Summary
为了检查鼠标的视觉, 我们进行了一个即将到来的测试。老鼠被安置在一个大的广场竞技场上, 天花板上有一个显示器。隐约约的视觉刺激一直会在小鼠体内引起冷冻或飞行反应。
Abstract
中枢神经系统中的视觉系统处理不同的视觉信号。虽然整体结构的特点是从视网膜通过外侧膝状核到视觉皮层, 系统是复杂的。已经进行了细胞和分子研究, 以阐明支持视觉处理的机制, 进而阐明疾病机制。这些研究可能有助于人工视觉系统的发展。为了验证这些研究的结果, 行为视觉测试是必要的。在这里, 我们表明, 隐约刺激实验是一个可靠的鼠标视觉测试, 需要一个相对简单的设置。即将进行的实验是在一个大的外壳中进行的, 一个角落有一个掩体, 天花板上有一个电脑显示器。位于计算机显示器旁边的 CCD 摄像机用于观察鼠标行为。一只老鼠被放置在圈内 10分钟, 并允许它适应和探索周围的环境。然后, 监视器将程序产生的隐约刺激投射了10倍。老鼠对刺激的反应不是冷冻, 就是逃到藏身之处。记录了鼠标在隐约刺激前后的行为, 并使用运动跟踪软件对视频进行了分析。在隐约出现的刺激后, 老鼠的运动速度发生了显著变化。相比之下, 在盲鼠中没有观察到任何反应。我们的结果表明, 简单的隐约实验是对老鼠视觉的可靠测试。
Introduction
视觉系统从视网膜开始, 视觉信号被光感受器捕捉, 引导到双极细胞 (2 阶神经元), 最后传递到神经节细胞 (第3 阶神经元)。视网膜2阶和第3级神经元被认为形成多个神经通路, 传达视觉信号的特定方面, 如颜色、运动或形状。这些不同的视觉特征被传递到外侧膝状核和视觉皮层。相反, 导致眼球运动的视觉信号被发送到上大肠杆菌。经典地, 两个视网膜皮质通路已被确定: 磁细胞和副细胞通路。这些路径分别编码移动和静止物体, 它们的存在体现了并行处理1,2,3,4,5, 6。最近, 超过15种双极细胞7,8,9, 10,11和神经节细胞 12,13,14在包括灵长类视网膜在内的许多物种的视网膜中, 有15,16例。这些细胞的区别不仅在于形态方面, 而且还表现出不同的标记和基因8,10,17, 18,这表明, 各种特征视觉信号是平行处理的, 比最初预期的要复杂得多。
细胞和分子技术有助于我们了解视觉处理和异常视觉处理可能产生的潜在疾病机制。这样的理解可能有助于人工眼睛的发育。尽管细胞检查和分析在细胞层面提供了深入的知识, 但行为实验和细胞实验的结合将显著增强我们目前对微小视觉过程的理解。例如, Yoshida 等人 19发现, 星爆 amacrine 细胞是小鼠视网膜运动检测的关键神经元。在进行细胞实验后, 他们进行了视动性眼球震颤 (OKN) 行为实验, 以表明星爆 amacrine 细胞功能失调的突变小鼠对运动物体没有反应, 从而证实了它们的细胞调查。此外, Pearson 等人20 在小鼠视网膜进行光感受器移植, 以恢复患病小鼠的视力。他们不仅进行了细胞实验, 而且还通过使用光爆反应记录和水迷宫任务测量了老鼠的行为, 从而使皮尔逊等人能够验证移植的光感受器是否恢复了以前失明的视力小 鼠。总之, 行为实验是评估老鼠视力的有力工具。
有多种方法可用于测量鼠标视觉。这些方法有其优点和局限性。在体内 ERG 提供有关小鼠视网膜, 特别是光感受器和双极细胞, 是否对光刺激做出适当反应的信息。Erg 可以在苏格兰或光子条件下进行测试 21,22。然而, ERG 需要麻醉, 这可能会影响输出测量23。视感反射 (OKR) 或光耦合器响应 (OMR) 是一种用于评估对比度灵敏度和空间分辨率的可靠方法, 这两个功能成分都是小鼠视觉的组成部分。然而, OKR 需要手术给老鼠头骨24 上安装固定装置。OMR 既不需要手术, 也不需要小鼠训练;然而, 它需要训练, 让实验者主观地检测到微妙的鼠标头部运动, 以响应一个移动的光栅在一个光学鼓 25,26。小学生光反射测量瞳孔收缩对光刺激的反应, 这不需要麻醉, 并表现出客观和稳健的反应19。虽然瞳孔反射在体内模拟视网膜光的反应, 但反射主要是由本质上光敏视网膜神经节细胞 (弹性角膜) 27介导的。由于 ipRGCs 只占 Rgc 的一小部分, 并不作为传统的形成图像的神经节细胞, 因此这种测量不能提供与大多数神经节细胞有关的信息。
