Untersuchung der Mechanismen der Induktion oder Regulierung von ADM. Bei dieser Methode wird acinar Zelle Identität beibehalten, während der Kultivierung in Kollagen, wenn angeregt, sich in duktale Zellen differenzieren. Darüber hinaus sind in transfecting Primärzellen Schwierigkeiten über Manipulation Proteinexpression durch Virusinfektion.
Dieses Verfahren bietet direkte Untersuchung von ADM, durch welche Visualisierung des duktalen Struktur Induktion über Hellfeld und/oder Immunfluoreszenz-Mikroskopie auftreten kann. Für imaging-Anwendungen, sind die Kammer-Folien (angegeben in der Table of Materials) am besten. Fixierung für 15 min bei 37 ° C mit 4 % Paraformaldehyd behebt Zellen in Basalmembran Matrix ohne störende duktale Strukturen eingebettet. Während diese Inkubation die Basalmembran Matrix wird verflüssigen und kann sanft aus mit der Paraformaldehyd pipettiert werden. Immunfluoreszenz auf Zellen Kollagen eingebettet ist in Zusatzprotokolle15,16detailliert beschrieben. Weitere Anwendungen für Analysen der beteiligten Signalisierung Mechanismen am Endpunkt des Experiments sind Western-Blot, qPCR und Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS). Ein Sechstel der Pankreas ist ausreichend Material für eine Probe-Analyse mittels Western-Blot oder qPCR.
Einschränkungen dieses Protokolls ergeben sich aus der Verwendung von Kollagen oder Basalmembran Matrix, wo jede ihre vor- und Nachteile hat. Während Einbettung der Zellen im Kollagen nur Kanäle produziert wird, wenn Reize gegeben sind, produzieren Basalmembran Matrix Einbettung Kanälen ohne zusätzliche Reize. Duktale Größe in Basalmembran Matrix ist jedoch eine messbare Leistung. Eine weitere Einschränkung ist die Zeit der Ernten Verfahren in Schritt 5, die Genexpression beeinflussen könnten beteiligt. Diese Einschränkung kann durch bestätigen Ergebnisse aus Western blotting mit Immunfluoreszenz, in denen die Fixierzeit deutlich weniger als die die Erntezeit für qPCR oder Western-Blot Analyse ist gemindert werden.
Neben adenovirale Infektion kann Lentivirale Infektion in Primärzellen verwendet werden. Für Lentivirale Infektion hinzufügen 6 µg/mL Virusinfektion Enhancer Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) zu den Zellen und sanft schwenken die Platten. Anschließend fügen Sie die Lentivirus (mit einem Titer von mindestens 107 TU/mL) bei einem 1:1,000 Verdünnung und wieder sanft wirbeln. 3-5 h (37 ° C, 5 % CO2) inkubieren und dann weiter zur Einbettung der Zellen im Kollagen oder Basalmembran Matrix. Um Lentivirus mit einem Plasmid von Interesse zu erzeugen, verwenden Sie Lentivirale Verpackungsmix vermerkt in der Tabelle der Materialien.
Weitere Änderung zählen Isolation von Zellen von Mäusen, die mit dem Ausdruck KrasG12D. In diesen Mäusen, die bereits fibrotische Bereichen mit ADM und PanIN Läsionen, dauert Kollagenase Verdauung länger. Sorgfältige Überwachung der Kollagenase Verdauung, wie in den kritischen Schritten beschrieben und Fehlerbehebung, ist erforderlich. Mehr abnormen Gewebe eine Maus hat, desto länger die Verdauung dauert (etwa eine Stunde für ein zwölf Wochen alten p48Cre; LSL-KrasG12D Maus). Da es immense Unterschiede zwischen den Mäusen im gleichen Alter geben kann, raten wir zu isolieren acinar Zellen aus einer LSL -KrasG12D Maus und durchführen adenoviralen oder Lentivirale Infektion nutzt Cre um Onkogene KRas Ausdruck zu erhalten. Anzumerken ist, dass unser Protokoll zur Isolation von acinar Zelle zu untersuchen, die ADM-Prozess optimiert ist. Die Isolation von ADM und PanIN Zellen von Kras-G12D-mit dem Ausdruck Mäuse für organoide Kultur erfordert Protokolle geändert.
Ein wichtiger Schritt ist die Zeitspanne, die die gehackten Bauchspeicheldrüse in Kollagenase verbringt. Die ideale Kollagenase Aufschlusszeit variiert von Maus zu Maus und zwischen vielen Kollagenase von der gleichen Firma. Die Zeit notiert im Protokoll eignet sich für Bauchspeicheldrüse mit einem Gewicht von über 0.250 g. zu viel Zeit beschädigen und töten Zellen, während zu wenig Zeit zu unvollständiger Verdauung führt und daher weniger Zellen, die machen es durch die Filterung auf die letzte Platte. Prüfen Sie die Dissoziation von auf der Suche nach Aufschlüsselung der Stücke gehackt-Up Bauchspeicheldrüse; die Lösung sollte bewölkt drehen. Darüber hinaus kann vor dem Anhalten der Kollagenase-Reaktion mit kalten HBSS, die Lösung aufgenommen werden mit einer 5 mL pipettieren, wo zeigt die Leichtigkeit, mit der die Lösung aufgenommen werden kann, wenn es angebracht ist, die Reaktion zu stoppen. Eine weitere Überlegung ist die Anzahl der Bauchspeicheldrüse geerntet. Wenn mehrere ist eine Bauchspeicheldrüse isoliert zur gleichen Zeit, das Verfahren funktioniert am besten wenn die Bauchspeicheldrüse getrennt gehalten werden.
Ein weiterer wichtiger Punkt um gesunde Kultur der primären acinar Zellen sicherzustellen ist, dass darauf geachtet werden, sollte wenn die Lösung acinar Zelle pipettieren. Kräftig Pipettieren führt zu Zellschäden und führen zu einem Mangel an Luftkanal Bildung, auch mit Zusatz von bekannten ADM-Induktoren, wie TGF-α. Weiter, wenn es Lebensfähigkeit Probleme sind, kann der Zentrifugation in Schritten 2.4, 2.6 und 2.7 bis 300 X g geachtet werden, ein weicher Pellets produzieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen R01 Grant (CA200572) von der NIH, PS. unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder den nationalen Instituten Health.The Förderer keine Rolle in hatte studieren, Design, Datenerhebung und -Analyse, Entscheidung veröffentlichen, oder die Zubereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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