Summary
Wir präsentieren eine Methode, die für die großflächige enzymatische Synthese und Reinigung spezifischer Enantiomere und Regioisomere von Epoxiden von Arachidonsäure (AA), Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) unter Verwendung eines bakteriellen Cytochroms nützlich ist. P450-Enzym (BM3).
Abstract
Die epoxidierten Metaboliten verschiedener mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFAs), die als Epoxidfettsäuren bezeichnet werden, haben eine Vielzahl von Rollen in der menschlichen Physiologie. Diese Metaboliten werden endogen durch die Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen hergestellt. Aufgrund ihrer vielfältigen und starken biologischen Wirkung besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung dieser Metaboliten. Die Bestimmung der einzigartigen Rolle dieser Metaboliten im Körper ist eine schwierige Aufgabe, da die Epoxidfettsäuren zunächst in signifikanten Mengen und mit hoher Reinheit erhalten werden müssen. Die Gewinnung von Verbindungen aus natürlichen Quellen ist oft arbeitsintensiv, und lösliche Epoxidhydrolasen (sEH) hydrolysieren die Metaboliten schnell. Andererseits ist die Erlangung dieser Metaboliten über chemische Reaktionen sehr ineffizient, da es schwierig ist, reine Regioisomere und Enantiomere, niedrige Erträge und eine umfangreiche (und teure) Reinigung zu erhalten. Hier präsentieren wir eine effiziente enzymatische Synthese von 19(S), 20(R)- und 16(S),17(R)-epoxydocosapentaennoic acids (EDPs) aus DHA via Epoxidation mit BM3, einem bakteriellen CYP450-Enzym, das ursprünglich aus Bacillus isoliert wurde Megaterium (das leicht in Escherichia coliausgedrückt wird). Die Charakterisierung und Bestimmung der Reinheit erfolgt mit DerKernspinresonanzspektroskopie (NMR), der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Massenspektrometrie (MS). Dieses Verfahren veranschaulicht die Vorteile der enzymatischen Synthese von PUFA-Epoxid-Metaboliten und ist auf die Epoxidation anderer Fettsäuren anwendbar, einschließlich Arachidonsäure (AA) und Eicosapentaensäure (EPA), um die analoge epoxyeicosatrienoische Säuren (EETs) bzw. Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs).
Introduction
Da das Interesse an der Rolle, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren (insbesondere Omega-3 und Omega-6 mehrfach ungesättigte Fettsäuren) in der menschlichen Biologie spielen, in den letzten Jahren zugenommen hat, haben Forscher die breite Palette attraktiver Vorteile, die ihre Metaboliten ausstellen. Insbesondere Epoxid-Fettsäure-Metaboliten, die von der Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen produziert wurden, waren ein großer Schwerpunkt. Beispielsweise spielen viele PUFA-Epoxide, einschließlich Epoxyeicosatrienosäuren (EETs), Epoxydocosapentaensäuren (EDP) und Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs), eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Blutdruck und Entzündungen1,2 , 3 , 4 , 5. Interessanterweise haben die spezifischen Enantiomere und Regioisomere von AA- und EPA-Epoxiden bekanntlich unterschiedliche Auswirkungen auf die Vasokonstriktion6,7. Während die physiologischen Wirkungen der Enantiomere und Regioisomere von EETs und EEQs dokumentiert sind, ist wenig über die Wirkung der analogen Epoxidokanosäuren (EDP) aus DHA bekannt. Die weitverbreitete Verwendung von Fischöl8, das sowohl an EPA als auch an DHA reich ist, hat ebenfalls das Interesse an DEN EDP9geweckt. Die Vorteile dieser Ergänzungen werden geglaubt, um teilweise aufgrund der nachgelagerten DHA-Metaboliten (16,17-EDP und 19,20-EDP ist die am häufigsten vorkommende), weil in vivo Niveaus von EDP sehr gut mit der Menge an DHA in der Ernährung10 , 11.
