Summary
Per esaminare la visione del mouse, abbiamo condotto un test incombente. I topi sono stati collocati in una grande Arena quadrata con un monitor sul suo soffitto. Lo stimolo visivo incombente ha costantemente evocato le reazioni di congelamento o di volo nei topi.
Abstract
Il sistema visivo nel sistema nervoso centrale elabora diversi segnali visivi. Anche se la struttura complessiva è stata caratterizzata dalla retina attraverso il nucleo geniculare laterale alla corteccia visiva, il sistema è complesso. Sono stati condotti studi cellulari e molecolari per chiarire i meccanismi alla base dell'elaborazione visiva e, per estensione, i meccanismi di malattia. Questi studi possono contribuire allo sviluppo di sistemi visivi artificiali. Per convalidare i risultati di questi studi, è necessario il test di visione comportamentale. Qui, mostriamo che l'esperimento di stimolazione incombente è un test di visione del mouse affidabile che richiede una configurazione relativamente semplice. L'esperimento incombente è stato condotto in un grande recinto con un riparo in un angolo e un monitor del computer situato sul soffitto. Una telecamera CCD posizionata accanto al monitor del computer è servita per osservare il comportamento del mouse. Un topo è stato collocato nel recinto per 10 minuti e ha permesso di acclimatarsi ed esplorare i dintorni. Poi, il monitor proiettato uno stimolo incombente derivato dal programma 10 volte. Il topo rispose agli stimoli sia congelando che fuggendo al nascondiglio. Il comportamento del mouse prima e dopo gli stimoli incombenti è stato registrato, e il video è stato analizzato utilizzando il software di Motion Tracking. La velocità del movimento del mouse cambiò significativamente dopo gli stimoli incombenti. Al contrario, nessuna reazione è stata osservata nei topi ciechi. I nostri risultati dimostrano che il semplice esperimento incombente è un test affidabile della visione del mouse.
Introduction
Il sistema visivo inizia alla retina, dove i segnali visivi vengono catturati dai fotorecettori, canati alle cellule bipolari (2 neuroniND-Order), e infine passati alle cellule del ganglio (3 neuroni ordine diRd). I neuroni 2ND-e 3Rd-Order retinici sono pensati per formare più percorsi neurali che trasmettono particolari aspetti della segnalazione visiva come il colore, il movimento o la forma. Queste diverse caratteristiche visive sono trasmesse al nucleo geniculare laterale e alla corteccia visiva. Al contrario, i segnali visivi che conducono al movimento degli occhi vengono inviati al colliculus superiore. Classicamente, sono stati identificati due percorsi di retino-corticale: il magnocellulare e le vie parvocelliche. Questi percorsi codificano gli oggetti in movimento e fissi, rispettivamente, e la loro esistenza incarna il concetto di base di elaborazione parallela1,2,3,4,5, 6. il Recentemente, più di 15 tipi di cellule bipolari7,8,9,10,11 e cellule del ganglio12,13,14 ,15,16 sono stati segnalati nella retina di molte specie, tra cui la retina primate. Queste cellule si distinguono non solo per gli aspetti morfologici, ma anche per l'espressione di marcatori distinti egeni8,10,17,18, suggerendo che varie caratteristiche di i segnali visivi vengono elaborati in parallelo, il che è più complicato di quanto originariamente previsto.
