Summary
Her præsenterer vi en protokol for at udtrykke, solubilize og rense flere eukaryote Borat transportvirksomheder med homologi til familien SLC4 transporter ved hjælp af gær. Vi beskriver også en kemisk tværbindingsmidler analyse for at vurdere renset homomeric proteinerne for multimeriske forsamling. Disse protokoller kan tilpasses andre udfordrende Membranproteiner.
Abstract
Familien opløst stof Carrier 4 (SLC4) af proteiner kaldes bikarbonat transportvirksomheder og omfatter den arketypiske protein Anion varmeveksler 1 (AE1, også kendt som Band 3), den mest rigelige membran protein i de røde blodlegemer. Familien SLC4 er homolog med Borat transportvirksomheder, som er blevet karakteriseret i planter og svampe. Det er fortsat en betydelig teknisk udfordring at udtrykke og rense membrantransport proteiner til homogenitet i mængder, der er egnet til strukturelle eller funktionelle studier. Her beskriver vi detaljerede procedurer for overekspression af Borat transportvirksomheder i Saccharomyces cerevisiae, isolation af gær membraner, oploesning af protein af vaskemiddel og rensning af Borat transporter homologs fra S. cerevisiae, Arabidopsis thalianaog Oryza sativa. Vi detalje også en glutaraldehyd cross-linking eksperiment for at analyse multimerization af homomeric transportører. Vores generelle procedurer kan anvendes på alle tre proteiner og er blevet optimeret til effektivitet. Mange af de strategier, der er udviklet her kan udnyttes til undersøgelse af andre udfordrende Membranproteiner.
Introduction
Vanskeligt ved at fremskaffe tilstrækkelige mængder af renset membran proteiner forbliver en kritiske flaskehals i forfølgelsen af strukturelle og funktionelle studier af receptorer, ionkanaler og transportvirksomheder. Mange protokoller findes for moderat høj overførselshastighed rørledninger til skærmen og find kandidat Membranproteiner der express godt nok til at aktivere efterfølgende in vitro- undersøgelser1,2,3,4 . Typisk, proteiner er markeret med et N - eller C-terminale grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis), og udtrykket niveauer overvåges-gel fluorescens eller ved registrering af fluorescens størrelse udstødelse kromatografi (FSEC)5. Sådanne tilgange aktiverer triaging membran protein kandidater i høj udtrykker proteiner, moderat eller lav udtrykte proteiner, eller proteiner, der udtrykker dårligt eller slet ikke. Denne fremgangsmåde fungerer godt, når den eksperimentelle design er at undersøge store mængder af kandidat gener med henblik på at vælge, hvilken protein udtrykker bedst. Dog i nogle tilfælde, er en eksperimenterende tilgang baseret på at studere en bestemt membran protein, som kan være udfordrende, når denne Proteinniveau udtryk i rækken moderat eller lav. Desuden, kan nogle gange i disse tilfælde udtryk kun minimalt hæves ved at ændre konstruktion via udeladelser, thermostabilizing mutationer eller codon optimering. Det er derfor undertiden nødvendigt at optimere membran protein proteinekspression og -oprensning protokoller for Membranproteiner, der udtrykker kun moderat godt.
SLC4 familie af transportvirksomheder omfatter bikarbonat transporter Anion varmeveksler 1 (også kendt som Band 3), den mest rigelige membran protein i røde blodlegemer6og en vigtig drivkraft for cellulær respiration. Familien SLC4 er homolog med Borat transportvirksomheder, som er kritiske i planter og har vist sig at udstille en lignende struktur Anion veksleren 1 såvel som natrium-kombineret SLC4 transportører7,8,9 ,10. Her rapporterer vi optimeret protein proteinekspression og -oprensning protokoller ved hjælp af S. cerevisiae at rense tre forskellige Borat transportvirksomheder fundet i gær og planter. Vi fremhæve i detaljer vigtigste skridt vi tog til at optimere udbytte og effektivitet af purifications til ensartethed. Desuden rapporterer vi en kemiske tværbindingsmidler analyse ved hjælp af glutaraldehyd for at overvåge multimeriske samling af disse transportører i konteksten af en renset protein-vaskemiddel-lipid komplekse. Den tværbindingsmidler eksperiment kan hjælpe vurdere homolog og vaskemiddel egnet ved at vurdere tilstanden multimeriske af oligomere transportvirksomheder efter rensning.
