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方法文章

一种黑色素瘤患者来源的异种移植模型

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DOI：

10.3791/59508

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2019年5月20日

 ,  , 
1Wistar Institute

本文内容

摘要

与传统的基于塑料培养皿的组织培养检测方法相比，患者来源的异种移植（PDX）模型能更可靠地再现黑色素瘤的分子和生物学特征，并能更准确地预测治疗反应。本文介绍了我们建立新型 PDX 模型以及对已有 PDX 模型进行表征和实验研究的标准操作流程。

摘要

越来越多的证据表明，在传统的二维组织培养容器中培养的黑色素瘤细胞与在人体患者体内生长的黑色素瘤细胞在分子和生物学特性上存在差异。这是因为在缺乏生理条件的情况下，只有能够稳健生长的黑色素瘤细胞克隆群体才会被筛选出来，形成培养细胞系，从而导致了瓶颈式的选择。此外，二维组织培养中的治疗反应总体上不能真实反映黑色素瘤患者体内的治疗反应，大多数临床试验未能证实那些在体外显示有效的治疗组合的实际疗效。尽管将黑色素瘤细胞移植到小鼠体内可提供二维组织培养所缺乏的生理体内环境，但用于移植的黑色素瘤细胞在细胞系建立过程中已经历了适应二维培养条件的瓶颈筛选。由于这种瓶颈效应所导致的不可逆改变包括细胞生长和侵袭特性的变化，以及特定亚群的丢失。因此，能够更准确模拟人体体内状况的模型可能更有效地预测可提高转移性黑色素瘤患者总体生存率的治疗策略。患者来源的异种移植（PDX）技术涉及将来自患者的肿瘤细胞直接植入小鼠受体中。通过这种方式，肿瘤细胞持续在体内生理压力条件下生长，从未经历二维培养的瓶颈过程，从而保留了肿瘤在患者体内时所具有的分子和生物学特性。值得注意的是，来源于转移灶器官部位（例如脑）的PDX模型表现出相似的转移能力，而来源于未经治疗患者以及对治疗产生获得性耐药患者（例如BRAF/MEK抑制剂治疗）的PDX模型则表现出与原发患者相似的治疗敏感性。

引言

临床前模型对于转化癌症研究的各个方面都至关重要，包括疾病特征的刻画、发现癌细胞相对于正常细胞所特有的可靶向弱点，以及开发能够利用这些弱点来提高患者总体生存率的有效疗法。在黑色素瘤研究领域，数以万计的细胞系模型已被广泛用于药物筛选， >仅我们课题组贡献的细胞系就达4,000株（WMXXX系列）。这些细胞系模型来源于患有不同类型皮肤黑色素瘤（如肢端型、葡萄膜型和浅表扩散型）且具有不同基因型的黑色素瘤患者。 BRAFV600-突变体和神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物 [NRASQ61R-突变体]，涵盖了临床中疾病表现的全部范围1,2.

毫无疑问，黑色素瘤领域最成功的靶向治疗策略源于以下两个方面：1）对患者肿瘤进行基因组学表征，发现约50%的黑色素瘤存在BRAF突变3；以及2）利用黑色素瘤细胞系模型开展的临床前研究4。BRAF抑制剂与MEK抑制剂的联合疗法已于2014年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗携带激活型BRAFV600E/K突变的黑色素瘤患者，其治疗反应率超过>75%5。尽管初始疗效显著，但由于多种内在和获得性耐药机制以及肿瘤内异质性的存在，几乎所有病例都会迅速产生耐药性。遗憾的是，当细胞系在塑料器皿中进行二维培养时，无法重现具有代表性的生物学异质性，这使得研究者在尝试通过实验确定可能对特定类型或基因型黑色素瘤患者有效的治疗方法时，难以充分挖掘其临床预测潜力6。深入理解如何最佳地模拟患者肿瘤内的异质性，将有助于研究者更好地开发出能够清除耐药亚群的治疗手段，从而克服当前标准治疗方案的失败问题。

