与传统的基于塑料培养皿的组织培养检测方法相比，患者来源的异种移植（PDX）模型能更可靠地再现黑色素瘤的分子和生物学特征，并能更准确地预测治疗反应。本文介绍了我们建立新型 PDX 模型以及对已有 PDX 模型进行表征和实验研究的标准操作流程。
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摘要
摘要
越来越多的证据表明，在传统的二维组织培养容器中培养的黑色素瘤细胞与在人体患者体内生长的黑色素瘤细胞在分子和生物学特性上存在差异。这是因为在缺乏生理条件的情况下，只有能够稳健生长的黑色素瘤细胞克隆群体才会被筛选出来，形成培养细胞系，从而导致了瓶颈式的选择。此外，二维组织培养中的治疗反应总体上不能真实反映黑色素瘤患者体内的治疗反应，大多数临床试验未能证实那些在体外显示有效的治疗组合的实际疗效。尽管将黑色素瘤细胞移植到小鼠体内可提供二维组织培养所缺乏的生理体内环境，但用于移植的黑色素瘤细胞在细胞系建立过程中已经历了适应二维培养条件的瓶颈筛选。由于这种瓶颈效应所导致的不可逆改变包括细胞生长和侵袭特性的变化，以及特定亚群的丢失。因此，能够更准确模拟人体体内状况的模型可能更有效地预测可提高转移性黑色素瘤患者总体生存率的治疗策略。患者来源的异种移植（PDX）技术涉及将来自患者的肿瘤细胞直接植入小鼠受体中。通过这种方式，肿瘤细胞持续在体内生理压力条件下生长，从未经历二维培养的瓶颈过程，从而保留了肿瘤在患者体内时所具有的分子和生物学特性。值得注意的是，来源于转移灶器官部位（例如脑）的PDX模型表现出相似的转移能力，而来源于未经治疗患者以及对治疗产生获得性耐药患者（例如BRAF/MEK抑制剂治疗）的PDX模型则表现出与原发患者相似的治疗敏感性。
引言
临床前模型对于转化癌症研究的各个方面都至关重要，包括疾病特征的刻画、发现癌细胞相对于正常细胞所特有的可靶向弱点，以及开发能够利用这些弱点来提高患者总体生存率的有效疗法。在黑色素瘤研究领域，数以万计的细胞系模型已被广泛用于药物筛选， >仅我们课题组贡献的细胞系就达4,000株（WMXXX系列）。这些细胞系模型来源于患有不同类型皮肤黑色素瘤（如肢端型、葡萄膜型和浅表扩散型）且具有不同基因型的黑色素瘤患者。 BRAFV600-突变体和神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物 [NRASQ61R-突变体]，涵盖了临床中疾病表现的全部范围1,2.
毫无疑问，黑色素瘤领域最成功的靶向治疗策略源于以下两个方面：1）对患者肿瘤进行基因组学表征，发现约50%的黑色素瘤存在BRAF突变3；以及2）利用黑色素瘤细胞系模型开展的临床前研究4。BRAF抑制剂与MEK抑制剂的联合疗法已于2014年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗携带激活型BRAFV600E/K突变的黑色素瘤患者，其治疗反应率超过>75%
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方案
以下动物实验方案遵循美国Wistar研究所的人道伦理委员会及动物护理指南的规定。
1. 黑色素瘤肿瘤组织采集
- 通过以下手术或活检方法之一，从黑色素瘤患者中采集肿瘤组织（称为第0代）。
- 对于手术切除组织，将至少1克组织（切除的转移灶和原发灶）置于运输保存液（RPMI 1640 + 0.1% fungizone + 0.2% gentamicin）中，于4 °C或冰上保存。
- 对于手术活检组织，将少于1 g的组织（通常为皮下[ s.c. ]转移灶和淋巴结[ LN ]转移灶的钻孔活检样本）置于运输保存液中，在4 °C或冰上保存。
- 对于穿刺活检组织，将长约10 mm、直径约1 mm的圆柱形组织（常见为肝穿刺活检）冲洗至含有5 mL运输保存液的15 mL离心管中，置于4 °C或冰上保存。
- 对于细针穿刺抽吸（FNA）组织，保持 从患者体内直接采集的极少量组织（大小小于1 mm），使用针管和注射器在4 °C或冰上保存。
- 手术切除或活检后，应将组织置于运输保存液中，于4 °C或冰上保存，并在当天或通过隔夜快递运送。组织送达后应在1-2小时内进行处理。
2. 用于小鼠移植的肿瘤组织处理
- 手术切除或手术活检组织处理
-
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结果
用于黑色素瘤PDX模型的肿瘤组织可来源于多种不同来源，也可根据各个模型的生长动态及PDX组织的预期用途进行相应处理。建立PDX模型时的首要任务是储备足够的组织材料以供未来使用，并保存用于表征分析的DNA（图1）。
在储存了足够的材料后，可通过三种主要方法之一扩增肿瘤组织，以获得足够的肿瘤量来进行正式的治疗研究（图2A）。本文所述的每种方法均可实现来自PDX的肿瘤扩增（图2B）。根据我们的经验，使用酶消化法（胶原酶IV）将肿瘤组织制备成单细胞悬液，可实现更快的肿瘤生长，并能将一个初始肿瘤扩增至10–20只小鼠，而肿瘤组织块或匀浆法通常只能扩增至5–10只小鼠（图2C）。正如其他肿瘤类型中已证实的那样，黑色素瘤PDX模型通常能够反映患者在接受治疗时所.......