Le tecnologie cellulari e molecolari hanno contribuito alla nostra comprensione dell'elaborazione visiva e dei potenziali meccanismi di malattia che possono derivare dall'elaborazione visiva aberrante. Tale comprensione può contribuire allo sviluppo di occhi artificiali. Sebbene gli esami e le analisi cellulari offrano una conoscenza approfondita a livello cellulare, una combinazione di esperimenti comportamentali e esperimenti cellulari accrescerebbe significativamente la nostra comprensione attuale dei processi visivi di minuti. Per esempio, Yoshida et al.19 ha trovato che le cellule amacrine starburst sono i neuroni chiave per il rilevamento del movimento nella retina del mouse. Dopo esperimenti cellulari, hanno eseguito l'esperimento comportamentale di nistagmo optocinetico (OKN) per mostrare che i topi mutanti in cui le cellule amacrine di starburst erano disfunzionali non rispondevano agli oggetti in movimento, confermando così il loro cellulare Indagini. Inoltre, Pearson et al.20 ha condotto il trapianto di fotorecettori nella retina del topo per ripristinare la visione nei topi malati. Hanno condotto non solo esperimenti cellulari, ma anche misurato il comportamento del mouse attraverso l'uso di registrazioni di risposta optomotor e attività di acqua-labirinto permettendo così Pearson et al. per verificare che i fotorecettori trapiantati hanno ripristinato la visione in precedenza cieco plurale di "mouse". Presi insieme, gli esperimenti comportamentali sono strumenti forti per valutare la visione del mouse.
Sono disponibili diversi metodi per misurare la visione del mouse. Questi metodi hanno vantaggi e limitazioni. In vivo ERG fornisce informazioni sul fatto che la retina del topo, in particolare i fotorecettori e le cellule bipolari, risponda adeguatamente agli stimoli di luce. ERG può essere testato sia sotto scotopica che in condizioni fotopiche21,22. Tuttavia, ERG richiede anestesia, che potrebbe influenzare la misura di uscita23. Il riflesso optocinetico (OKR) o la risposta optomotor (OMR) è un metodo robusto per valutare la sensibilità al contrasto e la risoluzione spaziale, entrambi componenti funzionali della visione del mouse. Tuttavia, OKR richiede un intervento chirurgico per attaccare un dispositivo di fissazione al cranio del mouse24. OMR non richiede chirurgia né addestramento del topo; Tuttavia, richiede una formazione per consentire a uno sperimentatore di rilevare in modo soggettivo i movimenti sottili della testa del topo in risposta a una grata in movimento in un tamburo ottico 25,26. La luce riflessa della pupilla misura la costrizione della pupilla in risposta agli stimoli di luce, che non richiede anestesia e presenta risposte obiettive e solide 19. Sebbene il riflesso della pupilla simuli la risposta della luce retinica in vivo, il riflesso è mediato principalmente dalle cellule del ganglio retinico (ipRGCs) 27, intrinsecamente fotosensibili. Poiché gli ipRGCs rappresentano una piccola minoranza di RGC e non fungono da cellule gangliari convenzionali che formano l'immagine, questa misura non fornisce informazioni relative alla maggior parte delle cellule del ganglio.
L'esperimento di luce incombente non è stato precedentemente considerato un test importante per misurare la visione del mouse. Tuttavia, è anche un test di visione robusto e affidabile su varie specie, come il mouse28,29, pesce zebra30, Locust31,32e Human33,34, 35. importante, l'esperimento incombente è uno dei pochi metodi per testare il percorso di formazione dell'immagine-non è un percorso riflesso-dato che i sistemi visivi e limbici nel sistema nervoso centrale sono coinvolti in questo circuito36, 37,38. Abbiamo istituito un sistema di stimolo visivo incombente e abbiamo dimostrato la sua capacità di suscitare il rilevamento del movimento nel mouse, che usiamo come proxy per valutare l'intattezza del sistema visivo del mouse.
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Protocol
Tutti gli esperimenti e la cura degli animali sono stati condotti in conformità con il protocollo approvato dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso la Wayne State University (protocollo n. 17-11-0399).
1. preparazione per l'esperimento
- Costruire un recinto rettangolare aperto-coperchio per ospitare il mouse durante la presentazione stimoli visivi incombenti. Abbiamo costruito un involucro di 40 cm x 50 cm x 33 cm con telaio in alluminio e pannelli in PVC (Figura 1a, B). Posare un foglio di carta per coprire l'intero piano del recinto per garantire una facile pulizia tra le prove. Aggiungere un riparo opaco in un angolo del recinto con un ingresso di fronte al centro dell'Arena per un facile ingresso e uscita.