细胞系模型预测价值有限，其关键在于模型的初始建立方式。当将患者肿瘤的单细胞悬液在二维塑料培养器皿上进行培养时，肿瘤克隆格局会发生不可逆的改变，包括增殖和侵袭潜能的变化、特定亚群的消失以及遗传信息的改变7。将这些黑色素瘤细胞系模型移植至小鼠体内，是目前最常用的临床前体内研究平台；然而，该策略同样难以充分再现临床上所观察到的复杂肿瘤异质性。为克服这一局限，人们日益关注引入更为复杂的黑色素瘤临床前模型，包括人源肿瘤异种移植（PDX）模型。PDX模型的应用已有>30年历史，早期在肺癌患者中的关键研究表明，患者对细胞毒性药物的反应与其来源PDX模型的反应具有一致性8。近年来，工业界和学术机构均越来越倾向于将PDX模型作为临床前研究的首选工具。由于PDX模型在再现人类患者肿瘤异质性方面具有更优的表现，因此在治疗方案优化研究中，其临床相关性高于细胞系异种移植模型9。在黑色素瘤领域，晚期疾病治疗面临巨大挑战10。具有临床相关性的PDX模型已被用于模拟临床耐药现象，并利用临床上可用的药物识别针对耐药性肿瘤的治疗策略11,12。简而言之，本文所述建立PDX模型的方案，需将原发性或转移性黑色素瘤的新鲜组织（通过活检或手术获取）皮下植入NOD/scid/IL2-受体缺失（NSG）小鼠体内。不同研究团队在方法学上存在多种变体，但其基本核心步骤具有一致性13。

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方案

以下动物实验方案遵循美国Wistar研究所的人道伦理委员会及动物护理指南的规定。

1. 黑色素瘤肿瘤组织采集

  1. 通过以下手术或活检方法之一，从黑色素瘤患者中采集肿瘤组织（称为第0代）。
    1. 对于手术切除组织，将至少1克组织（切除的转移灶和原发灶）置于运输保存液（RPMI 1640 + 0.1% fungizone + 0.2% gentamicin）中，于4 °C或冰上保存。
    2. 对于手术活检组织，将少于1 g的组织（通常为皮下[ s.c. ]转移灶和淋巴结[ LN ]转移灶的钻孔活检样本）置于运输保存液中，在4 °C或冰上保存。
    3. 对于穿刺活检组织，将长约10 mm、直径约1 mm的圆柱形组织（常见为肝穿刺活检）冲洗至含有5 mL运输保存液的15 mL离心管中，置于4 °C或冰上保存。
    4. 对于细针穿刺抽吸（FNA）组织，保持  从患者体内直接采集的极少量组织（大小小于1 mm），使用针管和注射器在4 °C或冰上保存。
  2. 手术切除或活检后，应将组织置于运输保存液中，于4 °C或冰上保存，并在当天或通过隔夜快递运送。组织送达后应在1-2小时内进行处理。