Denne protokol antager, at den ønskede transporter er blevet klonet i en 2 µ afledt plasmid under for GAL1 til udtryk i S. cerevisiaeinducerbar kontrol. For disse procedurer, DNA blev brugt kodning fuld længde vildtype Borat transportvirksomheder Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12og Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . C-terminus i hver konstruktion er vedlagt med en 10-hans-tag og en thrombin kavalergang site indsættes mellem transportvirksomheden og 10-hans-tag til at aktivere sin afsked hvis ønsket. Protokollen vil også antage, at plasmidet allerede er blevet omdannet til den DSY-5 udtryk belastning af S. cerevisiae komplet supplerende selektive medier (CSM) mangler histidin.
Protocol
1. forberedelse af medier og vigtige buffere
- Forbered 500 mL 40% galactose ved at tilføje 200 g af galaktose og afioniseret vand til et volumen på 500 mL. Brug en varmeplade eller mikrobølgeovn til at øge hastigheden af galaktose at komme ind i løsning. Sterile filter med et vakuum filtrering apparat bestående af en 0,2 µm filter top knyttet til et sterilt glasflaske.
Bemærk: Alle media solutions er tilberedte med afioniseret vand. - Forberede 500 mL 40% glucose ved at tilføje 200 g glucose og vand i en samlet maengde paa 500 mL. Autoklave til at sterilisere.
- Til hver af de fire 2 L flasker, tilføje 0,4 g komplet supplement blanding uden histidin (CSM-hans), 3,35 g gær nitrogen base med ammonium sulfat (YNB + kvælstof) og 475 mL vand. Autoklave. Der tilsættes 25 mL 40% glukose til at opnå en endelig glukose koncentration på 2%.
- Tilføje, at en glasflaske, 50 g pepton og 25 g gær extract og vand til 375 mL. Autoklave. Tilføj 125 mL 40% galactose at give 5 x gær pepton (YP) opløsning indeholdende 10% galactose.
- Tilføje til en 250 mL kolbe, 0,04 g CSM-hans, 0.335 g YNB + kvælstof og vand til 47,5 mL. Autoklave. Tilsættes 2,5 mL af 40% glukose til få 50 mL af CSM-hans + YNB + 2% glukose.
- Forberede 1 L 1M Tris pH 7,0 ved at blande 121.14 g af Tris base med 800 mL vand. Tilføje koncentreret saltsyre, til pH 7,0. Tilsæt vand til en endelige volumen på 1 L og passere gennem en 0,2 µm filter.
- Forberede 500 mL 0,5 M ethylendiamintetra syre (EDTA) pH 8,0 ved at blande 73.06 g af EDTA med 400 mL vand. Tilføje natriumhydroxid pellets, indtil EDTA er opløst og pH når 8.0. Tilsæt vand til en endelige mængden af 500 mL og passere gennem en 0,2 µm filter.
- Forberede 100 mL 100 mM phenylmethanesulfonyl fluorid (PMSF) ved at blande 1,74 g af PMSF med 200 bevis ethanol. Opbevares ved-20 ° C.
- Forberede 225 mL 2 x perle wash buffer bestående af 50 mM Tris pH 7,0, 1,4 M NaCl, 20% glycerol og 1 mM EDTA pH 8,0.
- Forberede 100 mL størrelse udstødelse kromatografi buffer (S200 buffer) bestående af 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic syre hydrat (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glycerol og 0,03% n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (Bettinas).
- Forberede 100 mL af membran resuspension buffer bestående af 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, og 10% glycerol.