- Configura una fotocamera con un obiettivo grandangolare per catturare il comportamento del mouse. Fissare la telecamera a un supporto montato su tavolo adiacente all'involucro. Per catturare video di qualità migliore, utilizzare una frequenza di fotogrammi della fotocamera di 60 FPS o superiore.
- Impostare un monitor del computer sopra l'involucro. Poiché il monitor non poteva essere visto dall'esterno, veniva preparato un secondo monitor, che duplicava le immagini mostrate sul monitor principale.
- Prepara un modello per la proiezione. Un modo per farlo è quello di utilizzare il PsychToolbox3 all'interno del software MatLab per codificare per un cerchio nero in espansione (Figura 1C). Impostare lo stimolo per iniziare con un angolo visivo di 2 ° ed espandersi a 50 ° su 250 ms; questi parametri determinano la velocità di stimolo (Vedi Figura 1D per il calcolo dell'angolo visivo). Impostare il codice per ripetere lo stimolo 10 volte con un intervallo di 1 s.
Nota: lo stimolo ha cominciato ogni ripetizione immediatamente al termine della presentazione precedente. Per ulteriori informazioni sulla presentazione degli stimoli, consultare la sezione 3. - Selezionare i topi di interesse per gli stimoli incombenti. Qui, utilizzare 32 topi con gli occhi sani di uno sfondo C57, maschio e femmina, 4 a 14 settimane di età. Inoltre, utilizzare 3 topi ciechi (cataratta severa in entrambi gli occhi) per valutare se la risposta allo stimolo incombente era veramente un comportamento visivamente guidato. Questi topi ciechi non avevano riflessi di luce pupillare e nessuna risposta optomotor.
2. acclimatazione del mouse
- Posizionare un mouse nel recinto e lasciarlo esplorare liberamente l'ambiente circostante. Se possibile, provate a minimizzare lo stress durante il trasferimento degli animali utilizzando il dorso della mano libera come luogo di riposo per il mouse invece di lasciarlo appendere senza supporto. Il mouse dovrebbe trovare l'intero recinto per essere sicuro e dovrebbe scoprire il nascondiglio. Far cadere qualche pellet di cibo in un angolo di fronte al rifugio per incoraggiare il topo a rimanere fuori dal rifugio.
- Consenti al mouse di acclimatarsi ovunque da 7 a 15 min29,39. Abbiamo permesso 10 minuti di acclimatazione prima dell'inizio dello stimolo. Inoltre, 10 minuti di acclimatazione un giorno prima dell'esperimento possono alleviare i topi.
3. proiezione di stimoli visivi incombenti
- Prima di inserire il mouse nell'Arena, assicurati che il codice di stimolo sia pronto per essere eseguito per facilitare il minor numero possibile di modifiche di illuminazione mentre il mouse si trova nell'involucro. Una volta che il software è pronto per l'esecuzione, posizionare delicatamente il mouse nell'involucro.
- 10 secondi prima della stimolazione, avviare la cattura video.
- Inizia gli stimoli visivi incombenti quando il mouse è lontano dal riparo e si muove liberamente nell'arena aperta. Attendere 10 secondi dopo l'ultima presentazione di stimolo per terminare la registrazione.
- Iniziare la presentazione di stimolo quando il mouse è nell'angolo più lontano dal rifugio. Tuttavia, quando i topi sembrano non disposti a esplorare l'angolo lontano, presentano lo stimolo quando il topo si trova in un altro angolo dell'Arena. Questo non sembra fare la differenza nella risposta comportamentale animale.
- Ritrasferisci il mouse nella gabbia originale. Pulire l'involucro per il mouse successivo spruzzando le pareti e rifugio con 70% etanolo e asciugandolo verso il basso. Sostituire la fodera della carta se sporca e riposizionare il rifugio nella stessa posizione iniziale se spostato durante il trasferimento degli animali e la pulizia dell'involucro.