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讨论
本文描述了利用来自原发性和转移性肿瘤、穿刺活检组织以及细针穿刺抽吸物（FNA）的患者组织建立黑色素瘤的PDX模型。当直接移植到NSG小鼠体内时，这些肿瘤表现出与患者体内相似的形态学、基因组学和生物学特性。当研究人员可获得的组织量较少时（如FNA样本中常见的情况），PDX技术可用于扩增肿瘤组织，以便进行DNA、RNA和蛋白质的表征，并可用于治疗试验，从而推动临床前药物开发。
PDX移植成功的关键在于研究者起始所用材料的质量。在第1和第2部分中，必须尽可能确保肿瘤组织得到适当保存。重要的是，PDX黑色素瘤模型对治疗的反应能更好地模拟供体患者的敏感性，从而为开展稳健的临床前研究提供支持，以开发更优的治疗策略，克服治疗耐药性并提高疗效的持久性。大多数转移性黑色素瘤患者无法通过现有的标准治疗（SOC）实现治愈5。我们的PDX黑色素瘤模型库包含超过500个不同的模型，其中包括来自靶向治疗和免疫治疗后复发患者的模型1,2。该资源对于.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Wistar研究所动物设施、显微成像设施、组织技术设施和研究中心供应中心。本研究部分由以下基金资助：U54（CA224070-01）、SPORE（CA174523）、P01（CA114046-07）、Miriam和Sheldon G. Adelson医学研究基金会以及黑色素瘤研究基金会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x 青霉素-链霉素溶液（PenStrep） | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/-（不含 Ca++ 或 Mg++） | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% 胰蛋白酶（Trypsin） | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 分装为 10 mL 份量，于 –20°C 保存 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| 氯己定（Chlorhexidine） | 菲舍尔科技（Fisher Scientific） | Cat# 50-118-0313 | |
| IV 型胶原酶（Collagenase IV，2,000 u/mL） | 沃辛顿（Worthington） | Cat #4189 | 用 HBSS-/- 配制，原料为 IV 型胶原酶粉末（Worthington #4189，每毫克单位数见瓶身标注，随批次变化）；分装后冻存 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| 脱氧核糖核酸酶（DNase） | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid） | 默克（Merck） | Cat # 324626.25 | |
| 胎牛血清（FBS） | 英潍捷基生命技术公司（INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES） | Cat # 16000-044 | |
| 两性霉素 B（Fungizone） | 英潍捷基生命技术公司（INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES） | Cat # 15290-018 | |
| 庆大霉素（Gentamicin） | 菲舍尔科技（FISHER SCIENTIFIC） | Cat # BW17518Z | |
| 异氟烷（Isoflurane） | 亨利·谢恩动物健康公司（HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH） | Cat # 050031 | |
| Leibovitz L15 培养基 | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | 康宁公司（Corning） | Cat # 354230 | 人工细胞外基质 |
| 美洛昔康（Meloxicam） | 亨利·谢恩动物健康公司（HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH）采购编号 ::Henry Schein | Cat # 025115 | 剂量 1–5 mg/kg，用作镇痛药 |
| NOD/SCID/IL2 受体缺陷型（NSG）小鼠 | 威斯塔研究所动物设施（The Wistar Institute, animal facility） | 用于繁殖 | |
| 聚乙烯醇（PVA，polyvinyl alcohol） | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 培养基（改良型，1×，含 L-谷氨酰胺） | 菲舍尔科技（Fisher Scientific） | Cat# MT10041CM | |
| 手术刀片 | Feather | Cat # 2976-22 | |
| 卫可消毒剂（Virkon） | 加拉德-施莱辛格工业公司（GALLARD-SCHLESINGER IND） | Cat # 222-01-06 | |
| 伤口夹 | MikRon | Cat #427631 |
参考文献
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al.
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