黑色素瘤患者衍生异种移植模型

Summary

与传统的基于塑料组织培养的检测相比,患者衍生的异种移植 (PDX) 模型更有力地概括黑色素瘤分子和生物特征,并更预测治疗反应。在这里,我们描述了我们用于建立新的 PDX 模型的标准操作协议,以及现有 PDX 模型的特征/实验。

Abstract

累积证据表明,在传统二维组织培养容器中生长的黑色素瘤细胞和人类患者体内的分子和生物特性不同。这是由于黑色素瘤细胞的克隆种群的瓶颈选择,这些细胞可以在没有生理条件的情况下在体外茁壮成长。此外,在二维组织培养中对治疗的反应总体上不能忠实地反映对黑色素瘤患者治疗的反应,大多数临床试验未能显示治疗组合的疗效,体 外。虽然将黑色素瘤细胞异种移植到小鼠体内提供了二维组织培养测定中不存在的生理在体内环境,但用于移植的黑色素瘤细胞已经经历了对可能生长在以下的细胞的瓶颈选择建立细胞系时的二维条件。瓶颈造成的不可逆转的改变包括生长和入侵特性的变化,以及特定亚种群的丧失。因此,更好地概括人体体内状况的模型可以更好地预测有效提高转移性黑色素瘤患者整体存活率的治疗策略。患者衍生的异种移植 (PDX) 技术涉及将肿瘤细胞从人类患者直接植入小鼠受体。通过这种方式,肿瘤细胞在体内的生理压力下不断生长,从不经历二维瓶颈,从而保留肿瘤在人类患者体内时存在的分子和生物特性。值得注意的是,从转移器官部位(即大脑)派生的PDX模型显示类似的转移能力,而PDX模型来自治疗天真的患者和获得治疗耐药性的患者(即BRAF/MEK抑制剂治疗)显示类似的敏感性治疗。

Introduction

临床前模型对于转化癌症研究的所有方面都至关重要,包括疾病特征、发现癌症与正常细胞特有的可操作弱点,以及开发利用有效疗法这些弱点,以增加患者的整体生存。在黑色素瘤领域,数以万计的细胞系模型被大量用于药物筛选,仅我们小组就贡献了4,000个细胞系模型(WMXXX系列)。这些细胞系模型来自黑色素瘤患者与各种形式的皮质黑色素瘤(即,腹腔,尿道和表面扩散)和不同的基因型(即,BRAF^V600-突变和神经母细胞瘤RAS病毒肿瘤同源性 |国家资源局^Q61R-突变体*),它跨越诊所1,2中存在的疾病谱。

毫不含糊地,在黑色素瘤领域最成功的,有针对性的治疗策略已经出现从1)患者肿瘤的基因组表征识别BRAF突变在+50%的黑色素瘤3和2)临床前调查利用黑色素瘤细胞系模型4.BRAF/MEK抑制剂组合是食品和药物管理局(FDA)批准在2014年用于治疗患者的黑色素瘤窝激活BRAF^V600E/K突变,并拥有>75%的响应率5。尽管这种初步的疗效,由于多种内在和后天抵抗机制和肿瘤内异质性,几乎在每种情况下都迅速产生抗药性。不幸的是,细胞系模型在塑料容器的二维培养中生长时,不会重述代表性的生物异质性,当研究人员试图进行实验确定时,这掩盖了它们的临床预测潜力。可能有效的治疗与黑色素^瘤6的特定形式或基因型的患者。了解如何最好地模拟患者肿瘤内异质性,使研究人员能够更好地开发治疗模式,可以杀死导致失败到当前护理标准疗法的治疗亚人群。