Die Untersuchung der Mechanismen und Ziele dieser Epoxidfettsäuren durch Metabolomik, chemische Biologie und andere Methoden hat sich als herausforderunglich erwiesen, zum Teil, weil sie als Mischungen von Regio- und Stereo-Isomeren existieren, und eine Methode zur Gewinnung reiner Mengen der Enantiomere und Regioisomer erforderlich sind. Herkömmliche Mittel zur chemischen Synthese dieser Verbindungen haben sich als unwirksam erwiesen. Die Verwendung von Peroxysäuren wie Meta-Chloroperoxybenzoesäure für die Epoxidation hat viele Nachteile, insbesondere den Mangel an Epoxidationsselektivität, der eine teure und sorgfältige Reinigung einzelner Regioisomere und Enantiomere erfordert. Die Gesamtsynthese von DHA- und EPA-Metaboliten ist möglich, leidet aber auch unter Nachteilen, die es für großflächige Syntheseen wie hohe Kosten und niedrige Erträge12,13machen. Effiziente Gesamtproduktion kann mit enzymatischer Synthese erreicht werden, da enzymatische Reaktionen regio- und stereoselektiv sind14. Studien zeigen, dass die enzymatische Epoxidation von AA und EPA (mit BM3) sowohl regioselektiv als auch enantioselektivist 15,16,17,18, aber dieses Verfahren wurde nicht mit DHA oder an einem großen skala. Das übergeordnete Ziel unserer Methode war es, diese chemoenzymatische Epoxidation zu skalieren und zu optimieren, um schnell signifikante Mengen an reinen Epoxidfettsäuren als ihre individuellen Enantiomere zu produzieren. Mit der hier vorgestellten Methode haben Forscher Zugang zu einer einfachen und kostengünstigen Strategie für die Synthese von EDV und anderen PUFA-Epoxidmetaboliten.
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Protocol
VORSICHT: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS), bevor Sie die aufgeführten Chemikalien verwenden.
1. Ausdruck des Wildtyps BM3
- Inokulat pBS-BM3 transfizierte DH5- E. coli (eine großzügige Spende von Dr. F. Ann Walker) in 5 ml steriler LB-Brühe mit 0,5 mg Ampicillin in einem 20 ml Kulturrohr.
- Die Zellkultur in einem Shaker bei 37 °C für 24 h bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Fügen Sie die Nachtstarterkultur (5 ml) und 100 mg Ampicillin zu 1 L steriler LB-Brühe in einem Fernbach- oder Erlenmeyerkolben hinzu. Bei 37 °C bei 200 Umdrehungen von 200 Umdrehungen/ minute schütteln, dann bei 30 °C für 18 h bei 200 Rpm.
- Sammeln und zentrifugieren Sie die Zellkultur bei 4 °C für 10 min bei 1.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet bei -78 °C bis zur Enzymreinigung.
HINWEIS: Der Überstand kann entweder durch Behandlung mit Bleichmittel chemisch sterilisiert oder mit einem Autoklaven sterilisiert und dann in den Abfluss gegossen werden.
2. Reinigung von BM3.
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Zelllyse
- Das Zellpellet auf Eis auftauen und in 40 ml eiskaltem (4 °C) Löslichkeitspuffer (10 mM Tris, 0,01 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8) wieder aufhängen.
VORSICHT: PMSF ist durch Kontakt toxisch. - Während auf dem Eis, beschallen Sie die Zellen für 1 min mit einem Ultraschall-Homogenisator (Ausgangsleistungseinstellung 10, Zoll 100%), gefolgt von einem 1 min Bruch auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang 6 Mal. Zentrifugieren Sie die Zelle bei 4 °C für 30 min bei 11.000 x g zu Pelletzellablagerungen.
- Das Zellpellet auf Eis auftauen und in 40 ml eiskaltem (4 °C) Löslichkeitspuffer (10 mM Tris, 0,01 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8) wieder aufhängen.
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Affinitätschromatographie
- Bereiten Sie eine starke Anionenaustauschchromatographie-Säule (siehe Materialtabelle;Durchmesser: 2,8 cm x 6 cm, Säulenvolumen: 37 ml) durch Waschen mit 5 Säulenvolumen (CV) Puffer A (10 mM Tris, pH 7,8) bei 4 °C vor.
