Summary
Para examinar a visão do mouse, realizamos um teste de iminente. Camundongos foram colocados em uma grande arena quadrada com um monitor em seu teto. O estímulo visual iminente evocou consistentemente as reações de congelamento ou de voo nos camundongos.
Abstract
O sistema visual no sistema nervoso central processa diversos sinais visuais. Embora a estrutura geral tenha sido caracterizada a partir da retina através do núcleo geniculado lateral para o córtex visual, o sistema é complexo. Estudos celulares e moleculares têm sido conduzidos para elucidar os mecanismos que sustentam o processamento visual e, por extensão, mecanismos de doença. Estes estudos podem contribuir para o desenvolvimento de sistemas visuais artificiais. Para validar os resultados desses estudos, é necessário o teste de visão comportamental. Aqui, mostramos que o experimento de estimulação iminente é um teste de visão confiável do mouse que requer uma configuração relativamente simples. O experimento em ascensão foi conduzido em um grande recinto com um abrigo em um canto e um monitor de computador localizado no teto. Uma câmera CCD posicionada ao lado do monitor do computador serviu para observar o comportamento do mouse. Um rato foi colocado no recinto por 10 minutos e permitiu aclime e explorar os arredores. Em seguida, o monitor projetou um estímulo de iminente derivado do programa 10 vezes. O rato respondeu aos estímulos ou congelando-se ou fugindo ao esconderijo. O comportamento do mouse antes e após os estímulos de iminente foi gravado, e o vídeo foi analisado usando o software de rastreamento de movimento. A velocidade do movimento do mouse mudou significativamente após os estímulos de iminente. Em contraste, nenhuma reação foi observada em camundongos cegos. Nossos resultados demonstram que o experimento de iminente simples é um teste confiável de visão do mouse.
Introduction
O sistema visual começa na retina, onde os sinais visuais são capturados por fotorreceptores, canalizados para células bipolares (2 neurônios de ordemND), e finalmente passados para células ganglionares (3RD-ordem neurônios). Os neurônios da ordem retina 2NDe 3RDsão pensados para formar múltiplas vias neurais que transmitem aspectos específicos da sinalização visual, como cor, movimento ou forma. Estas características visuais diversificadas são retransmitidas ao núcleo geniculado lateral e ao córtice visual. Ao contrário, os sinais visuais que conduzem ao movimento do olho são emitidos ao colliculus superior. Classicamente, duas vias retino-corticais foram identificadas: os caminhos magnocelular e parvocelular. Esses caminhos codificam objetos móveis e estacionários, respectivamente, e sua existência incorpora o conceito básico de processamento paralelo1,2,3,4,5, a 6. Recentemente, mais de 15 tipos de células bipolares7,8,9,10,11 e células ganglionares12,13,14 ,15,16 foram relatados na retina de muitas espécies, incluindo o primata retina. Estas células distinguem-se não só pelos aspectos morfológicos, mas também pela expressão de diferentes marcadores e genes8,10,17,18, sugerindo que várias características da os sinais visuais são processados paralelamente, o que é mais complicado do que o previsto inicialmente.
As tecnologias celulares e moleculares contribuíram para a nossa compreensão do processamento visual e dos potenciais mecanismos de doença que podem surgir do processamento visual aberrante. Tal entendimento pode contribuir para o desenvolvimento de olhos artificiais. Embora as examinações e a análise celulares ofereçam o conhecimento detalhado em um nível celular, uma combinação de experiências comportáveis e de experiências celulares aumentaria significativamente nossa compreensão atual de processos visuais minuciados. Por exemplo, Yoshida et al.19 descobriram que as células amacrinas Starburst são os neurônios-chave para a detecção de movimento na retina do mouse. Após experimentos celulares, eles realizaram o experimento comportamental de nistagmo optocinético (OKN) para mostrar que camundongos mutantes em que as células amacrinas Starburst foram disfuncionais não responderam a objetos em movimento, confirmando assim a sua rede celular Investigações. Além disso, Pearson et al.20 realizaram transplante de fotorreceptores na retina do camundongo para restaurar a visão em camundongos doentes. Eles realizaram não apenas experimentos celulares, mas também mediram o comportamento do mouse através do uso de gravações de resposta optomotora e tarefas de labirinto de água, permitindo assim Pearson et al. verificar que os fotorreceptores transplantados restauraram a visão no anteriormente cego Ratos. Tomados em conjunto, experimentos comportamentais são ferramentas fortes para avaliar a visão do mouse.