- Forberede 10 mL af en 3 x SDS-PAGE lastning farvestof ved at blande 3 mL 20% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS), 3 mL glycerol, 2,4 mL 1M Tris pH 6,8, 0,03 g bromophenol blå og 1,6 mL 2-mercaptoethanol.
2. overekspression af Borat Transporter i S. cerevisiae
- Podes tre transformerede gær kolonier i 50 mL af CSM-hans + YNB + 2% glukose medier og omrystes natten over på 190 rpm ved 30 ° C.
- Den følgende dag bruger et spektrofotometer til at bestemme det optiske densitet ved en bølgelængde på 600 nm (OD600) og podes til en OD600 0,01 fire 2 L flasker, hver indeholder 500 mL af CSM-hans + YNB + 2% glukose medier.
- Ryste på 190 rpm ved 30 ° C til 30 h at tillade cellerne til at forbruge alle glukose og vokse til en høj densitet.
Bemærk: Længere vækst tid resulterer i større celle udbytter, større høstede membran udbytter, og i sidste ende større oprenset protein udbytter. - Inducere udtryk ved at tilføje 125 mL 5 x YP media suppleret med 10% galactose for en endelige induktion koncentration af 2% galactose. Ryste på 190 rpm ved 30 ° C i 16 h.
- Høst celler ved spinning på 4.000 x g i 15 min. Resuspend celler i 100 mL koldt vand.
Bemærk: på dette tidspunkt celler kan fryses ved-80 ° C på ubestemt tid, eller prep kan fortsætte ind i cellen lysis og membran høst. Vi høster typisk 40-45 g af celler.
3. høst af gær membraner
- Tilføje til celle ophvirvling 11,25 mL 1M Tris pH 7,0, 0,45 mL 0,5 M EDTA og 2,25 mL 100 mm PMSF, sidstnævnte hvoraf to handle som proteasehæmmere. Tilsæt vand til en endelige mængden af 225 mL, hvilket resulterer i en celle resuspension buffer på 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, og 1 mM PMSF.
Bemærk: Hvis du bruger frosne celler tillade celler at tø grundigt, ca 1 time ved stuetemperatur, fordi hvis de forbliver delvis frosset, de vil modstå lysering af perle bankende. - Tilføje celle resuspension i en 450 mL metal dunk for perle slå. Top off de resterende volumen med kolde 0,5 mm glasperler.
- Samle en perle-slå kammer med rotoren og fordybe i isbad. Udføre seks 1 min pulser, adskilt af 2 min hvile til forhindre overophedning af lysate.
- Saml et vakuum filtrering apparat ved hjælp af en plastik, engangs flaske top filter skruet ind i en glasflaske. Fjerne membran filtrering fordi resterende plast enheden kan fange perlerne samtidigt med at tillade lysate at passere. Adskille perler fra den lysate ved at hælde indholdet af perle slå kammer på forsamling mens anvender vakuum.
- Vask perle slå kammer med 225 mL af en 2 x vaskebuffer, der indeholder 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1,4 M NaCl og 20% glycerol. Tøm indholdet af kammeret på perler til at vaske dem.
Bemærk: Vask giver en endelige mængden af ~ 450 mL mængden celler og væsentligt øger høstede membran udbytter. De endelige koncentrationen er 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glycerol og 700 mM NaCl, og det primære formål med Højdeindstillelige salt koncentrationen er at adskille perifere Membranproteiner. - Spin ned cellen lysate for 15 min på 15.000 x g. Hæld supernatanten i polycarbonat flasker og spin for 1 h på 135.000 x g i en ultracentrifuge at indsamle membraner.
Bemærk: Hvis en ultracentrifuge ikke er tilgængelig, membraner kan blive indsamlet af spinning for 3 h på 53.000 x g, en kraft, der er opnåelige i gulv model centrifuger. - Supernatanten og vejer flasker med membran pellets. Resuspend membran træpiller i ca 35 mL membran resuspension buffer indeholdende 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, og 10% glycerol og tilføje til et glas douncer. Veje de tomme centrifugeglas for at bestemme massen af membraner høstet.