- Fügen Sie die Zelle lysiert zu ausgeglichenen Spalte und waschen Sie die Säule mit 3 CV Kaltpuffer A. Elute die BM3 durch Waschen der Säule mit Kaltpuffer B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Sammeln Sie die rötlich-braune Eluentenfraktion. Wenn das Protein nicht sofort verwendet wird, mischen Sie es mit einem gleichen Volumen von Glycerin und Blitz einfrieren mit flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die tiefgefrorene Lösung bei -78 °C auf.
3. Epoxidation von DHA durch BM3
- Bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie 0,308 g (0,940 mmol) DHA in 18,8 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 2 L Rührreaktionspuffer (0,12 m Kaliumphosphat, 5 mM MgCl2, pH 7,4) zusammen mit 20 nM des aufgetauten BM3-Enzyms hinzufügen. Die Enzymkonzentration kann durch die Kohlenmonoxid/Dithionit-Spektral-Assay-Methode19bestimmt werden.
- Während die Lösung rührt, beginnen Sie die Reaktion, indem Sie 1 Äquivalent von NADPH (Nicotinamid Adenin-Dinukleotid-Phosphat reduziert, Tetranatriumsalz, 0,808 g, 0,940 mmol) im Reaktionspuffer gelöst. Rühren Sie die Reaktion für 30 min, während Luft durch das Reaktionsgemisch mit einem luftgefüllten Ballon an einer Spritze und Nadel befestigt.
- Mit Einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle)wird die Absorption des Reaktionsgemisches bei 340 nm überprüft, um festzustellen, ob NADPH erschöpft ist. Wenn keine Restabsorption vorhanden ist, die den Verbrauch von NADPH anzeigt, ist die Reaktion vollständig.
HINWEIS: In der Regel ist die Reaktion nach 30 min abgeschlossen. - Das Reaktionsgemisch durch langsames Hinzufügen von 1 M Oxalsäure tropfenweise ablöschen, bis der pH-Wert der Lösung 4 erreicht.
4. Extraktion von EDP
- Extrahieren Sie die abgeschreckte Pufferlösung mit 2 L Diethylether (wasserfrei, peroxidfrei) 3 mal. Die Ätherschicht (6 l) sammeln und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat (MgSO4)trocknen.
- Filtern Sie das MgSO4 aus der Lösung und konzentrieren Sie die getrocknete Ätherschicht auf einen Rotationsverdampfer, um den rohen EDP-Rückstand zu erhalten.
- Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie (eine 40 g Kieselsäurepatrone ist ausreichend). Beginnen Sie bei 10% Ethylacetat (EtOAc) in Hexanen und fahren Sie bis zu 60% EtOAc in Hexanen über 22 min.
HINWEIS: Drei hauptgipfel werden erhalten und gesammelt, Eluing in der Reihenfolge 1. unreagierte DHA; 2. Mischung von EDP-Isomeren; und 3. Diepoxid (normale Überoxidationsprodukte (siehe Abbildung 1)). - Kombinieren Sie die Fraktionen und konzentrieren Sie sie auf den Rotationsverdampfer. Aus diesem Beispiel 0,074 g, (24%) von unreagiertem DHA, 0,151 g (47%) von EDP-Isomen und 0,076 g( 22%) Diepoxid erhalten wurden.
5. Veresterung von EDP, Trennung von 16(S), 17(R)- und 19(S),20(R)-EDP und Verseifung von Estern
VORSICHT: Trimethylsilyldiazomethan (TMS-Diazomethan) ist sowohl durch Kontakt als auch durch Einatmen sehr giftig. Nur in einer Dunstabzugshaube mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung verwenden.
- Die Epoxide (0,151 g, 0,435 mmol) in einem rundgrundkolben oder kleinen Durchstechflasche mit 2 ml wasserfreiem Methanol (MeOH) und 3 ml wasserfreiem Toluen verdünnen, einen Rührstab hinzufügen und TMS-Diazomethan (1,2 Moläquivalente oder 0,26 ml einer 2-M-Lösung in Hexanes) unter
- Warten Sie 10 min und fügen Sie zusätzliche TMS-Diazomethan (0,050 ml) hinzu, bis eine blassgelbe Farbe verbleibt.
