Summary
यहाँ हम व्यक्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, घुलनबिलाइज, और SLC4 ट्रांसपोर्टर खमीर का उपयोग कर परिवार के लिए समजातता के साथ कई यूकयोटिक बोरेट ट्रांसपोर्टरों को शुद्ध. हम भी एक रासायनिक पार का वर्णन परख जोड़ने के लिए multimeric विधानसभा के लिए शुद्ध homomeric प्रोटीन का आकलन । इन प्रोटोकॉल्स को अन्य चुनौतीपूर्ण झिल्ली प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Abstract
घुला हुआ वाहक 4 (SLC4) प्रोटीन के परिवार बाइकरबोनेट ट्रांसपोर्टरों कहा जाता है और ठेठ प्रोटीन anion एक्सचेंजर 1 (AE1, भी बैंड 3 के रूप में जाना जाता है), लाल रक्त कोशिकाओं में सबसे प्रचुर मात्रा में झिल्ली प्रोटीन शामिल हैं । SLC4 परिवार बोरेट ट्रांसपोर्टरों के साथ सजातीय है, जो पौधों और कवक में विशेषता है । यह संरचनात्मक या कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त मात्रा में एकरूपता के लिए झिल्ली परिवहन प्रोटीन को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती बनी हुई है । यहाँ हम saccharomyces सेरेविसिए, खमीर झिल्ली के अलगाव, डिटर्जेंट द्वारा प्रोटीन के घुलनबिकीकरण, और एस से बोरेट ट्रांसपोर्टर homologs के शोधन में बोरेट ट्रांसपोर्टरों की overexpression के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन । सेरेविसी, अरेबिटोप्सिस थालायाना, आणि धान्य सात्व. हम भी विस्तार से एक glutaraldehyde क्रॉस-प्रयोग जोड़ने के लिए homomeric ट्रांसपोर्टरों के multimerization परख । हमारे सामान्यीकृत प्रक्रियाओं सभी तीन प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है और प्रभावकारिता के लिए अनुकूलित किया गया है. यहां विकसित की गई कई रणनीतियों को अन्य चुनौतीपूर्ण झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
Introduction
पर्याप्त मात्रा में शुद्ध झिल्ली प्रोटीन प्राप्त करने में कठिनाई रिसेप्टर्स, आयन चैनल, और ट्रांसपोर्टरों के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन की खोज में एक महत्वपूर्ण अड़चन बनी हुई है. कई प्रोटोकॉल स्क्रीन करने के लिए मामूली उच्च प्रवाह पाइपलाइन के लिए मौजूद है और परीक्षार्थी झिल्ली प्रोटीन है कि अच्छी तरह से करने के लिए पर्याप्त के बाद इन विट्रो अध्ययन में सक्षम व्यक्त खोजने1,2,3,4 . आमतौर पर, प्रोटीन एक एन-या सी-टर्मिनल हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp) के साथ टैग कर रहे हैं, और अभिव्यक्ति का स्तर या तो में जेल प्रतिदीप्ति द्वारा या प्रतिदीप्ति का पता लगाने के आकार बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी (fsec)5द्वारा मॉनिटर कर रहे हैं । इस तरह के दृष्टिकोण झिल्ली प्रोटीन उंमीदवारों की उच्च व्यक्त प्रोटीन, मध्यम या कम व्यक्त प्रोटीन, या प्रोटीन है कि खराब या बिल्कुल नहीं व्यक्त करने में triaging सक्षम । यह दृष्टिकोण अच्छी तरह से काम करता है जब प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए जो भी प्रोटीन सबसे अच्छा व्यक्त का चयन करने के इरादे से उंमीदवार जीन की बड़ी संख्या की जांच है । हालांकि, कुछ मामलों में, एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक विशेष झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने पर predicated है, जो चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्तर मध्यम या कम रेंज में हैं । इसके अतिरिक्त, कभी-कभार इन मामलों में, अभिव्यक्ति स्तर केवल truncations के माध्यम से निर्माण में फेरबदल, thermostabilizing म्यूटेशन, या कोडोन अनुकूलन द्वारा कम से बढ़ा जा सकता है । यह है, इसलिए, झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति और झिल्ली प्रोटीन है कि केवल मामूली अच्छी तरह से व्यक्त करने के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है ।