Bemærk: I en effektiv membran høst, vil vægten af membraner være lig med ca. 20% vægten af celler anvendes til at membran høst. Denne protokol giver typisk celle udbytter på 40-45 g, og dermed vi ligeledes forvente et udbytte på 8-9 g membraner. - Dounce homogeniseres membraner og alikvot i 50 mL konisk rør, som nu opbevares på ubestemt tid ved-80 ° C.
Bemærk: For dette eksperiment, typisk to delprøver er lavet, at tillade to separate protein purifications skal udføres fra en oprindelige celle forberedelse.
4. oploesning og oprensning af proteiner
- Et bægerglas tilføje en røre bar og 150 mg af n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (Bettinas) pr. g membran bliver brugt. Holde protein på isen eller ved 4 ° C på alle tidspunkter.
Bemærk: Bettinas er hygroskopisk og bør opbevares i et glaskrukke med tørremiddel ved-20 ° C når den ikke er i brug. Det er også typisk bruge mellem 4-5 g af membraner i et renseanlæg til at opnå en mærkbar mængde ren protein. - Tø membraner og bringe til en endelige mængden af 15 mL pr. g membran i membranen resuspension buffer suppleret med 1 mM PMSF og 20 mM imidazol pH 8,0. Tilføj membraner til bægerglasset med Bettinas og rør i 1 time ved 4 ° C.
Bemærk: Bettinas koncentration vil være 1% w/v, men for oploesning af membranproteiner er det mere afgørende at være opmærksom på massen af rengøringsmiddel tilsat pr g membran. - Spin i 25 min. på 135.000 x g ved 4 ° C til pellet ikke solubilized materiale. Supernatanten filtreres på et 5 µm sprøjte filter.
- Belastning af den peristaltiske pumpe Eksempelsæt til gennemstrømning af 1 mL/min. en 1 mL immobiliseret nikkel affinitet kolonne ekvilibreres i 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 20 mM imidazol pH 8.0 og 0,05% Bettinas.
Bemærk: For lavere udtrykker proteiner, forbedret renhed og udbyttet blev observeret ved hjælp af en 1 mL i stedet for 5 mL kolonne og nikkel i stedet for kobolt ioner til affinitet kromatografi. - Kolonnen udvaskes med 10 kolonne bind af en wash buffer indeholdende 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 80 mM imidazol pH 8.0 og 0,05% Bettinas.
Bemærk: Imidazol koncentration, der kan bruges under vask for en 10-hans-mærkede protein er højere end almindeligt værdsat og resulterer i forbedret renhed. - Elueres protein i bufferen indeholder 20 mM Tris pH 7,0, 200 mM NaCl, 10% glycerol, 300 mM imidazol pH 8.0 og 0,05% Bettinas. Eluatet opsamles i ti 1 mL fraktioner og køre på en 4-20% Tris-glycin SDS-PAGE gel sammen med solubilized lysate og vask fraktioner.
- Pool peak fraktioner, normalt omkring 5-6 mL og koncentrat til 500 µL eller mindre volumen i en 50 kDa skæringsdatoen koncentrator i en benchtop centrifuge nedkølet ved 4 ° C.
Bemærk: 500 µL er en typisk maksimale volumen injiceres størrelse udstødelse kromatografi (SEC) kolonner. På dette tidspunkt proteinet kan opbevares på ubestemt tid ved-80 ° C eller Fortsæt på sek. - Filtrer protein gennem en 0,2 µm spin kolonnefilter og injicere en størrelse udstødelse kolonne (f.eks. Superdex-200) ekvilibreres i S200 buffer: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glycerol og 0,03% Bettinas.