2. 用于小鼠移植的肿瘤组织处理

  1. 手术切除或手术活检组织处理
    1. 将组织转移至无菌培养皿中，并尽可能将肿瘤组织与周围正常组织分离。
    2. 尽可能去除剩余肿瘤中的坏死组织（通常为位于肿瘤中心区域的苍白白色组织）。
    3. 使用手术刀将初始肿瘤组织块分割成大小相近的片段（约 3 mm × 3 mm），用于小鼠手术移植图2).
    4. 可选地，若肿瘤组织量充足，可将组织速冻，用于后续检测（RNA测序[RNASeq]、全外显子组测序[WES]等）。
    5. 使用两把手术刀片采用交叉刀片法将肿瘤组织切碎，制成肿瘤匀浆。尽可能将肿瘤组织切碎至形成匀浆状，此匀浆即可用于小鼠手术植入。
    6. 或者，如果肿瘤组织过于坚硬而无法进行机械解离，可采用消化解离法将其处理成凝胶状悬液及单细胞悬液，用于移植和/或注射。
      1. 将肿瘤组织块尽可能切碎，形成匀浆。
      2. 将匀浆液放入含有冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的50 mL离心管中-/- （不含 Ca）++ 和 Mg++）；然后，以 220 x g 离心并收集沉淀 g 4 °C 下离心 4 分钟。
      3. 将悬液重悬于10 mL预热的新鲜消化液（200 U/mL胶原酶IV + 5 mM CaCl₂）中2 + 50 U/mL DNase 溶于 HBSS-/-每克肿瘤组织。
      4. 将试管置于37 °C水浴中20分钟，每隔5分钟用一次性移液管剧烈混匀。
      5. 用最多 50 mL HBSS 洗涤-/-；然后，在220 x g 4 °C 下离心 4 分钟。
      6. 每1 g肿瘤组织加入5 mL预热的TEG（含0.025%胰蛋白酶 + 40 µg/mL乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸[EGTA] + 10 µg/mL聚乙烯醇[PVA]），轻轻重悬或振荡，将离心管置于37 °C孵育2 min，期间不混合。
      7. 加入至少等体积的冷染色液（1% 牛血清白蛋白 [BSA] + 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 [HEPES] + 1× 青霉素-链霉素，溶于 L15 培养基中）以终止胰蛋白酶消化作用，随后在 220 × g 条件下离心 g 4 °C 下离心 4 分钟。
      8. 将样品用每克肿瘤组织10 mL染色液重悬，并通过40 µm细胞滤网过滤，以获得用于小鼠注射的单细胞悬液（图2).
      9. 细胞滤筛上方残留的匀浆也可收集用于小鼠手术移植。
  2. C骨组织活检样本处理
    1. 将组织运输管中的核心圆柱形组织倒入5 cm培养皿中。
    2. 去除多余液体，将组织刮至培养皿边缘，仔细剪碎肿瘤组织，加入约100–150 µL HBSS-/- 置于肿瘤组织上方，迅速将HBSS/肿瘤组织悬液吸入1 mL注射器中。
    3. 将23 G针头连接至1 mL注射器，将HBSS/肿瘤组织悬液通过针头注入1.5 mL离心管中。
    4. 将肿瘤悬液重新吸入注射器中，针头保持连接，直至悬液能顺利通过针头。
    5. 最后将肿瘤悬液重新吸入注射器中，并取下23 G针头。
    6. 连接27 G针头，吸取等体积（约100–150 µL）的人工细胞外基质（参见 材料表) 注入注射器中。
    7. 将等体积的人工细胞外基质缓慢加入含有肿瘤/HBSS的1.5 mL离心管中-/- 悬浮时需小心操作，避免产生气泡。
    8. 再次将组织抽入注射器，此时穿刺活检获得的肿瘤组织已准备好用于小鼠注射。
  3. 细针穿刺组织处理
    1. 将含有细针穿刺样本（滞留在针头内）的注射器置于冰上。
    2. 将针头（含细针穿刺组织）与注射器分离，并从注射器中取出活塞，加入约150–200 µL HBSS-/- 注射器顶部
    3. 将活塞重新插入注射器和针头（含细针穿刺组织）中，并推出HBSS-/- 通过针头将样本注入1.5 mL离心管中。此步骤可将细针穿刺获取的肿瘤组织从针管中取出。
    4. 用 HBSS 重复步骤 2.3.3-/-用同一注射器将细针穿刺液悬浮液反复抽吸两次，以最大程度地从针头中回收肿瘤组织。
    5. 向含有HBSS/FNA悬液的1.5 mL离心管中加入等体积（约100–150 µL）的人工细胞外基质。
    6. 通过缓慢吸取人工细胞外基质/HBSS 充分混匀-/-将FNA悬液重新吸入23 G针头，并重复两次。
    7. 绘制完整的模拟细胞外基质/HBSS-/-将FNA样本重新吸入注射器，将23 G针头更换为27 G针头，此时FNA样本已准备好用于小鼠注射。