ट्रांसपोर्टरों के SLC4 परिवार बिसारबोनेट ट्रांसपोर्टर anion एक्सचेंजर 1 (भी बैंड 3 के रूप में जाना जाता है), लाल रक्त कोशिकाओं6में सबसे प्रचुर मात्रा में झिल्ली प्रोटीन, और सेलुलर श्वसन के एक प्रमुख चालक भी शामिल है । SLC4 परिवार बोरेट ट्रांसपोर्टरों के साथ समजात है, जो पौधों में महत्वपूर्ण हैं और एक समान संरचना को अनियिन एक्सचेंजर 1 के साथ-साथ सोडियम-युग्मित SLC4 ट्रांसपोर्टरों7,8,9 को प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है ,10. यहां हम रिपोर्ट अनुकूलित प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का उपयोग कर एस सेरेविसिए तीन अलग बोराते खमीर और पौधों में पाया ट्रांसपोर्टरों को शुद्ध करने के लिए । हम विस्तार से महत्वपूर्ण कदम हम एकरूपता के लिए उपज और शुद्धिकरण की क्षमता का अनुकूलन लिया पर प्रकाश डाला । इसके अतिरिक्त, हम एक रासायनिक पार की रिपोर्ट एक शुद्ध प्रोटीन-डिटर्जेंट-लिपिड परिसर के संदर्भ में इन ट्रांसपोर्टरों की multimeric विधानसभा की निगरानी के लिए glutaraldehyde का उपयोग परख को जोड़ने । क्रॉस-लिंकिंग प्रयोग से आत्मशुद्धि के बाद ओलिगोमेरिक ट्रांसपोर्टरों के मल्टीमरिक राज्य का आकलन करके होमोलॉग और डिटर्जेंट की अनुकूलता का मूल्यांकन करने में मदद मिल सकती है ।
यह प्रोटोकॉल मानता है कि वांछित ट्रांसपोर्टर को एस सेरेविसिएमें अभिव्यक्ति के लिए GAL1 प्रवर्तक के प्रेरित नियंत्रण के तहत 2 μ व्युत्पन्न प्लाज्मिड में क्लोन किया गया है । इन प्रक्रियाओं के लिए, डीएनए का इस्तेमाल किया गया था पूर्ण लंबाई एन्कोडिंग जंगली-प्रकार बोराटे ट्रांसपोर्टरों सैचरोमाइसीज सेरेविसिए Bor1 (ScBor1)11, अरेबिटोप्सिस थालियाना Bor1 (AtBor1)१२, आणि धान्य सतिव Bor3 (OsBor3)१३ . प्रत्येक निर्माण में सी-टर्मिनस एक 10-अपने टैग और एक थ्रोम्बिन क्लीवेज ट्रांसपोर्टर और 10 के बीच डाला अपने टैग अगर वांछित अपने को हटाने को सक्षम करने के साथ संलग्न है । प्रोटोकॉल भी मान लेंगे कि प्लाज्मिड पहले से ही है dsy में तब्दील किया गया है-5 के अभिव्यक्ति तनाव पूर्ण पूरक चयनात्मक मीडिया (सीएसएम) पर एस सेरेविसिए की कमी histidine ।
Protocol
1. मीडिया की तैयारी और महत्वपूर्ण थें
- ५०० मिलीलीटर की कुल मात्रा में गैलाक्टोज और डी-आयनित पानी के २०० ग्राम जोड़कर ४०% गैलाक्टोज की ५०० मिलीलीटर तैयार करें । समाधान में हो रही गैलाक्टोज की दर को बढ़ाने के लिए एक गर्म थाली या माइक्रोवेव का उपयोग करें । एक वैक्यूम निस्पंदन उपकरण के साथ बाँझ फिल्टर एक ०.२ μm फिल्टर एक बाँझ कांच की बोतल से जुड़ी शीर्ष से मिलकर ।
नोट: सभी मीडिया समाधान de-ionized पानी का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं । - ५०० मिलीलीटर की कुल मात्रा में ग्लूकोज और पानी के २०० ग्राम जोड़कर ४०% ग्लूकोज की ५०० मिलीलीटर तैयार करें । जीवाणुरहित करने के लिए आटोक्लेव ।
- चार 2 एल flasks में से प्रत्येक में, ०.४ जी के साथ पूर्ण पूरक मिश्रण के हिस्टिडीन (csm-His), ३.३५ जी अमोनियम सल्फेट के साथ खमीर नाइट्रोजन आधार (ynb + नाइट्रोजन), और ४७५ मिलीलीटर पानी जोड़ें । आटोक्लेव. 2% की एक अंतिम ग्लूकोज एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए ४०% ग्लूकोज की 25 मिलीलीटर जोड़ें ।
- एक गिलास बोतल, ५० जी peptone और 25 ग्राम खमीर निकालने के लिए और ३७५ मिलीलीटर पानी के लिए जोड़ें । आटोक्लेव. ४०% गैलेक्टोज की १२५ मिलीलीटर जोड़ने के लिए 5x खमीर peptone (yp) समाधान 10% गैलेक्टोज युक्त दे ।
- जोड़ें, करने के लिए एक २५० मिलीलीटर फ्लास्क, ०.०४ जी csm-His, ०.३३५ g ynb + नाइट्रोजन, और पानी में ४७.५ मिलीलीटर. आटोक्लेव. ४०% ग्लूकोज की २.५ मिलीलीटर csm के ५० एमएल पाने के लिए जोड़ें-अपने + ynb + 2% ग्लूकोज.