Bemærk: For de efterfølgende glutaraldehyd cross-linking assay, bufferkapacitet agenten må ikke indeholde en primær Amin. SEKUND er en mulighed for at udveksle buffere eventuelt som gjort her, når de udveksler Tris om markedsøkonomisk status. - Køre peak fraktioner på en 4-20% Tris-glycin SDS-PAGE gel. Pletten gel, indsamle ren peak fraktioner, og koncentrere sig i en 50 kDa-cutoff koncentrator ved 4 ° C.
- Bestemme proteinkoncentration ved måling af absorbans ved en bølgelængde på 280 nm, og opbevares på ubestemt tid ved-80 ° C.
5. glutaraldehyd Cross-linking Assay
- Forberede en 10 µL reaktion ved at blande 3 µL af 0,5 mg/mL protein i S200 buffer, 5 µL af S200 buffer, 1 µL af enten vand eller 20% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS), efterfulgt af 1 µL af 1,5% glutaraldehyd.
Bemærk: Dette vil give en 1 x reaktion på 0,15 mg/mL protein og 0,15% glutaraldehyd. Prøver, der indeholder en forbehandling af SDS bør er vigtige negative kontroller og blandes og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min før du tilføjer glutaraldehyd. - Inkuber reaktion i 30 min. ved stuetemperatur. Opsige reaktionen ved at tilføje 5 µl af 3 x SDS-PAGE gel ladning farvestof, der indeholder et overskud af Tris buffer, der slukker glutaraldehyd.
- Indlæse alle 15 µL på 4-20% Tris-glycin SDS-PAGE gel, der vil indlæse 1,5 µg protein pr. vognbane. Kør gelen på 200 V i 30 min. pletten og bestemme omfanget af dimer cross-linking af bevis for et band, der kører på to gange størrelsen af den denaturerede monomer.
Bemærk: En glutaraldehyd titrering og tidsforløb kan udføres først for at finde de bedste betingelser for en homomeric transporter.
Representative Results
Typiske gels til de eluted fraktioner fra udfører nikkel affinitet kromatografi Vis alle tre proteiner delvis renset (fig. 1A). Til højre for stigen er den lysate, som i hvert tilfælde viser ikke en signifikant band svarende til Borat transportøren, som er typisk for proteiner, der ikke overexpress godt. 80 mM vask lane viser minimalt tab af 10-hans-mærkede protein trods den relativt høje imidazol koncentration. Bands svarende til Borat transportvirksomheder er umiddelbart indlysende i elueret fraktioner, og fraktioner, der anses for at indeholde hovedparten af det eluted protein er koncentreret før injektion på kolonnen S200 gel filtrering. På dette stadium, er proteiner utilstrækkeligt renset for mange downstream applikationer, som angivet af ekstra bands i en koncentreret prøve før injektion på kolonnen S200 (figur 1B). Indsprøjte Stikprøvens størrelse udstødelse kolonne viser imidlertid elueret brøkdele af høj renhed (figur 1B-C). Kromatogrammer og deres tilsvarende geler for hver af Borat transportvirksomheder præsenteres. Trods den moderate renhed af prøver ved eluering fra affinitet kromatografi er proteinet meget ren ved eluering fra kolonnen gel filtrering. Kritisk, afsløre kromatogrammer hvert protein til at overflytte primært som en enkelt monodisperse peak med lidt protein bevaret i dødvolumen. En stabil og foldede protein giver generelt en monodisperse og symmetrisk peak, mens ustabile, fejlfoldede eller aggregerede protein vil normalt give enten flere asymmetriske toppe eller et stort højdepunkt i dødvolumen. Det er typisk at opnå en endelig udbyttet af ca 2 mg renset protein pr. L af gær kultur for ScBor1, og ca 1 mg hver renset AtBor1 og OsBor3 pr. L kultur. Disse tal er mængden af protein renset fra en alikvot af 4-5 g af membraner, der stammer fra den ene halvdel af vores oprindelige celle forberedelse.