细胞系模型有限的预测价值最大的是它们最初是如何建立的。当患者肿瘤的单细胞悬浮在二维塑料组织培养血管上生长时,肿瘤克隆景观会发生不可逆转的变化,包括增殖和侵入性潜能的变化,消除特定亚种群,遗传信息的改变7。这些黑色素瘤细胞系模型小鼠的异种移植代表了临床前研究在体内平台中最常用的;然而,该策略也遭受复杂的肿瘤异质性临床观察的不良重述。为了克服这一缺陷,人们越来越有兴趣采用更复杂的黑色素瘤临床前模型,包括PDX模型。PDX模型已经使用了30年,在肺癌患者的开创性研究表明,患者对细胞毒性剂的反应与来自同一^患者8的PDX模型的反应是一致。最近,在业界和学术中心,人们一直在推动利用 PDX 模型作为临床前研究的首选工具。PDX模型,由于其优越的重述肿瘤异质性在人类患者,更临床上更相关的使用治疗优化工作比细胞系异种移植9。在黑色素瘤中,有巨大的障碍,使治疗管理先进的^疾病10。临床相关的PDX模型已被用来模拟临床阻力和确定治疗策略与临床可用的剂,以治疗治疗抗药性肿瘤11,12。简单地说,这里提出的用于生成PDX模型的协议要求将原发性或转移性黑色素瘤(通过活检或手术收集)的新鲜组织皮下植入NOD/scid/IL2受体空(NSG)小鼠。不同群体在方法方法上有不同的变化;然而,一个基本的核心^存在13。

Protocol

以下动物规程遵循威斯塔研究所人道伦理委员会和动物护理指南的准则。

1. 黑色素瘤肿瘤组织收集

1. 通过以下手术或活检方法之一从黑色素瘤患者那里收集肿瘤组织(称为通道 0)。
   1. 对于手术切除组织,在运输储存介质(RPMI 1640 = 0.1% 真菌区 + 0.2% 的温霉素)中,在 4 °C 或冰上保持至少 1 克组织(切除转移和原发性病变)。
   2. 对于外科活检组织,在4°C或冰上的运输储存介质中保持少于1克的组织(通常对皮下转移和淋巴结[LN]转移进行活检)。
   3. 对于核心活检组织,将约 10 mm x 1 mm(通常为肝脏活检)的组织圆柱(芯)洗至含有 5 mL 运输储存介质的 15 mL 管中,在 4°C 或冰上。
   4. 对于细针吸气 (FNA) 组织,将直接从患者身上取出的少量组织(小于 1 mm)放在 4°C 的针头和注射器中或在冰上。
2. 在运输储存介质中,在4°C或同一天冰上或手术切除或活检后通宵运输。在分娩后1-2小时内处理组织。