- पानी की ८०० एमएल के साथ १२१.१४ जी tris आधार के मिश्रण से 1m Tris पीएच ७.० के 1 एल तैयार करते हैं । पीएच ७.० तक पहुंच केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़ें । 1 एल की एक अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें और एक ०.२ μm फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं ।
- ५०० एमएल का ०.५ मीटर एथिलेनेडिअम्मिनेटेट्राएसिटिक एसिड (edta) पीएच ८.० को मिलाकर ४०० मिलीलीटर पानी के साथ ७३.०६ ग्राम ईडटा का मिश्रण तैयार कर लें । सोडियम हाइड्रोक्साइड छर्रों जोड़ें जब तक edta भंग कर दिया है और पीएच ८.० तक पहुँचता है. ५०० मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें और ०.२ μm फिल्टर के माध्यम से गुजारें ।
- १०० मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (pmsf) के १.७४ जी मिश्रण से २०० सबूत इथेनॉल के साथ pmsf के १०० मिलीलीटर तैयार करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- 2x मनका वॉश बफर के २२५ मिलीलीटर तैयार ५० मिमी Tris पीएच ७.०, १.४ एम nacl, 20% ग्लिसरीन, और 1 मिमी edta पीएच ८.० से मिलकर ।
- तैयार १०० एमएल आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी बफर (S200 बफर) निर्वाचकगण 20 मिमी 4-morpholinoethanesulfonic एसिड हाइड्रेट (एमईएस) पीएच ६.५, १०० मिमी nacl, 2% ग्लिसरोल, और ०.०३% n-dodecyl बीटा-डी-maltopyranoside (ddm).
- १०० मिलीलीटर झिल्ली resuspension बफर के ५० मिमी Tris पीएच ७.०, ५०० मिमी nacl, और 10% ग्लिसरोल से मिलकर तैयार करें ।
- 3 मिलीलीटर 20% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 3 मिलीलीटर ग्लिसरोल, २.४ मिलीलीटर 1m Tris पीएच ६.८, ०.०३ जी ब्रोमोफीनॉल नीले, और १.६ एमएल 2-mercaptoethanol मिश्रण द्वारा एक 3x एसडीएस-पृष्ठ लोडिंग डाई की 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
2. एस सेरेविसी में बोरेट ट्रांसपोर्टर की ओवरएक्सप्रेशन
- csm के ५० मिलीलीटर में तीन तब्दील खमीर कालोनियों inoculate-अपने + ynb + 2% ग्लूकोज मीडिया और 30 डिग्री सेल्सियस पर १९० आरपीएम पर रात भर हिला ।
- निम्नलिखित दिन ६०० एनएम (ओडी६००) की तरंगदैर्घ्य पर ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करते हैं और प्रत्येक चार 2 एल फ्लैक्स में से एक ओडी६०० के लिए संरोपण करते हैं कि प्रत्येक में csm के ५०० एमएल होते हैं-उनके + ynb + 2% ग्लूकोज मीडिया ।
- 30 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर १९० rpm पर शेक के लिए कोशिकाओं को सभी ग्लूकोज की खपत और एक उच्च घनत्व के लिए बढ़ने की अनुमति है ।
नोट: बड़ा सेल पैदावार में एक लंबे समय तक विकास के परिणाम, बड़ी फसल झिल्ली पैदावार, और अंततः बड़ा शुद्ध प्रोटीन पैदावार । - 2% गैलेक्टोज की एक अंतिम प्रेरण एकाग्रता के लिए 10% गैलेक्टोज के साथ की पूरक 5x yp मीडिया के १२५ मिलीलीटर जोड़कर अभिव्यक्ति प्रेरित । 16 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर १९० आरपीएम पर हिला ।
- 15 मिनट के लिए ४,००० एक्स जी में कताई द्वारा फसल कोशिकाओं को १०० मिलीलीटर ठंडे पानी में कोशिकाओं resuspend ।
नोट: इस बिंदु पर कोशिकाओं पर जमे हुए हो सकता है-८० ° c अनिश्चित काल के लिए, या तैयारी सेल lysis और झिल्ली कटाई में जारी रख सकते हैं । हम आम तौर पर कोशिकाओं के 40-45 ग्राम फसल ।
3. खमीर झिल्ली की कटाई
- सेल resuspension ११.२५ मिलीलीटर की 1m Tris पीएच ७.०, ०.४५ एमएल के ०.५ एम edta, और २.२५ mM pmsf के १०० मिलीलीटर, जो के बाद दो प्रोटेज़ inhibitors के रूप में कार्य करने के लिए जोड़ें । २२५ मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें, जो ५० मिमी Tris पीएच ७.०, 1 मिमी edta, और 1 मिमी pmsf के एक सेल resuspension बफर में परिणाम है ।