Vários métodos estão disponíveis para medir a visão do mouse. Esses métodos têm vantagens e limitações. In vivo ERG fornece informações sobre se a retina do mouse, particularmente fotorreceptores e em células bipolares, responde adequadamente a estímulos leves. O ERG pode ser testado as condições Scotopic ou photopic21,22. No entanto, o ERG requer anestesia, o que pode afetar a medição de saída23. O reflexo optocinético (OKR) ou a resposta optomotora (OMR) é um método robusto para avaliar a sensibilidade ao contraste e a resolução espacial, ambos os componentes funcionais da visão do mouse. No entanto, o OKR requer cirurgia para anexar um dispositivo de fixação ao crânio do mouse24. OMR não requer cirurgia nem treinamento de mouse; no entanto, requer treinamento para permitir que um experimentador detecte subjetivamente os movimentos sutis da cabeça do mouse em resposta a uma grade em movimento em um tambor óptico 25,26. O reflexo de luz pupilar mede a constrição da pupila em resposta a estímulos leves, o que não requer anestesia e apresenta respostas objetivas e robustas 19. Embora o reflexo da pupila simule a resposta clara retinal in vivo, o reflexo é negociado principalmente pelas pilhas retinal intrinsecamente fotossensível do gânglio (iprgcs) 27. Porque os ipRGCs representam uma minoria pequena de RGCs e não servem como pilhas convencionais da imagem-formação do gânglio, esta medida não fornece a informação que pertence à maioria de pilhas do gânglio.
O experimento de luz iminente não foi previamente considerado um teste importante para medir a visão do mouse. No entanto, é também um teste de visão robusto e confiável em várias espécies, tais comomouse 28,29, zebrafish30, Locust31,32, ehumano 33,34, 35. importante, o experimento iminente é um dos poucos métodos para testar a via de formação de imagem-não é uma via reflexa-dado o Visual e os sistemas límbico no sistema nervoso central estão envolvidos neste circuito36, 37,38. Nós estabelecemos um sistema de estímulo visual iminente e demonstraram sua capacidade de eliciar detecção de movimento no mouse, que usamos como um proxy para avaliar a intactência do sistema visual do mouse.
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Protocol
Todos os experimentos e cuidados com animais foram conduzidos de acordo com o protocolo aprovado pelos comitês institucionais de cuidado e uso de animais da Wayne State University (protocolo n º 17-11-0399).
1. preparação para o experimento
- Construa um cerco retangular da abrir-tampa para abrigar o rato durante a apresentação de estímulo visual de aparecimento. Foi construído um invólucro de 40 cm x 50 cm x 33 cm com moldura em alumínio e painéis de PVC (Figura 1a, B). Coloque uma folha de papel para cobrir todo o piso do recinto para garantir uma limpeza fácil entre os ensaios. Adicione um abrigo opaco em um canto do recinto com uma entrada virada para o centro da arena para fácil entrada e saída.
- Configure uma câmera com uma lente grande angular para capturar o comportamento do mouse. Fixe a câmara a um suporte montado na mesa adjacente ao recinto. Para captura de vídeo de melhor qualidade, use uma taxa de quadros de câmera de 60 FPS ou superior.
- Configure um monitor de computador na parte superior do compartimento. Porque o monitor não pôde ser visto do lado de fora, um segundo monitor foi preparado, que duplicou as imagens mostradas no monitor principal.
- Prepare um padrão iminente para projeção. Uma maneira de fazer isso é usar o PsychToolbox3 dentro do software MatLab para codificar para um círculo preto em expansão (Figura 1C). Definir o estímulo para começar em um ângulo visual de 2 ° e expandir para 50 ° sobre 250 MS; Estes parâmetros determinam a velocidade do estímulo (ver Figura 1D para cálculo do ângulo visual). Defina o código para repetir o estímulo 10 vezes com um intervalo de 1 s.
Nota: o estímulo iniciou cada repetição imediatamente após o término da apresentação anterior. Para mais informações sobre a apresentação do estímulo, consulte a secção 3. - Selecione os ratos de interesse para os estímulos de iminente. Aqui, use 32 ratos de olhos saudáveis de um fundo C57, masculino e feminino, 4 a 14 semanas de idade. Além disso, use 3 camundongos cegos (cataratas graves em ambos os olhos) para avaliar se a resposta ao estímulo iminente foi realmente um comportamento visualmente guiado. Estes ratos cegos não tiveram nenhum reflexo pupilar da luz e nenhuma resposta do optomotor.