4. analisi video
- Salvare il video clip per ogni mouse in formato. avi senza compressione di file al fine di garantire alcuna perdita di dati durante il trasferimento al software di analisi.
Nota: la mancanza di compressione porterà a dimensioni del file più grandi; Pertanto, utilizzare un disco rigido esterno per l'archiviazione. - Utilizzare il software di analisi per tracciare il movimento dell'animale intorno all'Arena prima, durante e dopo la presentazione dello stimolo. Utilizzare il software disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) con una capacità di tracciamento manuale per tracciare la posizione della testa del mouse in ogni fotogramma video, che ha generato la coordinazione X e Y ogni 1/60 ms. altri software di Motion-Tracking include Fiji (NIH )40 e etovision (Noldus).
- Calcola la velocità e la distanza del mouse dal rifugio. Se l'immagine dell'Arena è distorta a causa dell'angolazione del video, correggere la coordinazione X e Y prima del calcolo (Figura 2).
- Confronta i parametri prima e dopo l'imminente insorgenza di stimoli per determinare come il topo ha risposto agli stimoli, sia congelando, fuggendo o dimostrando alcun cambiamento nel comportamento29. Definire il congelamento come episodi in cui la velocità era inferiore a 20 mm/s per 0,5 s o più. Definisci il volo come episodi in cui la velocità è aumentata a 400 mm/s o superiore e si è conclusa con il mouse nel rifugio. Le definizioni per il congelamento e il volo erano basate su quelle fissate da Franceschi et al.29
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Representative Results
Un topo con occhi sani è stato collocato nel recinto e ha permesso di acclimatarsi per 10 min. L'Arena con il monitor sul soffitto è stata mantenuta in condizioni di luce mesopica (7 x 105 fotoni/μm2/s). Durante il periodo di acclimatazione, il topo esplorò lo spazio e trovò la cupola opaca come rifugio. Quando il mouse si allontanò dal rifugio, la cattura video iniziò, seguita dall'inizio dello stimolo visivo. In risposta allo stimolo incombente, la maggior parte dei topi si è imbattuto nella cupola (risposta di volo), che è stata osservata in 30 su 31 topi (97%). Alcuni dei topi hanno esposto le risposte congelano prima di fuggire (19/31 topi, 61%). Lo stimolo incombente ha ridotto la condizione di luce 1 log (6 x 105 fotoni/μm2/s).
I video clip acquisiti sono stati analizzati utilizzando un software di analisi commerciale con una funzione di tracciamento manuale (Image Pro Plus) o FIJI (NIH). Utilizzando la funzione di tracciamento, la posizione del mouse è stata identificata in ogni fotogramma del video (60 fotogrammi/s) prima, durante e dopo gli stimoli incombenti. Abbiamo analizzato i cambi di velocità nel tempo così come la distanza dal riparo (Figura 3). Quando si è verificato il volo, la velocità è bruscamente aumentata e la distanza dal riparo ridotto di conseguenza. Al contrario, la velocità era vicino 0 mm/s quando i topi congelato. La latenza dall'insorgenza degli stimoli incombenti al volo variava da 0,1 a 6,0 secondi (media 2,2 s, 30 topi). La gamma di velocità massima per la risposta di volo era di 500-3000 mm/s (30 topi).