नोट: यदि जमे हुए कोशिकाओं का उपयोग कर कोशिकाओं को अच्छी तरह से गल, कमरे के तापमान पर 1 ज के बारे में अनुमति देते हैं, क्योंकि अगर वे आंशिक रूप से जमे हुए रहते हैं, वे मनका पिटाई से lysis का विरोध करेंगे । - एक ४५० एमएल मनका पिटाई के लिए धातु कनस्तर में सेल resuspension जोड़ें । ठंडा ०.५ मिमी गिलास मोती के साथ शेष मात्रा से ऊपर ।
- रोटर के साथ एक मनका पिटाई चैंबर इकट्ठा और एक बर्फ स्नान में विसर्जित कर दिया । छह 1 मिनट दालों, 2 मिनट बाकी अवधि से अलग करने के लिए lysate भडक रोकने के ।
- एक प्लास्टिक डिस्पोजेबल बोतल शीर्ष फिल्टर एक गिलास बोतल में खराब का उपयोग करके एक वैक्यूम निस्पंदन उपकरण इकट्ठा । निस्पंदन झिल्ली निकालें, क्योंकि शेष प्लास्टिक डिवाइस lysate पारित करने के लिए अनुमति देता है, जबकि मोती पर कब्जा कर सकते हैं । विधानसभा पर मनका पिटाई चैंबर की सामग्री डालने के दौरान वैक्यूम लागू करते हुए lysate से मोती अलग ।
- एक 2x धो बफर है कि ५० मिमी Tris पीएच ७.०, 1 मिमी edta, 1 मिमी pmsf, १.४ एम nacl, और 20% ग्लिसरोल शामिल है की २२५ मिलीलीटर के साथ मनका पिटाई चैंबर धो लें । उन्हें धोने के लिए मोती पर चैंबर की सामग्री को खाली करें ।
नोट: धोने ~ ४५० मिलीलीटर लीजड ड कोशिकाओं की एक अंतिम मात्रा देता है और काफी काटा झिल्ली पैदावार बढ़ जाती है । अंतिम सांद्रता हैं ५० मिमी Tris पीएच ७.०, 1 मिमी edta, 1 मिमी pmsf, 10% ग्लिसरोल, और ७०० मिमी nacl, और नमक एकाग्रता तरक्की के प्राथमिक उद्देश्य परिधीय झिल्ली प्रोटीन को अलग करने में मदद करने के लिए है. - १५,००० एक्स जीपर 15 मिनट के लिए सेल lysate नीचे स्पिन । पॉलीकार्बोनेट बोतलों में सतह पर तैरनेवाला डालो और 1 एच के लिए स्पिन में १३५,००० एक्स जी एक ultracentrifuge में झिल्ली इकट्ठा करने के लिए ।
नोट: यदि एक ultracentrifuge उपलब्ध नहीं है, झिल्ली ५३,००० एक्स जी, एक बल है कि मंजिल मॉडल centrifuges में प्राप्त है पर 3 एच के लिए कताई द्वारा एकत्र किया जा सकता है । - सतह पर तैरनेवाला त्यागें और झिल्ली छर्रों के साथ बोतलों तौलना. झिल्ली छर्रों resuspend लगभग ३५ मिलीलीटर झिल्ली resuspension बफर युक्त ५० मिमी Tris पीएच ७.०, ५०० मिमी nacl, और 10% ग्लिसरोल और एक गिलास डाउंसर में जोड़ें । काटी गई झिल्ली के द्रव्यमान को निर्धारित करने के लिए खाली अपकेंद्रिका ट्यूबों का वजन करें ।
नोट: एक कुशल झिल्ली फसल में, झिल्ली का वजन लगभग 20% है कि झिल्ली फसल के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं के वजन के बराबर हो जाएगा । इस प्रोटोकॉल 40-45 जी की विशिष्ट सेल पैदावार देता है, और इस प्रकार हम इसी तरह 8-9 जी झिल्ली की एक उपज की उंमीद है । - dounce झिल्ली homogenize, और ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों है कि अब अनिश्चित काल के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है में aliquot ।
नोट: इस प्रयोग के लिए, आम तौर पर दो aliquots बना रहे हैं, दो अलग प्रोटीन शुद्धिकरण की अनुमति देने के लिए एक मूल कोशिका तैयारी से किया जाएगा ।
4. घुलनबिलीकरण और प्रोटीन की शुद्धि
- एक बीकर में एक हलचल बार जोड़ें और १५० मिलीग्राम एन-डोडेसिल-β-डी-माल्टोप्लानोसाइड (डीडीएम) प्रति जी झिल्ली का उपयोग किया जा रहा है । हर समय बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन रखें ।
नोट: ddm आर्द्रताग्राही है और उपयोग में नहीं जब-20 डिग्री सेल्सियस पर जलशुष्कक के साथ एक गिलास जार में संग्रहित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, यह शुद्ध प्रोटीन की एक प्रशंसनीय राशि प्राप्त करने के लिए शुद्धि में 4-5 ग्राम झिल्ली के बीच का उपयोग करने के लिए विशिष्ट है । - गल झिल्ली और 1 मिमी pmsf और 20 मिमी imidazole पीएच ८.० के साथ झिल्ली resuspension बफर पूरक में 15 मिलीलीटर प्रति जी झिल्ली की एक अंतिम मात्रा में लाने के लिए । ddm के साथ बीकर में झिल्ली जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए हलचल ।