2. aclimatação do rato
- Coloque um rato no recinto e deixe-o explorar livremente os seus arredores. Se possível, tente minimizar o stress durante a transferência de animais usando a parte de trás de sua mão livre como um lugar de descanso para o mouse em vez de deixá-lo pendurar sem suporte. O rato deve encontrar o cerco inteiro para ser seguro e deve descobrir o esconderijo. Deixe cair algumas pelotas de alimento no canto oposto ao refúgio para incentivar o rato permanecer fora do refúgio.
- Permita que o rato aclimatar em qualquer lugar de 7 a 15 minutos29,39. Nós permitimos 10 minutos do aclimatação antes do início do estímulo. Além disso, 10 minutos de aclimatação um dia antes do experimento podem aliviar os camundongos.
3. projeção de estímulos visuais em iminente
- Antes de inserir o mouse na arena, certifique-se de que o código de estímulo esteja pronto para ser executado para facilitar o quanto as alterações de iluminação forem possíveis enquanto o mouse estiver no compartimento. Uma vez que o software está pronto para funcionar, coloc delicadamente o rato no cerco.
- 10 segundos antes da estimulação, inicie a captura de vídeo.
- Iniciar o aparecimento de estímulos visuais quando o mouse está longe do abrigo e movendo-se livremente na arena aberta. Aguarde 10 segundos após a última apresentação do estímulo para encerrar a gravação.
- Comece a apresentação do estímulo quando o mouse está no canto mais distante do refúgio. No entanto, quando os ratos parecem não dispostos a explorar o canto distante, apresentar o estímulo quando o mouse está em um canto diferente da arena. Isso não parece fazer a diferença na resposta comportamental animal.
- Transfira o mouse de volta para sua gaiola original. Limpe o recinto para o próximo rato, pulverizando as paredes e refúgio com 70% etanol e limpá-lo para baixo. Substitua o forro do assoalho do papel se sujado e reposicione o refúgio à mesma posição inicial se movido durante a transferência animal e a limpeza do cerco.
4. análise de vídeo
- Salve o clipe de vídeo para cada mouse no formato. avi sem compactação de arquivos, a fim de garantir nenhuma perda de dados durante a transferência para o software de análise.
Observação: falta de compactação levará a tamanho de arquivo maior; Portanto, use o disco rígido externo para armazenamento. - Use o software de análise para rastrear o movimento do animal em torno da Arena antes, durante e após a apresentação do estímulo. Use o software comercialmente disponível (consulte a tabela de materiais) com uma capacidade de rastreamento manual para rastrear a posição da cabeça do mouse em cada quadro de vídeo, que gerou a coordenação X e Y a cada 1/60 ms. outro software de rastreamento de movimento inclui Fiji (NIH )40 e ethovision (noldus).
- Calcule a velocidade ea distância do mouse a partir do refúgio. Se a imagem da arena for distorcida devido ao ângulo de vídeo, corrija a coordenação X e Y antes do cálculo (Figura 2).
- Compare os parâmetros antes e após o início do estímulo iminente para determinar como o mouse respondeu aos estímulos, seja por congelamento, fugindo ou demonstrando nenhuma alteração no comportamento29. Definir congelamento como episódios em que a velocidade era inferior a 20 mm/s para 0,5 s ou mais. Defina o vôo como episódios em que a velocidade aumentou para 400 mm/s ou maior e terminou com o mouse no refúgio. As definições de congelamento e de voo foram baseadas nas estabelecidas por Franceschi et al.29
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Representative Results
Um rato com olhos sadios foi coloc no cerco e permitido ao aclimatar por 10 minutos. A arena com o monitor no teto foi mantida condições de luz mesópica (7 x 105 fótons/μm2/s). Durante o período de aclimatação, o rato explorou o espaço e encontrou a cúpula opaca como um refúgio. Quando o mouse se afastou do refúgio, a captura de vídeo começou, seguida pela iniciação do estímulo visual. Em resposta ao estímulo iminente, a maioria dos camundongos correu para a cúpula (resposta de voo), que foi observada em 30 dos 31 camundongos (97%). Alguns dos camundongos exibiram respostas de congelamento antes de fugiam (19/31 camundongos, 61%). O estímulo iminente reduziu a condição de luz 1 log (6 x 105 fótons/μm2/s).