Figura 1 : Sistema sperimentale. A) schema dell'involucro degli stimoli incombenti. Un monitor del computer (21 ") copre il soffitto. C'è una cupola opaca in un angolo del recinto in cui un topo può rifugiarsi. Un monitor video con un obiettivo grandangolare cattura il comportamento del mouse. (B) visione complessiva dell'intera configurazione. Il monitor secondario Duplica l'immagine visualizzata sul display di stimolo. (C) diagramma dello stimolo incombente. Lo stimolo incombente inizia a 2 ° (1,15 cm) e tiene a questa dimensione per 250 ms. si espande poi a 50 ° (30,8 cm) nel corso di 250 MS e rimane 50 ° per un ulteriore 500 ms. questa sequenza 1S quindi ripete altre 9 volte prima della terminazione. (D) diagramma dei calcoli di stimolo. L'altezza della gabbia determina la dimensione iniziale e finale necessaria (in centimetri) dello stimolo per produrre uno stimolo che si espande da 2 ° a 50 ° quando direttamente sopra il mouse. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2 : Calcoli di analisi. Calcoli per correggere l'inclinazione da un obiettivo grandangolare. A causa del posizionamento della fotocamera, il pavimento dell'Arena appare come un trapezoidale invece di un rettangolo (a sinistra). Pertanto, le coordinate X e Y del mouse devono essere corrette per analizzare accuratamente la posizione del mouse (MID). Utilizzando la geometria dei triangoli congruenti, è possibile trovare quanto la coordinata x deve cambiare per rappresentare correttamente il movimento del mouse nello spazio tridimensionale (a destra). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3 : Risposte rappresentative agli stimoli incombenti. (A) un esempio di movimento di un topo tracciato all'interno dell'Arena. Un cerchio rosso Mostra la cupola dove il topo fuggì e rimase fino a quando il incombente scomparve. 1 = punto di partenza della posizione del mouse quando l'acquisizione video è iniziata. 2 = movimento prima dell'inizio dello stimolo quando il topo esplorava l'Arena. 3 = è iniziato lo stimolo incombente. Il mouse si precipitò verso la cupola (mostrata da una linea tratteggiata rossa). 4 = il mouse rimase nella cupola fino a quando e dopo la terminazione dello stimolo. (B) la velocità cambia in funzione del tempo per questo mouse. La linea tratteggiata indica quando è iniziata la stimolazione incombente. La durata dello stimolo è indicata dallo sfondo giallo. Il ciclo completo di 10 secondi non è mostrato qui poiché i topi sono rimasti fermi nel rifugio per tutta la durata dello stimolo. C) distanza dalla cupola nel tempo per lo stesso mouse in (a) e (B). (D) ed (e) la velocità e la distanza dalla cupola per un topo che ha esposto la reazione di congelamento (durata di congelamento mostrata dalla freccia rossa a doppia faccia) prima del volo. La velocità è stata ridotta rispetto al controllo (prima dell'incombente). La distanza dalla cupola non è cambiata durante questo periodo. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Con l'incombente sistema di stimoli visivi, la maggioranza (97%) di sani occhi-topi ha mostrato la risposta di volo. Uno dei 29 topi non ha mostrato una risposta di volo ovvia. Tuttavia, il topo camminava verso la cupola e rimase vicino fino a quando incombeva scomparendo, indicando che il topo era almeno prudente quando si verificavano gli stimoli incombenti. Pertanto, gli stimoli incombenti hanno costantemente suscitato le risposte di paura innata nei topi con gli occhi sani. Dall'altro lato, tre topi ciechi non hanno mostrato alcuna risposta all'incombente (risultati preliminari). Nel loro insieme, dimostriamo che gli esperimenti incombenti sono un test di visione utile e coerente per i topi.
Impostiamo la velocità degli stimoli incombenti a 192 gradi/s. Franceschi et al.29 ha esaminato le risposte incombenti a velocità variabili, da 5 a 84 gradi/s e ha osservato le risposte di congelamento preferenzialmente a livelli di velocità inferiori. Yilmaz e Meister28 hanno osservato le risposte di volo a 35 a 350 gradi/s; Tuttavia, la latenza di volo era più lunga a velocità più elevate. Pertanto, per evocare risposte di volo coerenti, incombente dovrebbe essere ad una velocità di 50 gradi/s o superiore. Gli stimoli incombenti possono essere generati facilmente anche con software di presentazione standard. Tuttavia, tale software non può creare velocità più elevate di stimoli incombenti. Abbiamo invece usato MatLab e PsychToolbox3 per creare gli stimoli visivi a 192 gradi/s.