नोट: ddm एकाग्रता 1% w/v, लेकिन झिल्ली प्रोटीन के घुलनबिकीकरण के लिए यह अधिक प्रति जी झिल्ली डिटर्जेंट जोड़ा के द्रव्यमान के बारे में पता होना महत्वपूर्ण है । - 4 डिग्री सेल्सियस पर १३५,००० एक्स जी में 25 मिनट के लिए स्पिन गोली गैर-solubilized सामग्री के लिए । एक 5 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर ।
- सिकुड़नेवाला पंप द्वारा नमूना लोड 1 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर के लिए सेट/मिनट पर एक 1 मिलीलीटर मैटीरियल निकल आत्मीयता कॉलम में equilibrated 20 मिमी Tris पीएच ७.०, ५०० मिमी nacl, 10% ग्लिसरोल, 20 मिमी imidazole पीएच ८.०, और ०.०५% ddm ।
नोट: कम व्यक्त प्रोटीन के लिए, सुधार शुद्धता और पैदावार 5 मिलीलीटर कॉलम के बजाय 1 मिलीलीटर का उपयोग करके मनाया गया, और एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी के लिए कोबाल्ट आयनों के बजाय निकल गया । - एक धो बफर के 10 कॉलम संस्करणों के साथ कॉलम धो 20 मिमी Tris पीएच ७.०, ५०० मिमी nacl, 10% ग्लिसरीन, ८० मिमी imidazole पीएच ८.०, और ०.०५% ddm ।
नोट: imidazole एकाग्रता है कि एक के लिए बहाकर के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है 10-His-टैग प्रोटीन से अधिक है आमतौर पर की सराहना की और सुधार शुद्धता में परिणाम. - 20 मिमी Tris पीएच ७.०, २०० मिमी nacl, 10% ग्लिसरीन, ३०० मिमी imidazole पीएच ८.०, और ०.०५% ddm युक्त बफर में प्रोटीन elute । दस 1 मिलीलीटर भागों में eluate ले लीजिए और एक 4-20% Tris-ग्लाइसिन एसडीएस-पृष्ठ जेल को सॉल्बिकृत lysate और धो अंशों पर चलाते हैं ।
- पूल पीक भिन्न, आम तौर पर के बारे में 5-6 मिलीलीटर, और एक में ५० केडीए cutoff संकेंद्रक में ५०० μl या कम मात्रा के लिए ध्यान केंद्रित एक बेंच टॉप सेंट्र्ज में 4 ° c.
नोट: ५०० μl आकार बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) कॉलम में इंजेक्ट की गई एक विशिष्ट अधिकतम मात्रा है । इस बिंदु पर प्रोटीन-८० डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है या सेकंड पर जारी है । - एक ०.२ μm स्पिन कॉलम फिल्टर के माध्यम से प्रोटीन फ़िल्टर और एक आकार बहिष्करण कॉलम पर सुई (जैसे, superdex-२००) S200 बफर में equilibrated: 20 मिमी एमईएस पीएच ६.५, १०० मिमी nacl, 2% ग्लिसरीन, और ०.०३% ddm ।
नोट: बाद glutaraldehyde पार के लिए परख जोड़ने, बफरिंग एजेंट एक प्राथमिक amine शामिल नहीं होना चाहिए । एसईसी विनिमय buffers के लिए एक अवसर यदि आवश्यक है, के रूप में यहां किया जब एमईएस के लिए Tris का आदान प्रदान । - 4-20% Tris-ग्लाइसिन एसडीएस-पृष्ठ जेल पर चोटी के अंशों को चलाएं । , जेल दाग शुद्ध चोटी भिन्न इकट्ठा, और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ५० केडीए-cutoff संकेन्द्रित में ध्यान केंद्रित ।
- २८० एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापने के द्वारा प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें, और-८० डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए दुकान ।
5. glutaraldehyde पार से जोड़ने परख
- S200 बफर, S200 बफर के 5 μl, या तो पानी की 1 μl या 20% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), १.५% glutaraldehyde के 1 μl के बाद के 3 μl मिश्रण से एक 10 μl प्रतिक्रिया तैयार करते हैं ।
नोट: यह ०.१५ मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन और ०.१५% glutaraldehyde की एक 1x प्रतिक्रिया दे देंगे । एसडीएस के एक पूर्व उपचार युक्त नमूने महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं और मिलाया जाना चाहिए और glutaraldehyde जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated. - कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं । 3x एसडीएस के 5μl जोड़कर प्रतिक्रिया समाप्त-पृष्ठ जेल लोड हो रहा है डाई, जो एक अतिरिक्त शामिल है Tris बफर कि glutaraldehyde quenches.