这种隐约出现的光实验此前并不被认为是测量老鼠视力的主要测试。然而, 它也是一个强大和可靠的视觉测试, 对各种物种, 如老鼠28,29, 斑马鱼30, 蝗虫31,32, 和人类33,34,35. 重要的是, 即将到来的实验是测试图像形成途径的仅有的方法之一----它不是反射路径----因为中枢神经系统中的视觉和边缘系统参与了这一电路 36, 37,38。我们已经建立了一个隐约的视觉刺激系统, 并已证明它的能力, 以诱导运动检测在鼠标, 我们使用它作为一个代理来评估鼠标视觉系统的不变性。
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Protocol
所有实验和动物护理都是根据韦恩州立大学动物护理和使用机构委员会批准的议定书 (第17-11-0399 号议定书) 进行的。
1. 实验准备
- 在隐约出现的视觉刺激演示文稿时, 建造一个长方形的开盖外壳来容纳鼠标。我们使用铝制框架和 PVC 面板构建了一个40厘米 x 50 厘米 x 33 厘米的外壳 (图 1a, b)。铺一张纸, 覆盖外壳的整个地板, 以确保在两次试验之间轻松清理。在围场的一角添加一个不透明的掩体, 并设有面向竞技场中心的入口, 方便进出。
- 设置带有广角镜头的相机, 以捕捉鼠标的行为。将摄像机固定在与机柜相邻的桌面支架上。为了获得最佳质量的视频捕捉, 请使用 60 FPS 或更高的相机帧速率。
- 在机柜顶部设置计算机监视器。由于从外部看不到显示器, 因此准备了第二个监视器, 该监视器复制了主监视器上显示的图像。
- 准备一个隐约的投影模式。执行此操作的一种方法是使用 MatLab 软件中的心理工具箱3对展开的黑圈进行编码 (图 1c)。将刺激设置为从2°的视角开始, 并在250毫秒以上扩展到 50°;这些参数决定了刺激速度 (见图 1d 的视角计算)。设置代码以重复刺激 10次, 间隔为1秒。
注: 在上一个演示文稿结束后, 刺激措施立即开始每次重复。有关刺激措施的更多信息, 请参阅第3节。 - 选择感兴趣的老鼠进行即将到来的刺激。在这里, 使用32只健康眼的老鼠, C57 背景, 男性和女性, 4至14周大。另外, 使用3只盲鼠 (双眼严重白内障) 来评估对隐约刺激的反应是否真的是视觉引导的行为。这些盲鼠没有瞳孔光反射, 也没有验光反应。
2. 鼠标适应
- 将鼠标放入外壳中, 让其自由探索周围的环境。如果可能的话, 尽量减少动物转移过程中的压力, 用你的自由手的后背作为老鼠的休息场所, 而不是让它在没有支持的情况下悬挂。鼠标应该找到整个机柜是安全的, 并应发现隐藏的地方。在避难所对面的角落滴下一些食物颗粒, 以鼓励老鼠留在避难所外面。
- 让老鼠在任何地方适应 29,39。在刺激开始之前, 我们允许10分钟的适应。此外, 实验前一天10分钟的适应可能会缓解小鼠。
3. 隐约视觉刺激投影
- 在将鼠标插入竞技场之前, 请确保刺激代码已准备好运行, 以便在鼠标处于存储模块中时尽可能少地进行照明更改。软件准备好运行后, 轻轻地将鼠标放在机柜中。
- 在刺激前 10秒, 开始视频捕捉。
- 当鼠标远离掩体并在开放的竞技场上自由移动时, 开始隐约出现的视觉刺激。在最后一次刺激演示后等待10秒钟以终止录制。
- 当鼠标位于离避难所最远的角落时, 开始刺激演示。然而, 当老鼠似乎不愿意探索远角时, 当老鼠在竞技场的另一个角落时, 就会出现刺激。这似乎对动物行为反应没有影响。
- 将鼠标转移回原来的笼子。用70% 的乙醇擦拭墙壁和避难所, 清洁下一个老鼠的外壳。如果弄脏了纸地板衬垫, 请更换纸地板衬垫, 如果在动物转移和圈地清洗过程中移动, 则将避难处重新定位到同一初始位置。
4. 视频分析
- 将每个鼠标的视频剪辑保存为. avi 格式, 无需文件压缩, 以确保在传输到分析软件期间不会丢失数据。
注: 缺乏压缩将导致更大的文件大小;因此, 请使用外部硬盘驱动器进行存储。 - 使用分析软件在刺激呈现之前、期间和之后跟踪动物在竞技场周围的运动。使用商业上可用的软件 (见材料表), 手动跟踪跟踪每个视频帧中的鼠标头的位置, 每半个毫秒都会产生 x 和 y 协调。)40和 ethovision (noldus)。
- 计算鼠标与避难所的速度和距离。如果竞技场的图像由于视频角度而扭曲, 请在计算前更正 x 和 Y 协调 (图 2)。
- 比较即将到来的刺激开始前后的参数, 以确定老鼠对刺激的反应, 无论是通过冻结、逃跑, 还是通过表现出行为没有变化29。将冻结定义为速度小于 20 mmmms 0.5 秒或更长时间的剧集。将飞行定义为速度增加到 400 mm/m/n 或更大, 并以鼠标在避难所结束的剧集。冻结和飞行的定义是根据 Franceschi 等人确定的定义的.