3. 小鼠肿瘤移植与注射

  1. 手术切除或手术活检组织的移植
    注意：确保所有外科器械通过高压灭菌或使用预先灭菌的一次性器械达到无菌状态。
    1. 剃除6-8周龄NSG雄性或雌性小鼠背部下方的毛发，保留约1.5 cm × 3 cm的无毛区域。使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过轻捏足部以检测反应性来确认麻醉效果。在小鼠眼睛上涂抹兽医用眼膏，防止角膜干燥。
    2. 将每只小鼠置于麻醉机鼻罩内的加热垫上，用氯己定擦拭剃毛区域，随后用70%乙醇充分浸润并使其自然挥发。
    3. 在培养皿中将肿瘤组织块分割成若干独立的小团块，用于外科移植（例如，若需移植至3只小鼠，则分为三个相等的团块）。
    4. 使用手术刀片在小鼠背部中央做一长约5 mm的切口，取一把镊子将切口对侧（操作者对侧）的皮肤轻轻提起。
    5. 另一手持剪刀，通过小幅度剪切筋膜层，将皮肤与肌肉层分离，从而形成一个"囊袋"，用于放置肿瘤组织。
    6. 用手术刀片挑取一个肿瘤组织块或一个独立的肿瘤团块，轻柔地将其置入已形成的囊袋中。
    7. 向囊袋内的肿瘤团块上注入100 µL人工细胞外基质。
    8. 使用两把镊子从切口两端将切口拉拢，使伤口边缘紧密贴合，并使用一到两个伤口夹闭合伤口。
    9. 术后对小鼠皮下注射1–5 mg/kg的美洛昔康作为镇痛剂。
    10. 将小鼠从鼻罩中取出，放回原笼中，并在苏醒期间持续观察。直至完全恢复意识前，不得将其与其他小鼠合笼。
    11. 约7天后拆除伤口夹。若7天后伤口仍未完全愈合，可将伤口夹保留额外一至两天。
      注意：若使用来自手术切除或手术活检组织处理后的单细胞悬液，则需将其与人工细胞外基质按1:1比例混合后用于小鼠注射。
  2. FNA或穿刺活检组织的注射
    1. 将NSG小鼠置于金属网格架上，用手牢固抓住其尾巴并轻柔向后拉，使其前肢牢固抓住网格。或者，用非优势手固定小鼠，使其侧腹区域暴露可见。
    2. 用酒精棉片对侧腹部皮肤进行消毒，缓慢而稳定地将注射器内容物注入小鼠皮下。
    3. 拔出针头，将小鼠放回笼中。

4. 监测肿瘤生长

  1. 每周监测小鼠一次，检查是否有可触及的肿瘤。
  2. 当肿瘤达到可测量的大小（约 50 mm3）时，使用游标卡尺记录肿瘤尺寸。使用以下公式计算肿瘤体积：(宽度 × 宽度 × 长度) / 2。
  3. 当肿瘤体积达到约 1.5 cm3 时（大约 4–10 周），收获肿瘤。此时的肿瘤称为小鼠传代 1 代（MP1）。