- सभी 15 μl को 4-20% Tris-ग्लाइसिन एसडीएस-पेज जेल पर लोड करें, जो १.५ μg प्रोटीन प्रति लेन लोड करेगा । 30 मिनट के लिए २०० V पर जेल भागो. दाग और डिमर क्रॉस की हद तक एक बैंड है कि दो बार विकृत monomer के आकार में चलाता है के सबूत से जोड़ने का निर्धारण ।
नोट: एक glutaraldehyde टाइट्रेट करना और समय पाठ्यक्रम पहले एक homomeric ट्रांसपोर्टर के लिए सबसे अच्छी स्थिति खोजने के लिए किया जा सकता है ।
Representative Results
निकल समानता प्रदर्शन से eluted भिन्न के लिए विशिष्ट जैल क्रोमेटोग्राफी सभी तीन प्रोटीन आंशिक रूप से शुद्ध दिखाएँ (चित्रा 1एक). सीढ़ी के सही करने के लिए lysate है, जो प्रत्येक मामले में एक महत्वपूर्ण बैंड बोरेट ट्रांसपोर्टर जो प्रोटीन है कि अच्छी तरह से overexpress नहीं है के लिए विशिष्ट है करने के लिए इसी को प्रदर्शित नहीं करता है । ८० मिमी धोने लेन 10 के ंयूनतम नुकसान से पता चलता है, अपेक्षाकृत उच्च imidazole एकाग्रता के बावजूद अपने टैग प्रोटीन । बोरेट ट्रांसपोर्टरों के लिए इसी बैंड eluted भागों में आसानी से स्पष्ट कर रहे हैं, और के लिए eluted प्रोटीन के थोक शामिल समझा भागों S200 जेल निस्पंदन कॉलम पर इंजेक्शन से पहले केंद्रित कर रहे हैं । इस स्तर पर, प्रोटीन कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अपर्याप्त रूप से शुद्ध कर रहे हैं, S200 कॉलम (चित्रा 1बी) पर इंजेक्शन लगाने से पहले केंद्रित नमूने में अतिरिक्त बैंड द्वारा संकेत के रूप में । हालांकि, आकार बहिष्करण कॉलम पर नमूना इंजेक्शन उच्च शुद्धता (चित्रा 1बी-सी) के eluted अंशों से पता चलता है । क्रोमेटोग्राम और बोरेट ट्रांसपोर्टरों में से प्रत्येक के लिए उनके इसी जैल प्रस्तुत कर रहे हैं । समानता वर्णलेखन से रेफरेंस पर नमूनों की उदारवादी शुद्धता के बावजूद, प्रोटीन जेल निस्पंदन कॉलम से eluting पर अत्यधिक शुद्ध है । गंभीर रूप से, क्रोमेटोग्राम प्रत्येक प्रोटीन को मुख्य रूप से शून्य मात्रा में बनाए रखा थोड़ा प्रोटीन के साथ एक एकल समकणपरिक्षेपी चोटी के रूप में माइग्रेट करने के लिए प्रकट होता है । एक स्थिर और जोड़ प्रोटीन आम तौर पर एक समकणपरिक्षेपी और सममित चोटी देता है, जबकि अस्थिर, misfolded, या एकत्रित प्रोटीन आम तौर पर या तो कई असममित चोटियों या शूंय मात्रा में एक बड़ी चोटी दे देंगे । यह लगभग की एक अंतिम उपज प्राप्त करने के लिए विशिष्ट है 2 ScBor1 के लिए खमीर संस्कृति के एल प्रति शुद्ध प्रोटीन मिलीग्राम, और लगभग 1 शुद्ध AtBor1 और OsBor3 प्रति l संस्कृति के प्रत्येक मिलीग्राम. ये संख्या 4-5 जी झिल्ली के एक aliquot से शुद्ध प्रोटीन की मात्रा, जो हमारे मूल कोशिका तैयारी के एक आधे से निकलती है ।
पार से जोड़ने के प्रयोग से पता चलता है कि शुद्ध homomeric ट्रांसपोर्टरों समाधान में उनकी विधानसभा आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्रा 2) । एसडीएस के एक पूर्व उपचार युक्त नमूनों के प्रयोजन के लिए है कि पार से जोड़ने के समाधान में एक जोड़ राज्य पर निर्भर है और उस पार से जोड़ने इसलिए जब multimerization एक कठोर डिटर्जेंट द्वारा बाधित है नहीं होती है । परिणामों में भेद दिखाया है कि तीन बोरेट ट्रांसपोर्टरों में से एक, ScBor1, जब इन स्थितियों में ddm में शुद्ध dimerized नहीं है, जबकि अंय दो, AtBor1 और OsBor3, पार लिंक और शो dimerized । यह देखना है कि नहीं सभी प्रोटीन पार कर सकते है लिंक संभव है । इस उदाहरण में, OsBor3 एकलक की मात्रा का पता लगाएँ, जबकि AtBor1 क्रॉस-लिंक्स पूर्णता के लिए दिखाई देते हैं । पार से जोड़ने की हद तक एक दूसरे के निकटता में lysine अवशेषों की संख्या पर निर्भर करेगा, और यह संभव है कि अंय पार से जोड़ने के अभिकर्मकों कुशलतापूर्वक विभिंन झिल्ली प्रोटीन पार लिंक कर सकते हैं ।