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Representative Results
一只眼睛健康的老鼠被放置在圈内, 并允许它适应10分钟。在天花板上有监视器的竞技场保持在介光条件下 (7 x10 5 光子 2).在适应期间, 老鼠探索了这个空间, 发现不透明的圆顶是一个避难所。当鼠标离开避难所时, 视频捕获开始, 然后开始视觉刺激。为了应对即将到来的刺激, 大多数老鼠跑进圆顶 (飞行反应), 在31只老鼠中的 30只 (97%) 中观察到了圆顶 (97%)。一些老鼠在逃跑前表现出冷冻反应 (19/31 老鼠, 61%)。隐约刺激降低了光条件1日志 (6 x10 5 光子 2).
使用带有手动跟踪功能 (Image Pro Plus) 或 FIJI (Nih) 的商业分析软件对捕获的视频剪辑进行了分析。使用跟踪功能, 在即将到来的刺激之前、期间和之后, 在视频的每一帧 (60 帧) 中都确定了鼠标的位置。我们分析了速度随时间的变化以及到掩体的距离 (图 3)。当飞行发生时, 速度突然增加, 到掩体的距离也相应缩小。相比之下, 当小鼠冻结时, 速度接近 0 mm\。从即将出现的刺激开始到飞行的潜伏期从0.1 到6.0秒不等 (平均2.2 秒, 30只老鼠)。飞行反应的最大速度范围为 500-3000mmss (30只小鼠)。
图 1: 实验系统.(A) 隐约出现的刺激外壳示意图。电脑显示器 (21 英寸) 覆盖天花板。在外壳的一个角落有一个不透明的圆顶, 老鼠可以在里面避难。带有广角镜头的视频监视器可捕获鼠标行为。(B) 我们整个设置的总体情况。辅助监视器复制刺激显示上显示的图像。(C) 即将到来的刺激图。隐约的刺激从 2° (1.15 厘米) 开始, 保持在这个大小250毫秒, 然后在250毫秒的过程中扩展到 50° (30.8 厘米), 并在另外500毫秒内保持50°。(D) 刺激计算示意图。保持架的高度决定了刺激的必要开始和结束大小 (厘米), 以便产生直接在鼠标上方时从2°扩展到50°的刺激。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 分析计算.从广角镜头中进行计算, 以纠正倾斜。由于摄像机的位置, 竞技场的地板显示为梯形而不是矩形 (左)。因此, 必须更正鼠标的 X 和 Y 坐标, 以准确分析鼠标位置 (中)。使用同余三角形的几何形状, 可以找到 x 坐标必须移动多少, 才能正确地表示鼠标在三维空间中的运动 (右)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 对即将到来的刺激作出有代表性的反应.(A) 在竞技场内跟踪的鼠标移动的例子。一个红色的圆圈显示了老鼠逃到并停留到即将消失的圆顶。1 = 视频捕获开始时的鼠标位置起点。2 = 当小鼠探索竞技场时, 刺激开始前的运动。3 = 即将到来的刺激开始。鼠标冲到圆顶 (用红色虚线显示)。4 = 鼠标停留在圆顶, 直到和结束后的刺激。(B) 速度变化是这个鼠标的时间函数。虚线表示即将到来的刺激何时开始。刺激持续时间由黄色背景表示。这里没有显示完整的10秒周期, 因为老鼠在整个刺激期间一直在避难所中保持静止。(C) 随着时间的推移, 同一鼠标在 (a) 和 (b) 中与圆顶的距离。(D) 和 (e) 飞行前表现出冻结反应 (由红色双面箭头显示的冻结时间) 的老鼠与圆顶的速度和距离。与控制相比, 速度降低了 (在隐约出现之前)。在这期间, 到圆顶的距离没有改变。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
随着视觉刺激系统的临近, 大多数 (97%)健康的眼鼠表现出飞行反应。29只老鼠中的一只没有表现出明显的飞行反应。然而, 老鼠向圆顶走去, 一直呆在圆顶附近, 直到隐约消失, 这表明当即将到来的刺激发生时, 老鼠至少是谨慎的。因此, 即将到来的刺激不断引起健康眼鼠天生的恐惧反应。另一方面, 三只盲鼠并没有对即将到来的 (初步结果) 做出任何反应。总之, 我们证明了隐约出现的实验是对小鼠有用和一致的视力测试。
我们将隐约刺激的速度定在192度/, Franceschi 等人29岁地研究了不同速度的隐约反应, 5 至84度, 并在较低的速度水平上优先观察到冻结响应。Yilmaz 和 Meister在35 至350度的情况下观察到28个飞行反应;然而, 在更高的速度下, 飞行延迟更长。因此, 为了唤起一致的飞行反应, 隐约出现的速度应该是50度或更高。即使使用标准演示软件, 也可以轻松生成隐约刺激。然而, 这样的软件不能创造更高的速度隐约刺激。相反, 我们使用 MatLab 和心理工具3创建的视觉刺激在192度/。
在即将到来的刺激之前, 我们对老鼠进行了 1 0-1 5分钟的适应, 这也是之前研究人员描述的28、2 9、3 9的适应时间。我们进一步测试了前一天的适应是否改变了迫在眉睫的行为。在即将到来的刺激的前一天, 我们把老鼠放在圈内 10分钟, 没有隐约的刺激。这种适应显著缩短了飞行潜伏期 (p < 0.01, n = 7只小鼠,数据未显示)。虽然10分钟的适应在即将到来的日子不断引起飞行反应, 1天的适应减少了飞行反应的延迟。