Os clipes de vídeo capturados foram analisados usando um software de análise comercial com uma função de rastreamento manual (Image Pro Plus) ou FIJI (NIH). Usando o recurso de rastreamento, a posição do mouse foi identificada em cada quadro do vídeo (60 frames/s) antes, durante e após os estímulos de iminente. Analisamos as mudanças de velocidade ao longo do tempo, bem como a distância até o abrigo (Figura 3). Quando o vôo ocorreu, a velocidade aumentou abruptamente e a distância ao abrigo reduziu-se conformemente. Em contraste, a velocidade estava perto de 0 mm/s quando os camundongos congelaram. A latência desde o início dos estímulos de expansão até o voo variou de 0,1 a 6,0 segundos (média de 2,2 s, 30 camundongos). A escala da velocidade máxima para a resposta do vôo era 500-3000 mm/s (30 ratos).
Figura 1 : Sistema experimental. (A) esquemático do invólucro dos estímulos em expansão. Um monitor de computador (21 ") abrange o tecto. Há uma cúpula opaca em um canto do recinto em que um mouse pode se refugiar. Um monitor de vídeo com uma lente grande angular captura o comportamento do mouse. (B) visão geral de toda a nossa configuração. O monitor secundário duplica a imagem que mostra na exposição do estímulo. (C) diagrama do estímulo iminente. O estímulo iminente começa a 2 ° (1,15 cm) e detém neste tamanho para 250 MS. em seguida, expande-se para 50 ° (30,8 cm) ao longo do 250 MS e permanece 50 ° para um adicional de 500 ms. esta sequência 1s, em seguida, repete mais 9 vezes antes de terminar. D) diagrama dos cálculos dos estímulos. A altura da gaiola dita o tamanho necessário do começo e da extremidade (nos centímetros) do estímulo a fim produzir um estímulo que se expanda de 2 ° a 50 ° quando diretamente acima do rato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Cálculos de análise. Cálculos para corrigir inclinação da lente grande angular. Devido à colocação da câmera, o piso da arena aparece como um trapezoide em vez de um retângulo (à esquerda). Portanto, as coordenadas X e Y do mouse devem ser corrigidas para analisar com precisão a posição do mouse (Mid). Usando a geometria de triângulos congruentes, é possível encontrar o quanto a coordenada x deve mudar para representar corretamente o movimento do mouse no espaço tridimensional (à direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Respostas representativas aos estímulos de iminente. (A) um exemplo de movimento de um rato rastreado dentro da arena. Um círculo vermelho mostra a cúpula onde o mouse fugiu para e permaneceu até que o iminente desapareceu. 1 = ponto de partida da posição do mouse quando a captura de vídeo começou. 2 = movimento antes do início do estímulo quando o rato explorou a arena. 3 = estímulo iminente iniciado. O mouse correu para a cúpula (mostrada por uma linha tracejada vermelha). 4 = o rato permaneceu na cúpula até e após a terminação do estímulo. (B) a velocidade muda em função do tempo para este rato. A linha pontilhada indica quando a estimulação de iminente começou. A duração do estímulo é indicada pelo fundo amarelo. O ciclo de 10 segundos completo não é mostrado aqui desde que os ratos permaneceram estacionários no refúgio para a duração inteira do estímulo. (C) distância da cúpula ao longo do tempo para o mesmo rato em (a) e (B). (D) e (e) a velocidade e distância para a cúpula para um mouse que exibiu a reação de congelamento (duração de congelamento mostrada pela seta dupla face vermelha) antes do voo. A velocidade foi reduzida em comparação com o controle (antes de iminente). A distância para a cúpula não mudou durante este período. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com o sistema de estímulo visual iminente, a maioria (97%) do olho-ratos saudáveis mostraram a resposta do vôo. Um dos 29 ratos não mostraram uma resposta de voo óbvia. No entanto, o mouse caminhou em direção à cúpula e permaneceu perto dele até o aparecimento desaparecer, indicando que o mouse era pelo menos cauteloso quando os estímulos de iminente ocorreram. Conseqüentemente, os estímulos de aparecimento eliciaram consistentemente respostas inatas do medo em ratos saudável-eyed. Por outro lado, três camundongos cegos não mostraram nenhuma resposta ao aparecimento (resultados preliminares). Tomados em conjunto, demonstramos que os experimentos de iminente são um teste de visão útil e consistente para camundongos.