Den tværbindingsmidler eksperiment viser, at renset homomeric transportvirksomheder kan have deres forsamling i løsning umiddelbart vurderet (figur 2). Formålet med de prøver, der indeholder en forbehandling af SDS er at vise at danne tvaerbindinger er afhængig af en foldet tilstand i løsning og at danne tvaerbindinger derfor ikke opstår, når multimerization er forstyrret af en barsk vaskemiddel. De viste resultater skelne, at en af de tre Borat transportvirksomheder, ScBor1, ikke er dimerized når renset i Bettinas i disse betingelser, mens de andre to, AtBor1 og OsBor3, krydse-link og vise dimerization. Det er muligt at se, at ikke alle protein kan krydse-link. I dette eksempel er spormængder af OsBor3 monomer synlige, mens AtBor1 cross-links til færdiggørelse. Omfanget af cross-linking vil afhænge af antallet af lysin restkoncentrationer i nærhed af hinanden, og det er muligt, at andre tværbindingsmidler reagenser effektivt kan krydse-link forskellige Membranproteiner.
Figur 1 . Nikkel affinitet og størrelse udstødelse kromatografi rensning for tre Borat transportvirksomheder. Hver lodret panel (A), (B), og (C) indeholder data for ScBor1, AtBor1 og OsBor3. (A) nikkel affinitet kolonne. M er en stige af molekylvægt markører med vægte i kDa angivet til venstre. L er den rå lysate, og W er 80 mM imidazol vask. Alle andre nummererede baner svarer til 1 mL fraktioner elueret med 300 mM imidazol. Bjælker over fraktioner angiver, som blev udvalgt til at blive kombineret og koncentreret for injektioner på kolonnen. (B) P angiver koncentreret protein før injektion på kolonnen S200. Elueret sek fraktioner er til højre, med kantede parenteser bruges til at matche gel baner med deres kromatogrammet fraktioner i (C). Dødvolumen er lige efter 8 mL. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Cross-Linking assay vurderer renset transportvirksomheder for multimeriske forsamling. En stige med Molekylær vægt er angivet til venstre. Først og fremmest andre baner er vist hvilke protein er til stede og om stikprøven har haft glutaraldehyd tilføjet eller en forbehandling af SDS før glutaraldehyd tilsætning. Pilene angiver monomere og dimer holdninger til AtBor1 og OsBor3. ScBor1 er et mindre protein end AtBor1 og OsBor3 og kører som forventet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her har vi delt detaljerede protokoller, der resulterer i renseanlæg til homogenitet af tre særskilte eukaryote Borat transportvirksomheder. Protokollerne præsenteres her er afledt af andre protokoller for udtryk for integreret Membranproteiner i S. cerevisiae1,14, og vores optimeringer resultat i både forbedret renhed og forbedrede udbytter. Parametrene optimeret her omfatter celle kultur vækst diskenheder og gange, perle-slå lysis procedurer, buffer sammensætning under celle lysis og protein oprensning, mængden af vaskemiddel anvendes pr. gram membran, metal ion identificere i affinitet renseanlæg, volumen af kolonnen affinitet og gennemførelsen af en tværbindingsmidler analyse til at vurdere homolog og vaskemiddel egnet ved at vurdere tilstanden multimeriske af oligomere transportvirksomheder. Protokollerne er vellykket for flere SLC4 homologs fra planter og svampe arter. En begrænsning af alle strategier til rensning af integreret Membranproteiner findes ingen universel membran protein oprensning metode, der er garanteret til at arbejde. Det er muligt, at vores protokoller er mere tilbøjelige til at blive en succes for proteiner tættere i sekvens identitet og struktur til SLC4 transportvirksomheder, og dermed medlemmer af SLC4, SLC23 og SLC26 familierne kunne være lovende mål15. Ligeledes, den mere evolutionært fjernt fra Borat transportvirksomheder en membran transporter kan være, jo mere sandsynligt protokollen skal være anderledes, såsom ved at variere ekspressionssystem, vaskemiddel eller andre vigtige parametre4.