2. 用于小鼠植入的肿瘤组织处理

1. 手术切除或手术活检组织处理
   1. 将组织转移到无菌培养皿中,并尽可能将肿瘤组织与周围的正常组织分离。
   2. 尽可能从剩余的肿瘤中取出坏死组织(通常确定为位于肿瘤中心内的苍白组织)。
   3. 使用手术刀将初始肿瘤块细分为大约相等的部分(±3毫米 x 3毫米),用于手术小鼠植入(图2)。
   4. 或者,如果有足够的肿瘤组织可用,将组织扣死以进行下游检测(RNA测序[RNASeq],整个外兆体测序[WES]等)。
   5. 使用两个手术刀刀片的交叉刀片技术切碎肿瘤组织,制造肿瘤浆料。尽可能精细地切碎肿瘤块,形成浆料,现在已准备好进行手术小鼠植入。
   6. 或者,如果肿瘤组织太难进行机械分离,则使用消化分离程序形成凝胶状浆料和单细胞悬浮液,用于植入和/或注射。
      1. 尽可能精细地切碎肿瘤块,形成泥浆。
      2. 将浆料放入 50 mL 管中,使用冷汉克的平衡盐溶液 (HBSS)^-/- (不含 Ca⁺和 Mg⁼);然后,在220 x g下将离心机和颗粒在4°C下4分钟。
      3. 每1克肿瘤组织中,将浆料悬浮在10 mL的加热新鲜消化介质中(200 U/mL胶原酶IV = 5 mM CaCl₂ =50 U/mL DNase)。
      4. 将管子放入 37°C 水浴中 20 分钟,每 5 分钟与一次性移液器大力混合。
      5. 用高达 50 mL 的 HBSS^-/-;然后,在220 x g下在4°C下离心4分钟。
      6. 每1克肿瘤组织加入5 mL的预加热TEG(0.025%胰蛋白酶= 40微克/mL乙二醇-乙二醇-乙二醇-二酯-乙醚-乙醚-N、N、N'-四乙酸[EGTA]=10微克/mL聚乙烯醇[PVA]),每1克肿瘤组织, 轻轻重新悬浮/摇动,将管置于37°C下2分钟,无需混合。
      7. 加入至少1个同等体积的冷染色培养基(1%牛血清白蛋白[BSA] = 10 mM 4-(2-羟基)-1-管乙酸[HEPES] = 1x青霉素-链霉素在L15培养基中淬火,并在220 x g下4分钟离心4分钟C。
      8. 将样品重新悬浮在每1克肿瘤组织的染色介质10mL中,并通过40μm细胞过滤器过滤,以获得用于小鼠注射的单细胞悬浮液(图2)。
      9. 细胞过滤器顶部剩余的泥浆也可以收集用于手术小鼠植入。
2. C矿石活检组织处理
   1. 将核心圆柱组织倒入组织输送管中,放入 5 厘米培养皿中。
   2. 去除多余的液体,刮到培养皿的边缘,细切肿瘤组织,在肿瘤组织顶部加入+100~150 μL的HBSS^-/-,并迅速将HBSS/肿瘤组织悬浮液抽到1 mL注射器中。
   3. 将 23 G 针头连接到 1 mL 注射器,将 HBSS/肿瘤组织悬浮液通过针头放入 1.5 mL 旋转管中。
   4. 将肿瘤悬浮液重新拉入注射器中,针头仍然打开,直到其顺利通过针头。
   5. 最后将肿瘤悬浮液拉回注射器,并分离23G针。
   6. 连接一个27G的针,并绘制一个相等体积(+100~150μL)的人工细胞外基质(见材料表)到注射器。
   7. 在肿瘤/HBSS^-/-悬浮液中缓慢地将同等体积的人工细胞外基质加入1.5 mL旋转管中,小心避免气泡的形成。
   8. 最后一次拉回注射器,核心活检肿瘤组织现在准备小鼠注射。
3. FNA组织处理
   1. 将装有 FNA 样品(夹在针头中)的注射器放在冰上。
   2. 将针头(包含 FNA 组织)与注射器分离,并从注射器中取出柱塞,在注射器顶部添加 +150*200 μL 的 HBSS^-/-。
   3. 将柱塞重新插入注射器和针头(包含 FNA 组织),并通过针将 HBSS^-/-推入 1.5 mL 旋转管中。此步骤从针头中去除 FNA 肿瘤。
   4. 使用同一注射器两次使用HBSS^-/-/FNA悬浮液重复步骤2.3.3,以最大限度地从针头中检索肿瘤组织。
   5. 在含有HBSS/FNA悬浮液的1.5 mL旋转管中加入相等体积(±100~150 μL)的人工细胞外基质。
   6. 通过缓慢地绘制人工细胞外基质/HBSS^{-/- /FNA}悬浮液回 23 G 针并重复两次,充分混合。
   7. 将整个人工细胞外基质/HBSS^-/-/FNA体积拉回注射器中,用 27 G 针头更换 23 G 针头,FNA 样品现已准备好进行小鼠注射。

3. 小鼠肿瘤植入和注射

1. 植入手术切除或手术活检组织
   注:通过高压灭菌或使用预消毒的一次性器械,确保所有手术器械无菌。
   1. 从NSG 6-8周雄性或雌性小鼠的下背部切毛头发,留下约1.5厘米x3厘米区域,没有头发。使用配苯二苯还器麻醉小鼠,并通过轻轻挤压脚作为反应能力测试来确认。在眼睛上使用兽医膏,以防止干燥。
   2. 将单个小鼠放在麻醉机鼻锥中的热垫上,用氯西丁擦洗被刮过的区域。然后用70%乙醇,让蒸发。
   3. 在培养皿中准备块状或将肿瘤浆料分成单独的土堆进行手术植入(即,如果植入3只小鼠,则分成三个相等的土堆)。
   4. 使用手术刀,在鼠标背面中心切开约 5 mm 长的切口,取出一对钳子,将切口侧皮抬起, 与操作员相对。
   5. 将剪刀放入另一只手,用小剪刀切割,将皮肤与肌肉层分开,从而为肿瘤组织创建一个"口袋"。
   6. 用手术刀拿起一个肿瘤块或单个肿瘤浆状组织堆,轻轻地将组织放入创建的口袋中。
   7. 在口袋的肿瘤组织土堆上施用100μL的人工细胞外基质。
   8. 使用两对钳子,拉起两端的切口,使伤口边缘靠近,并通过应用一个或两个伤口夹来合上伤口。
   9. 皮下注射1-5毫克/千克的梅洛西卡姆作为镇痛小鼠手术后。
   10. 把鼠标从鼻锥中拿出来,放回原来的笼子里,一边醒来一边观察鼠标。在完全恢复之前,不要返回笼子。
   11. 大约 7 天后取出伤口夹。如果愈合在7天后没有完成,请将伤口夹留在另一两天。
       注:如果使用手术切除或手术活检组织处理的单细胞悬浮液,它将与小鼠注射的人工细胞外基质(1:1比例)混合。
2. 注射FNA或核心活检组织
   1. 将 NSG 鼠标放在钢格栅机架上,将鼠标牢牢地固定在尾部,然后轻轻地将鼠标拉回。它会用前腿牢牢地抓住网格。或者,将鼠标约束在非主导手上,让侧翼区域可见。
   2. 用酒精预拭子对侧翼的皮肤进行消毒,缓慢而稳定地将注射器的内容注入小鼠皮肤下。
   3. 拔下针头,将鼠标放回笼子。