Definimos a velocidade dos estímulos em expansão em 192 graus/s. Franceschi et al.29 examinaram as respostas em expansão em velocidades variáveis, 5 a 84 graus/s e observaram respostas de congelamento preferencialmente em níveis mais baixos de velocidade. Yilmaz e Meister28 observaram respostas de voo em 35 a 350 graus/s; no entanto, a latência do voo foi maior em velocidades mais elevadas. Portanto, para evocar respostas de voo consistentes, o aparecimento deve estar a uma velocidade de 50 graus/s ou acima. Os estímulos de Looming podem ser gerados facilmente mesmo com software padrão da apresentação. No entanto, tal software não pode criar velocidades mais elevadas de estímulos de iminente. Em vez disso, usamos MatLab e PsychToolbox3 para criar os estímulos visuais em 192 graus/s.
Nós aclimatamos os camundongos por 10-15 min antes dos estímulos de iminente, que é o tempo de aclimatação que os pesquisadores anteriores descreveram 28,29,39. Além disso, testamos se a aclimatação no dia anterior mudou o comportamento iminente. Colocamos os camundongos no recinto por 10 min sem estímulos de aparecimento no dia anterior aos estímulos de iminente. Esta aclimatação reduziu significativamente a latência do voo (p < 0, 1, n = 7 camundongos, dados não mostrados). Embora 10 min de aclimatação no dia do aparecimento consistentemente causado respostas de vôo, 1 dia de aclimatação prévia diminuiu a latência das respostas de vôo.
Existem algumas limitações para o uso de estímulos de iminente como um teste de visão. Primeiro, é difícil testar um olho de cada vez. A menos que suturar um olho, ambos os olhos são testados em conjunto. Em segundo lugar, os mecanismos da resposta comportamental iminente não foram plenamente estabelecidos. Na retina, Yilmaz e Meister 28 SUGERIRAM que off-dsgcs ventral (células ganglionares de direção seletiva), mas não em-dsgcs, transmitem os sinais de iminente para causar respostas. Esta conclusão levantou-se de seus resultados que os ratos responderam aos estímulos de aparecimento escuros, mas não ao iminente branco. No cérebro, Wei et al.36 e Shang et al.37 demonstraram que as vias do colículo superior por meio da amígdala e do cinza periaquedutal são responsáveis pelo aparecimento do Looming. No entanto, mais estudos devem ser conduzidos para confirmar essas investigações.
Apesar de existirem algumas limitações em relação ao experimento iminente, o estímulo visual iminente gera uma resposta de medo consistente e robusta em camundongos e deve ser um teste útil da visão do mouse que requer treinamento mínimo do experimentador.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas subvenções NIH R01 EY028915 (TI) e RPB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10.1" monitor (2° display) | Elecrow | Elecrow 10.1 Inch Raspberry Pi 1920x1080p Resolution Display | |
| 14" Business Class Laptop 5490 | Dell | 84 / rcrc961481-4860836 | |
| 20" x 50" Absorbant Liners | Fisher Scientific | AL2050 | works well to protect floor of arena, could use any type of liner |
| 21.5" monitor (1° display) | Acer | Acer R221Q bid 21.5-inch IPS Full HD Display | |
| CCD Camera | Lumenera Corporation | Infiniyy3S-1UR | excellent for behavioral studies due to high fps rate (60 fps) |
| Enclosure (alminum frames and PVC panels) | 80/20 Inc. | 4x cat.#9010, 4x cat.#9005, 1x cat.#9000, 5x cat.#65-2616 | excellent, used quick build tab to find PVC, joints, and frame |
| Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Excel Spreadsheet Software | Microsoft Office | user friendly and widespread knowledge of Microsoft Office software | |
| Freearm | Amazon | used to mount camera to the table, could use any mountable extendable arm | |
| ImagePro Premiere 3D | Media Cybernetics | version 9.3 | good program, could use some updating with the automated tracking feature |
| Matlab software (Psychotoolbox 3) | MathWorks | Matlab R2018b 64-bit (9.5.0.944444) | excellent software to generate pattern stimuli of any conditions |
| SteamPix sorftware | Norpix | StreamPix 7 64-bit Single Camera | works well, a few problems with frame dropping but good customer service |
| WD My Book External Hard Drive | Western Digital | WDBBGB0080HBK hard drive 8 TB USB 3.0 | necessary if using .avi files with no compression codec due to large size of files |
| Wide angle lens | Navitar | NMV-5M23 | excellent and necessary to capture entire arena |
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