- Nach 30 min die Mischung mit dem Rotationsverdampfer sorgfältig konzentrieren und den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie reinigen. Elute mit 4% EtOAc in Hexanen (mit einer 40 g Kieselgelsäule oder Kartusche) für 22 min. In diesem Beispiel wurde 19,20-EDP-Methylester (0,116 g, 74%) und 16,17-EDP-Methylester (0,029 g, 19 %) wurden als Klare Öle (Gesamtertrag, 93 %) gewonnen.
- Sammeln Sie die Fraktionen, die die gereinigten EDP-Methylester-Regioisomere enthalten. 19(S),20(R)-EDP Methylester eluiert zuerst, gefolgt von 16(S),17(R)-EDP Methylester.
- Bleiben gemischte Fraktionen (die beide Isomere enthalten; können durch Dünnschichtchromatographie (TLC) in 8:1 Hexan/EtOAc beurteilt und mit Kaliumpermanganat (KMnO4) gefärbt), rechromatographieren Sie sie mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie zuvor.
- Konzentrieren Sie die Fraktionen, die die einzelnen Regioisomere enthalten.
HINWEIS: An dieser Stelle können Identität und Reinheit durch NMR bewertet werden (mit CDCl3 als Lösungsmittel; siehe die Legende für Abbildung 2). - Um einzelne EDV-Methylester-Regioisomen in ihre Säureformen umzuwandeln, verdünnen Sie den EDV-Ester in THF:Wasser (ca. 0,7 ml/0,1 mmol Ester). 2 M wässrige LiOH (3 Moläquivalente) hinzufügen und über Nacht umrühren.
HINWEIS: Die Vollständigkeit der Reaktion kann durch TLC mit 3:1 Hexanen/EtOAc, Färbung mit KMnO4bewertet werden; das Produkt hat einen Retentionsfaktor von 0,3 €. - Die Reaktion langsam mit Ameisensäure ablöschen, bis der pH-Wert der Mischung 3-4 erreicht. Wasser und Ethylacetat (1-2 ml/0,100 mmol Ester) hinzufügen und die Schichten trennen. Die Wasserschicht mit EtOAc (3 x 5 ml) abziehen, mit gesättigter Sole (NaCl)-Lösung waschen und die EtOAc-Schicht über wasserfreies Natriumsulfat trocknen (Na2SO4).
- Die Ethylacetatlösung mit einem Rotationsverdampfer konzentrieren, Hexane (10 ml) hinzufügen und wieder konzentrieren. Zweimal wiederholen, um azeotropisch Restameisensäure zu entfernen. Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie, Eluing mit 10-30% EtOAc über 15 min.
- Die gewünschten Fraktionen konzentrieren und im Vakuum trocknen, um sich die gereinigte Säure leisten zu können.
HINWEIS: In diesem Stadium kann die enantiomere Reinheit beurteilt werden (durch chirale HPLC siehe die Legenden für Abbildung 3 - Abbildung 4 für Spalte und Bedingungen). Die chemische Reinheit kann mit C18 (achiral) HPLC beurteilt werden (siehe Materialtabelle und Referenz 14).