4. 监测肿瘤生长

1. 每周监测一次小鼠,检查可察觉的肿瘤。
2. 一旦肿瘤在可测量的大小(约50毫米3),使用卡钳记录肿瘤的尺寸。使用以下公式计算肿瘤体积:(宽度 x 宽度 x 长度) / 2。
3. 一旦肿瘤体积达到1.5厘米3(约4~10周),收获肿瘤。肿瘤现在称为小鼠通道1(MP1)。

5. 收获用于银行组织、再植入和实验/表征的肿瘤

1. 在CO2腔室中给小鼠安乐死,检查生命体征以确认死亡,然后将小鼠浸入Virkon溶液中,在生物柜中对皮肤进行30s的消毒。
2. 使用弯曲的剪刀和手术钳提升靠近肿瘤的皮肤,并作出水平切割。
3. 使用钝分离技术来调动肿瘤两侧和肿瘤上的皮肤,暴露肿瘤。
4. 使用剪刀或手术刀将肿瘤与筋膜分离。
5. 切除肿瘤,将肿瘤转移到无菌培养皿中,将肿瘤切成小块,从肿瘤中取出坏死组织。
6. 银行肿瘤组织为未来的植入。
   1. 取 2-3 个小于 ±10 mm x 10 mm 的小肿瘤片,将它们切成小于 ±1 mm x 1 mm 的片件。
   2. 将所有切碎的组织转移到2 mL低温小瓶中,加入1 mL的冷冻介质(10%DMSO = 90%FBS)。
   3. 混合好,并将低温小瓶放入干冰上的预冷却异丙醇细胞冷冻容器中。
   4. 将容器储存在-80°C冷冻室过夜,然后将低温小瓶转移到液氮(LN₂₎储存中。
7. 用于下游检测的捕捉冻结组织(RNASeq、WES 等)。
   1. 将肿瘤组织片(+3 mm x 3 mm)放入低温小瓶中,并立即将低温小瓶放入LN₂中。小瓶储存在-80°C冰柜中。

6. PDX治疗试验

注:需要两个扩张阶段才能生长足够的肿瘤组织,以产生必要的数量PDX带小鼠进行治疗试验。

1. 从LN2中拾起一个含有冷冻的PDX组织,并将冷冻液放在37°C的水浴中,直到含有肿瘤组织的冷冻介质刚刚开始融化。
2. 将冷冻液中的内容倒入预热的HBSS-/- 管中,然后清洗组织。
3. 在 1,200 rpm 下通过离心进行 5 分钟的小球组织。
4. 使用巴斯德移液器通过真空吸气从肿瘤样本中取出 HBSS^-/-。
5. 将 PDX 组织从 50 mL 管滑入 5 厘米或 10 厘米培养皿中,放在湿冰上。
6. 遵循上述植入方案,将低温小瓶中的冷冻组织植入5只NSG小鼠中,进行第一轮PDX肿瘤扩张。
7. 一旦肿瘤达到+600~800mm 3,收获1-2个肿瘤,获得单细胞悬浮液,上述方案用于肿瘤组织处理:机械分离,胶原酶消化分离程序。
8. 颗粒细胞和重新悬浮在6 mL的HBSS^-///人工细胞外基质(1:1比例),皮下注射+50NSG小鼠,每只小鼠100μL的细胞混合物,用于第二轮PDX肿瘤扩张。
9. 每两周用卡钳测量肿瘤大小。
10. 在3-5周内等待肿瘤大小为±100 mm^3,将小鼠随机分成组,然后开始治疗。
11. 当肿瘤大小达到IACUC批准的最大体积时,停止治疗。
12. 按照上述收获肿瘤方案收集捕捉冷冻肿瘤片,肿瘤片为石蜡块。