Protokollen tager fordel af de mest almindeligt anvendte affinitet tag i protein oprensning, hans-tag. På trods af tilstedeværelsen af urenheder i de indledende eluted brøker, kombinationer af nikkel affinitet, omfattende vask og efterfølgende sek rensning resulterer i den højt oprenset protein. En 10-hans-tag giver mulighed for strengere imidazol vasker og således kan fjerne flere baggrund bindende proteiner end kan fjernes i vasker tilladt af 8-hans - eller 6-hans-tags. Vores valg for ren fraktioner fejle på den konservative side af de de fleste meget ren gel fraktioner, som svarer til peak sek fraktioner. Endelige protein udbyttet kan øges ved at samle og koncentrere flere fraktioner, omend med trade-off af lidt mindre ren protein. De metoder, der præsenteres her aktiveret rensning af AtBor1 i mængder, der førte til bestemmelse af sin krystal struktur7, med rensning forskelle består af afskære hans-tag og udveksle transportvirksomheden i en anden vaskemiddel for at forbedre krystal diffraktion7.
Vores protokol rejser vigtige overvejelser for valg af homologs og vaskemiddel bruges til solubilize og rense dem. Bettinas er et fælles første valg for vaskemiddel, fordi det er relativt mild, ofte succes på solubilizing, og har været anvendt i strukturelle og funktionelle studier af en lang række Membranproteiner. Ved afgørelsen af, om vaske-og rengøringsmidler er et dårligt valg for en membran, er en fælles metode for vurdering om protein giver et enkelt monodisperse højdepunkt på et sekund kromatogram, snarere end et stort højdepunkt i dødvolumen eller et interval af polydisperse toppe, som angive fejlfoldede eller ustabil protein. En mere subtil overvejelse er rejst af vores rensning af ScBor1. Det renser i store mængder og ser gunstige og monodisperse på et sekund kromatogram, hvilket tyder på, det kunne være et attraktivt mål for strukturelle undersøgelser. Vores tværbindingsmidler analyse viser imidlertid, at det er en monomer når renset. Mens det er muligt at ScBor1 indbygget kunne eksistere som en monomer i cellen, tyder undersøgelser på, at SLC4 transportører og deres homologs er tilbøjelige til at være dimerer7,8,9,10. Vores udvikling af den tværbindingsmidler analyse opstod efter crystallizing og løse strukturen af AtBor1. Dog havde vi været mulighed for at vurdere ScBor1 i forhold til AtBor1 med den tværbindingsmidler analyse, værdifuld tid og forskning indsats kunne er blevet omdirigeret til udøvelse af AtBor1 i stedet for ScBor1, hvor sidstnævnte i sidste ende ikke lykkedes i krystallisering og diffraktion eksperimenter. Denne analyse kan således hjælpe forskerne med at skelne mellem enten homologs eller rengøringsmidler til brug når forfølger strukturelle undersøgelser for at prioritere betingelser, hvor proteinet bevarer sin mistanke om indfødte kropsbygning. Analysen kan desuden være bruges at sonde hvor aminosyrer er afgørende for multimerization, for at finde aminosyre udskiftninger, at destabilisere multimerization grænseflade og føre til forpligter monomerer. En sådan fremgangsmåde har været anvendt til sonde funktionelle betydningen af homomeric forsamling i membranen transportvirksomheder16,17,18.
En generel fordel ved vores metode er, at gær har vist sig at give udtryk for mange udfordrende Membranproteiner af forskellige funktion1. Derudover fremme dens lave omkostninger og vækst gange dens tilgængelighed for mange forskningsindsats, der kan være mindre i stand til at bruge udtryk strategier, der kræver vævskultur eller dyre vækst medier. De procedurer, der præsenteres her er forholdsvis billig og kan udføres i én uge, hvilket understreger mulighederne for metoden. Gennemførelsen af disse protokoller kan hjælpe aktiverer strukturelle og funktionelle studier af andre udfordrende Membranproteiner.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af startup midler på Davidson College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).
- Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