चित्रा 1 . निकेल आत्मीयता और आकार बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी तीन बोरेट ट्रांसपोर्टरों के लिए शुद्धि । प्रत्येक अनुलंब फलक (A), (B), और (C) में ScBor1, AtBor1, और OsBor3 के लिए डेटा होता है । (क) निकेल एफ़िनिटी कॉलम । एम बाईं करने के लिए निर्दिष्ट केडीए में वजन के साथ आणविक वजन मार्कर की एक सीढ़ी है. एल कच्चे lysate है, और डब्ल्यू ८० मिमी imidazole धोने है । अन्य सभी गिने जाने वाले लेन 1 मिलीलीटर के अनुरूप हैं ३०० मिमी इमिडाज़ोल के साथ eluted । भिन्नों के ऊपर की पट्टियां संकेत करती हैं कि स्तंभ पर इंजेक्शन के लिए संयोजित और केंद्रित होने के लिए चयनित किए गए हैं. (इ) S200 स्तंभ पर इंजेक्शन लगाने से पहले प्रकेंद्रित प्रोटीन को इंगित करता है । एलुटेड सेकंड अंशों सही करने के लिए कर रहे हैं, (सी) में उनके वर्णक अंशों के साथ जेल गलियों मैच के लिए इस्तेमाल किया कोष्ठक के साथ. शूंय मात्रा सिर्फ 8 मिलीलीटर के बाद है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2 . पार से जोड़ने परख multimeric विधानसभा के लिए शुद्ध ट्रांसपोर्टरों का आकलन है । बाईं ओर आणविक भार वाली एक सीढ़ी दर्शाई गई है । अन्य सभी गलियों के ऊपर दिखाया गया है जो प्रोटीन मौजूद है और क्या नमूना glutaraldehyde जोड़ा या glutaraldehyde इसके अलावा पहले एसडीएस के एक पूर्व उपचार किया गया है । तीर AtBor1 और OsBor3 के लिए एकलक और द्वितय की स्थिति से संकेत मिलता है । ScBor1 AtBor1 और OsBor3 की तुलना में एक छोटे से प्रोटीन है और उम्मीद के रूप में चलाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
Discussion
यहाँ हम विस्तृत प्रोटोकॉल है कि तीन अलग यूकर्योटिक बोरेट ट्रांसपोर्टरों की एकरूपता के लिए शुद्धि में परिणाम साझा किया है. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल्स, एस. सेरेविसी1,14में अभिंन झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अन्य प्रोटोकॉलों से व्युत्पन्न हैं, और हमारे अनुकूलन दोनों में सुधार शुद्धता और बेहतर पैदावार में परिणाम हैं । यहां अनुकूलित मापदंडों में सेल कल्चर ग्रोथ वॉल्यूम और टाइम्स, मनका-धड़कन लाइसिस प्रक्रियाएं, सेल lysis और प्रोटीन शुद्धिकरण के दौरान बफर संरचना, ग्राम झिल्ली के अनुसार डिटर्जेंट का उपयोग किया जाता है, धातु आयन अपनत्व शुद्धि में पहचान करते हैं, आत्मीयता कॉलम की मात्रा, और एक पार के कार्यांवयन-परख जोड़ने के लिए oligomeric ट्रांसपोर्टरों के multimeric राज्य का आकलन द्वारा homolog और डिटर्जेंट उपयुक्तता मूल्यांकन । प्रोटोकॉल संयंत्र और कवक प्रजातियों से कई SLC4 homologs के लिए सफल रहे हैं । अभिंन झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि के लिए सभी रणनीतियों की एक सीमा है कि वहां कोई सार्वभौमिक झिल्ली प्रोटीन शोधन विधि है कि काम करने की गारंटी है मौजूद है । यह संभव है कि हमारे प्रोटोकॉल और SLC4 ट्रांसपोर्टरों के लिए अनुक्रम पहचान और संरचना में करीब प्रोटीन के लिए सफल होने की संभावना है, और इस प्रकार SLC4 के सदस्यों, SLC23, और SLC26 परिवारों के लक्ष्य15का वादा किया जा सकता है । इसी तरह, बोरेट ट्रांसपोर्टरों से अधिक विकासपरक दूर एक झिल्ली ट्रांसपोर्टर हो सकता है, अधिक संभावना प्रोटोकॉल अलग होना होगा, इस तरह के रूप में अभिव्यक्ति प्रणाली, डिटर्जेंट, या अन्य प्रमुख मापदंडों4अलग से.