Abbiamo acclimatato i topi per 10-15 min prima gli stimoli incombenti, che è il tempo di acclimazione precedenti ricercatori hanno descritto 28,29,39. Abbiamo inoltre testato se l'acclimatazione il giorno prima ha cambiato il comportamento incombente. Abbiamo messo i topi nel recinto per 10 minuti senza stimoli incombenti il giorno prima degli stimoli incombenti. Questa acclimatazione ha ridotto significativamente la latenza di volo (p < 0,01, n = 7 topi, dati non mostrati). Anche se 10 minuti di acclimatazione il giorno di incombente costantemente causato risposte di volo, 1 giorno prima acclimatazione diminuito la latenza delle risposte di volo.
Ci sono alcune limitazioni per l'utilizzo di stimoli incombenti come un test di visione. In primo luogo, è difficile testare un occhio alla volta. A meno che la sutura di un occhio, entrambi gli occhi sono testati insieme. In secondo luogo, i meccanismi della risposta in incombente comportamento non sono stati pienamente stabiliti. Nella retina, Yilmaz e Meister 28 suggerirono che ventrale off-dsgcs (cellule gangliari selettivi della direzione), ma non su-dsgcs, trasmettano i segnali incombenti per causare risposte. Questa conclusione è nata dai risultati che i topi hanno risposto agli stimoli scuri incombenti, ma non al bianco incombente. Nel cervello, Wei et al.36 e Shang et al.37 hanno dimostrato che i percorsi dal collicolo superiore attraverso l'amigdala e il grigio periacquedotto sono responsabili per l'incombente. Tuttavia, ulteriori studi dovrebbero essere condotti per confermare queste indagini.
Anche se esistono alcune limitazioni rispetto all'esperimento incombente, l'incombente stimolo visivo genera una risposta di paura coerente e robusta nei topi e dovrebbe essere un utile test della visione del topo che richiede una formazione minima dello sperimentatore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 EY028915 (TI) e sovvenzioni RPB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10.1" monitor (2° display) | Elecrow | Elecrow 10.1 Inch Raspberry Pi 1920x1080p Resolution Display | |
| 14" Business Class Laptop 5490 | Dell | 84 / rcrc961481-4860836 | |
| 20" x 50" Absorbant Liners | Fisher Scientific | AL2050 | works well to protect floor of arena, could use any type of liner |
| 21.5" monitor (1° display) | Acer | Acer R221Q bid 21.5-inch IPS Full HD Display | |
| CCD Camera | Lumenera Corporation | Infiniyy3S-1UR | excellent for behavioral studies due to high fps rate (60 fps) |
| Enclosure (alminum frames and PVC panels) | 80/20 Inc. | 4x cat.#9010, 4x cat.#9005, 1x cat.#9000, 5x cat.#65-2616 | excellent, used quick build tab to find PVC, joints, and frame |
| Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Excel Spreadsheet Software | Microsoft Office | user friendly and widespread knowledge of Microsoft Office software | |
| Freearm | Amazon | used to mount camera to the table, could use any mountable extendable arm | |
| ImagePro Premiere 3D | Media Cybernetics | version 9.3 | good program, could use some updating with the automated tracking feature |
| Matlab software (Psychotoolbox 3) | MathWorks | Matlab R2018b 64-bit (9.5.0.944444) | excellent software to generate pattern stimuli of any conditions |
| SteamPix sorftware | Norpix | StreamPix 7 64-bit Single Camera | works well, a few problems with frame dropping but good customer service |
| WD My Book External Hard Drive | Western Digital | WDBBGB0080HBK hard drive 8 TB USB 3.0 | necessary if using .avi files with no compression codec due to large size of files |
| Wide angle lens | Navitar | NMV-5M23 | excellent and necessary to capture entire arena |
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