Results

黑色素瘤PDX模型的肿瘤组织可以来自各种不同的来源,也可以根据各个模型的生长动态和PDX组织的预期使用进行处理。建立 PDX 模型时,首要任务是有足够的材料供将来使用,DNA 用于表征(图 1)。

一旦有足够的物质被存入,肿瘤组织可以扩大在三种主要方法之一,以增长足够的肿瘤进行正式治疗研究(图2A)。本文介绍的每种方法都允许从PDX扩大肿瘤(图2B)。根据我们的经验,使用酶消化(胶原酶IV)创建肿瘤细胞的单细胞悬浮液可以促进肿瘤生长更快,并允许一个初始肿瘤扩展到10-20个小鼠,而肿瘤块和浆状方法只能扩展到5~10个小鼠(图2C)。正如以前在其他肿瘤类型中所证明的,黑色素瘤PDX模型通常反映患者在治疗时表现出的药物敏感性。这里展示的是一个代表治疗...

Discussion

本文描述了从原发性肿瘤和转移性肿瘤、核心活检和FN中提取患者组织生成黑色素瘤的PDX模型。当直接移植到NSG小鼠中时,肿瘤具有与患者观察到的相似的形态、基因组和生物特性。在只有少量组织可供研究人员使用的情况下,如 FNA 通常发生的情况,PDX 技术允许肿瘤组织扩展以用于 DNA、RNA 和蛋白质表征,以及用于治疗试验,以允许临床前药物发展。

PDX 移植成功的关键是材料调查员开始的质量。必须小心,以确保肿瘤组织在第1节和第2节中得到尽可能适当的保存。重要的是,对PDX黑色素瘤模型治疗的反应更好地概括了供体患者的敏感性,允许进行强有力的临床前研究,以制定改进的治疗策略,以对抗治疗阻力,并改善响应的持久性。大多数转移性黑色素瘤患者没有体验治愈与现有的护理标准(SOC)疗法5。我们的PDX黑色素瘤系列包含500多个不同的模型,包括那些从那些复发在靶向治疗和免疫治疗1,2的患者派生。这一资源对于开发克服对当前SOC的抗药性的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	货号 # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	货号 # 15140163
1x HBSS-/- （不含 Ca++ 或 Mg++）	MED	货号 # MT21-023-CV
2.5% 胰蛋白酶	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	货号 # T4549-100ML	10 mL 等分试样，储存在 –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	货号 # A9418-500G
洗必泰	Fisher Scientific	货号# 50-118-0313
胶原酶 IV （2,000 u/mL）	Worthington	货号 #4189	在胶原酶 IV 粉末原液（Worthington #4189，瓶子上标明的 u/mg，每批都不同）的 HBSS-/- 中组成;冷冻 1
个 DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	货号 # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	货号 # D4527
EGTA（乙二醇双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'N'-四乙酸）	默克	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE	TECHNOLOGIES 货号 # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	货号 # 15290-018
庆大霉素	FISHER SCIENTIFIC	货号 # BW17518Z
异氟醚	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	货号 # 050031
Leibovitz 的 L15 媒体	Invitrogen	货号 # 21083027
Matrigel	Corning	货号 # 354230	人工细胞外基质
美洛昔康	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH设备 # ：：Henry Schein	货号 # 025115	1-5mg/kg，作为止痛药
NOD/SCID/IL2 受体无效 （NSG） 小鼠	Wistar 研究所，动物设施		育种
PVA（聚乙烯醇）	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	货号 # P8136-250G
RPMI 1640 培养基（Mod.） 1X 含 L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	货号# MT10041CM
手术刀	羽毛	猫货号 # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	货号 # 222-01-06
缠绕夹	MikRon	货号 #427631