प्रोटोकॉल प्रोटीन शुद्धि, अपने टैग में सबसे अधिक इस्तेमाल किया संबध टैग का लाभ लेता है । प्रारंभिक eluted भिन्न में अशुद्धियों की उपस्थिति के बावजूद, निकेल समानता के संयोजन, व्यापक धोने, और बाद में एसईसी शुद्धि परिणाम अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन में. एक 10-अपने टैग और अधिक कठोर imidazole बहाकर के लिए अनुमति देता है और इस तरह से और अधिक पृष्ठभूमि बाध्यकारी प्रोटीन को हटा सकते है 8 से अनुमति दी बहाकर में हटाया जा सकता है-अपने-या 6-अपने टैग । शुद्ध अंशों के लिए हमारे चयन सबसे अत्यधिक शुद्ध जेल अंशों के रूढ़िवादी पक्ष पर अं, जो पीक सेकंड अंशों के अनुरूप हैं । अंतिम प्रोटीन पैदावार पूलिंग और अधिक भागों ध्यान केंद्रित करके बढ़ाया जा सकता है, जबकि व्यापार के साथ थोड़ा कम शुद्ध प्रोटीन के बंद । तरीकों यहां प्रस्तुत की मात्रा में AtBor1 की शुद्धि सक्षम है कि इसके क्रिस्टल संरचना7के निर्धारण के लिए नेतृत्व किया, शुद्धिकरण से अपने-टैग काटने और एक अलग में ट्रांसपोर्टर का आदान प्रदान के मतभेदों के साथ डिटर्जेंट क्रिस्टल डिवर्तन7में सुधार करने के लिए ।
हमारे प्रोटोकॉल homologs के चयन के लिए महत्वपूर्ण बातों को जंम देती है और डिटर्जेंट को घुलनहीन और उंहें शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया । डीडीएम डिटर्जेंट के लिए एक आम पहली पसंद है क्योंकि यह अपेक्षाकृत हल्के है, अक्सर घुलनबिलीकरण में सफल है, और झिल्ली प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । निर्धारित करना है कि क्या एक डिटर्जेंट एक झिल्ली के लिए एक गरीब चयन है, मूल्यांकन की एक आम विधि है कि क्या प्रोटीन एक एसईसी वर्णक पर एक एकल समकणपरिक्षेपी चोटी देता है, बजाय शूंय मात्रा में एक बड़ी चोटी या polydisperse चोटियों की एक सीमा है, जो misfolded या अस्थिर प्रोटीन से संकेत मिलता है । एक अधिक सूक्ष्म विचार ScBor1 की हमारी शुद्धि द्वारा उठाया है । यह बड़ी मात्रा में शुद्ध और एक सेकंड वर्णलेख, जो यह संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक आकर्षक लक्ष्य हो सकता है पता चलता है पर अनुकूल और समकणपरिक्षेपी लग रहा है । हालांकि, हमारे पार से जोड़ने परख पता चलता है कि यह एक एकलक जब शुद्ध है । हालांकि यह संभव है कि ScBor1 natively सेल में एक एकलक के रूप में मौजूद सकता है, अध्ययनों से संकेत मिलता है कि SLC4 ट्रांसपोर्टरों और उनके homologs के लिए dimers7,8,9,10होने की संभावना है । पार के हमारे विकास को जोड़ने परख क्रिस्टलीकरण और AtBor1 की संरचना को सुलझाने के बाद हुई । हालांकि, हम के साथ AtBor1 के साथ तुलना में ScBor1 मूल्यांकन करने में सक्षम किया गया पार-परख जोड़ने, बहुमूल्य समय और अनुसंधान के प्रयासों के बजाय ScBor1 के AtBor1 की खोज करने के लिए पुनः निर्देशित किया गया हो सकता है, जिसके बाद अंततः में सफल नहीं था क्रिस्टलीकरण और डिवर्तन प्रयोग । इस तरह इस परख शोधकर्ताओं की मदद कर सकते है या तो homologs या डिटर्जेंट के बीच अंतर का उपयोग करें जब संरचनात्मक अध्ययन का पीछा करने के क्रम में शर्तों जिसमें प्रोटीन अपने संदिग्ध देशी conformation बनाए रखता है प्राथमिकता । इसके अतिरिक्त, परख जो अमीनो एसिड multimerization के लिए महत्वपूर्ण है जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आदेश में एमिनो एसिड प्रतिस्थापन कि multimerization इंटरफेस अस्थिर और अबाध्यकारी monomers को बढ़ावा खोजने के लिए । इस तरह के एक दृष्टिकोण झिल्ली ट्रांसपोर्टरों16,17,18में homomeric विधानसभा के कार्यात्मक महत्व की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
हमारी विधि का एक सामान्य लाभ यह है कि खमीर विविध समारोह1के कई चुनौतीपूर्ण झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सक्षम करने के लिए दिखाया गया है । इसके अतिरिक्त, अपनी कम लागत और विकास के समय कई अनुसंधान के प्रयासों के लिए अपनी पहुंच को बढ़ावा देने कि कम अभिव्यक्ति रणनीतियों कि ऊतक संस्कृति या महंगी विकास मीडिया की आवश्यकता का उपयोग कर सकते हैं । यहां प्रस्तुत प्रक्रियाएं अपेक्षाकृत सस्ती हैं और एक सप्ताह में प्रदर्शन किया जा सकता है जो दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को रेखांकित करता है । इन प्रोटोकॉल्स का कार्यान्वयन अन्य चुनौतीपूर्ण झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययनों को सक्षम करने में मदद कर सकता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस शोध को डेविडसन कॉलेज में स्टार्टअप फंड्स ने सपोर्ट किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
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