5. 收集肿瘤用于组织保藏、再移植及实验/表征

  1. 将小鼠置于 CO2 室内实施安乐死，检查生命体征以确认死亡，随后在生物安全柜中将小鼠浸入 Virkon 溶液中消毒皮肤 30 秒。
  2. 使用弯头剪刀和外科镊子提起肿瘤附近的皮肤，并作横向切口。
  3. 采用钝性分离技术，将肿瘤两侧及上方的皮肤游离，暴露肿瘤。
  4. 使用剪刀或手术刀片将肿瘤从筋膜上分离。
  5. 切除肿瘤并将其转移至无菌培养皿中，将肿瘤切成小块，并去除肿瘤中的坏死组织。
  6. 保存肿瘤组织以备将来移植使用。
    1. 取 2–3 块大小小于约 10 mm × 10 mm 的小肿瘤组织，将其剪切成小于约 1 mm × 1 mm 的碎块。
    2. 将所有剪碎的组织转移至一个 2 mL 冻存管中，加入 1 mL 冷冻保存液（10% DMSO + 90% FBS）。
    3. 充分混匀后，将冻存管放入预冷的异丙醇冻存盒中，并置于干冰上。
    4. 将冻存盒在 -80 °C 超低温冰箱中过夜保存，随后将冻存管转移至液氮（LN2）中长期保存。
  7. 快速冷冻组织用于后续分析（如 RNA 测序、全外显子组测序等）。
    1. 将肿瘤组织块（约 3 mm × 3 mm）放入冻存管中，并立即置于液氮（LN2）中。随后将冻存管保存于 -80 °C 超低温冰箱中。

6. PDX 治疗试验

注意：需要经过两个扩增阶段才能培养出足够的肿瘤组织，以生成治疗试验所需的足够数量的PDX荷瘤小鼠。

  1. 从液氮（LN2）中取出一支含有冻存PDX组织的冻存管，将其放入37 °C水浴中，直至含肿瘤组织的冻存液开始融化。
  2. 将冻存管中的内容物转移至预热的50 mL离心管中的HBSS-/-中，并清洗组织。
  3. 以1,200 rpm离心5分钟，使组织沉淀。
  4. 使用巴斯德吸管通过真空抽吸法去除肿瘤样本中的HBSS-/-。
  5. 将PDX组织从50 mL离心管转移至5 cm或10 cm的培养皿中，并置于湿冰上。
  6. 按照上述移植方案，将冻存管中的组织移植至5只NSG小鼠体内，进行第一轮PDX肿瘤扩增。
  7. 当肿瘤体积达到约600–800 mm3时，收获1-2个肿瘤，按照上述肿瘤组织处理方案（机械解离和胶原酶消化解离程序）制备单细胞悬液。
  8. 离心收集细胞并重悬于6 mL HBSS-/-/人工细胞外基质（1:1比例）中，每只小鼠皮下注射100 µL细胞混合液，共注射约50只NSG小鼠，进行第二轮PDX肿瘤扩增。
  9. 每两周使用游标卡尺测量一次肿瘤大小。
  10. 等待3-5周，当肿瘤体积达到约100 mm3时，将小鼠随机分组并开始治疗。
  11. 当肿瘤体积达到IACUC批准的最大容积时，停止治疗。
  12. 按照上述收获肿瘤方案，收集速冻肿瘤组织块及用于石蜡包埋的肿瘤组织块。

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结果

用于黑色素瘤PDX模型的肿瘤组织可来源于多种不同来源，也可根据各个模型的生长动态及PDX组织的预期用途进行相应处理。建立PDX模型时的首要任务是储备足够的组织材料以供未来使用，并保存用于表征分析的DNA（图1）。

在储存了足够的材料后，可通过三种主要方法之一扩增肿瘤组织，以获得足够的肿瘤量来进行正式的治疗研究（图2A）。本文所述的每种方法均可实现来自PDX的肿瘤扩增（图2B）。根据我们的经验，使用酶消化法（胶原酶IV）将肿瘤组织制备成单细胞悬液，可实现更快的肿瘤生长，并能将一个初始肿瘤扩增至10–20只小鼠，而肿瘤组织块或匀浆法通常只能扩增至5–10只小鼠（图2C）。正如其他肿瘤类型中已证实的那样，黑色素瘤PDX模型通常能够反映患者在接受治疗时所...