使用隐约刺激作为视力测试有一些局限性。首先, 很难一次测试一只眼睛。除非缝合一只眼睛, 否则两只眼睛都要一起测试。其次, 行为隐约反应的机制尚未完全建立。在视网膜中, Yilmaz 和 Meister 28建议腹侧 off-ds包含 (定向选择性神经节细胞), 而不是 On-ds指向, 传达的信号是引起反应的信号。这一结论产生于他们的研究结果, 即老鼠对黑暗的刺激做出反应, 但对白色的刺激反应不大。在大脑中, Wei 等人. 36岁和shang 等人在研究中证明, 从上大肠杆菌通过杏仁核和导水管周围灰色的通路是导致这种情况隐约出现的原因。然而, 应进行更多的研究, 以证实这些调查。
尽管在即将到来的实验方面存在一些局限性, 但隐约出现的视觉刺激会在小鼠身上产生一致而有力的恐惧反应, 应该是对老鼠视觉的有用测试, 这需要对实验者进行最少的训练。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 NIH R01 Y028915 (TI) 和 RPB 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10.1" monitor (2° display) | Elecrow | Elecrow 10.1 Inch Raspberry Pi 1920x1080p Resolution Display | |
| 14" Business Class Laptop 5490 | Dell | 84 / rcrc961481-4860836 | |
| 20" x 50" Absorbant Liners | Fisher Scientific | AL2050 | works well to protect floor of arena, could use any type of liner |
| 21.5" monitor (1° display) | Acer | Acer R221Q bid 21.5-inch IPS Full HD Display | |
| CCD Camera | Lumenera Corporation | Infiniyy3S-1UR | excellent for behavioral studies due to high fps rate (60 fps) |
| Enclosure (alminum frames and PVC panels) | 80/20 Inc. | 4x cat.#9010, 4x cat.#9005, 1x cat.#9000, 5x cat.#65-2616 | excellent, used quick build tab to find PVC, joints, and frame |
| Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Excel Spreadsheet Software | Microsoft Office | user friendly and widespread knowledge of Microsoft Office software | |
| Freearm | Amazon | used to mount camera to the table, could use any mountable extendable arm | |
| ImagePro Premiere 3D | Media Cybernetics | version 9.3 | good program, could use some updating with the automated tracking feature |
| Matlab software (Psychotoolbox 3) | MathWorks | Matlab R2018b 64-bit (9.5.0.944444) | excellent software to generate pattern stimuli of any conditions |
| SteamPix sorftware | Norpix | StreamPix 7 64-bit Single Camera | works well, a few problems with frame dropping but good customer service |
| WD My Book External Hard Drive | Western Digital | WDBBGB0080HBK hard drive 8 TB USB 3.0 | necessary if using .avi files with no compression codec due to large size of files |
| Wide angle lens | Navitar | NMV-5M23 | excellent and necessary to capture entire arena |
References
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