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讨论

本文描述了利用来自原发性和转移性肿瘤、穿刺活检组织以及细针穿刺抽吸物（FNA）的患者组织建立黑色素瘤的PDX模型。当直接移植到NSG小鼠体内时，这些肿瘤表现出与患者体内相似的形态学、基因组学和生物学特性。当研究人员可获得的组织量较少时（如FNA样本中常见的情况），PDX技术可用于扩增肿瘤组织，以便进行DNA、RNA和蛋白质的表征，并可用于治疗试验，从而推动临床前药物开发。

PDX移植成功的关键在于研究者起始所用材料的质量。在第1和第2部分中，必须尽可能确保肿瘤组织得到适当保存。重要的是，PDX黑色素瘤模型对治疗的反应能更好地模拟供体患者的敏感性，从而为开展稳健的临床前研究提供支持，以开发更优的治疗策略，克服治疗耐药性并提高疗效的持久性。大多数转移性黑色素瘤患者无法通过现有的标准治疗（SOC）实现治愈5。我们的PDX黑色素瘤模型库包含超过500个不同的模型，其中包括来自靶向治疗和免疫治疗后复发患者的模型1,2。该资源对于...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Wistar研究所动物设施、显微成像设施、组织技术设施和研究中心供应中心。本研究部分由以下基金资助：U54（CA224070-01）、SPORE（CA174523）、P01（CA114046-07）、Miriam和Sheldon G. Adelson医学研究基金会以及黑色素瘤研究基金会。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M HepesSIGMA-ALDRICH CORPORATIONCat # H0887-100ML
100x 青霉素-链霉素溶液（PenStrep） InvitrogenCat # 15140163
1x HBSS-/-（不含 Ca++ 或 Mg++）MEDCat # MT21-023-CV
2.5% 胰蛋白酶（Trypsin） SIGMA-ALDRICH CORPORATIONCat # T4549-100ML分装为 10 mL 份量，于 –20°C 保存
牛血清白蛋白（BSA）SIGMA-ALDRICH CORPORATIONCat # A9418-500G
氯己定（Chlorhexidine）菲舍尔科技（Fisher Scientific）Cat# 50-118-0313
IV 型胶原酶（Collagenase IV，2,000 u/mL）沃辛顿（Worthington） Cat #4189用 HBSS-/- 配制，原料为 IV 型胶原酶粉末（Worthington #4189，每毫克单位数见瓶身标注，随批次变化）；分装后冻存
二甲基亚砜（DMSO）SIGMA-ALDRICH CORPORATIONCat # C6295-50ML
脱氧核糖核酸酶（DNase）SIGMA-ALDRICH CORPORATIONCat # D4527
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid）默克（Merck）Cat # 324626.25
胎牛血清（FBS）英潍捷基生命技术公司（INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES）Cat # 16000-044
两性霉素 B（Fungizone）英潍捷基生命技术公司（INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES）Cat # 15290-018
庆大霉素（Gentamicin）菲舍尔科技（FISHER SCIENTIFIC）Cat # BW17518Z
异氟烷（Isoflurane）亨利·谢恩动物健康公司（HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH）Cat # 050031
Leibovitz L15 培养基 InvitrogenCat # 21083027
Matrigel康宁公司（Corning）Cat # 354230人工细胞外基质
美洛昔康（Meloxicam）亨利·谢恩动物健康公司（HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH）采购编号 ::Henry ScheinCat # 025115剂量 1–5 mg/kg，用作镇痛药
NOD/SCID/IL2 受体缺陷型（NSG）小鼠威斯塔研究所动物设施（The Wistar Institute, animal facility）用于繁殖
聚乙烯醇（PVA，polyvinyl alcohol）SIGMA-ALDRICH CORPORATIONCat # P8136-250G
RPMI 1640 培养基（改良型，1×，含 L-谷氨酰胺）菲舍尔科技（Fisher Scientific）Cat# MT10041CM
手术刀片FeatherCat # 2976-22
卫可消毒剂（Virkon）加拉德-施莱辛格工业公司（GALLARD-SCHLESINGER IND）Cat # 222-01-06
伤口夹MikRonCat #427631

参考文献

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