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Representative Results
Das Blitzsäulenchromatogramm (durchgeführt mit einem automatisierten Blitzreinigungssystem, wie unten beschrieben), das bei der Reinigung des Rohgemischs aus enzymatischer Epoxidation erhalten wurde, ist in Abbildung 1dargestellt. Nach Veresterung und Trennung der Regioisomerewurden reine 16( S), 17(R)-EDP und 19(S),20(R)-EDP Methylester erhalten. In der Regel sind sie in einem ungefähren Verhältnis von 1:4bis 1:5 vorhanden, wobei das Hauptprodukt 19( S), 20(R)-EDP ist. Es werden keine anderen EDP-Regioisomere (z. B. 13,14- oder 10,11-EDP) erhalten. Die 1H-NMR-Spektren von 16(S), 17(R)-EDP (Abbildung 2A) und 19(S), 20(R)-EDP (Abbildung 2B) Methylester zusammen mit ihren Strukturen sind unten dargestellt, was auf die hohe Reinheit dieser Verbindungen; C18 (achiral) HPLC der sauren Formen zeigte auch Reinheit >98%. Ihre Identität wurde durch eine hochauflösende Massenspektroskopie (sowohl der Säure- als auch der Esterform) bestätigt, die Massen-/Ladeverhältnisse und Fragmentierungsmuster ergab, die mit den identifizierten EDP übereinstimmen. Die enantiomere Reinheit wurde mit chiralen HPLC im Vergleich zu authentischen Enantiopure- und gemischten Standards der EDV (in ihrer Säureform, Abbildung 3A und Abbildung 4A) bestimmt. Wie in Abbildung 3B und Abbildung 4Bzu beobachten ist, sind beide DURCH enzymatische Epoxidation erhaltene EDV nach der Verseifung hoch enantiopure (>99% ein Enantiomer). Die Identitäten dieser Enantiomere wurden zuvor als 16(S), 17(R)- und 19(S), 20(R)-EDP18gemeldet.
Abbildung 1 . Chromatogramm aus der Reinigung von Rohgemisch aus enzymatischer Epoxidation von DHA (zusammen mit relevanten Strukturen). Der mittlere Peak (Monoepoxid) enthält die gewünschten EDPs. Die Reinigung erfolgte mit einem automatisierten Blitzreinigungssystem (siehe Materialtabelle). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 . Beispiel 1H-NMR-Spektren von reinem 16(S), 17(R)-EDP Methylester (2A) und 19(S),20(R)-EDP Methylester (2B). Spektren wurden bei 500 MHz in CDCl3 aufgezeichnet (Lösungsmittel ist bei 7,26 ppm und Restwasser bei 1,6 ppm sichtbar). Die chemischen Verschiebungen sind wie folgt: 16(S),17(R)-EDP Methylester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,57-5,35 (m, 10 H), 3,68 (s, 3 H), 2,99-2,95 (m, 2 H), 2,87-2,83 (m, 6 H), 2,47-2,37 (m, 6 H), 2,29-2,21 (m, 2 H), 2,11-2,05 (m, 2 H), 0,99 (t, J = 7,5 Hz, 3 H); 19(S),20(R)-EDP Methylester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,54-5,35 (m, 10 H), 3,68 (s, 3 H), 2,97 (td, J = 6,4, 4,2 Hz, 1 H), 2,91 (td, J = 6,3, 4,2 Hz, 1 H), 2,85-2,82 (m, 8 H), 2,44-2,36 (m, 5 H), 2,27-2,21 (m, 1 H), 1,65-1,51 (m, 3 H), 1,06 (t, J = 7,5 Hz , 3 H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Chiral HPLC, die eine Enantioreinheit von 16,17-EDP (Säureform) von BM3 anzeigt. Abbildung 3A zeigt ein chirales HPLC-Chromatogramm von "racemic" 16,17-EDP (eine künstliche Mischung authentischer Standards beider Enantiomere14), während Abbildung 3B ein chirales HPLC-Chromatogramm von Enantiopure 16(S), 17(R )-EDP durch Epoxidation von DHA mit BM3, bewertet als >99% S,R-Isomer. Die Säule ist zellulosebasiert (siehe Materialtabelle, 250 x 4,6 mm, 5 m, 1.000 ) eluiert mit isokratischem 45% 50 mM Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) in Methanol (30 min), mit einer Probenkonzentration von 0,5 mM und einer Durchflussrate von 1 ml/min. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Chiral HPLC, die eine Enantioreinheit von 19,20-EDP (Säureform) von BM3 anzeigt. Abbildung 4A zeigt ein chirales HPLC-Chromatogramm von "racemic" 19,20-EDP (eine künstliche Mischung authentischer Standards beider Enantiomere14), während Abbildung 4B ein chirales HPLC-Chromatogramm von Enantiopure 19(S), 20(R)-EDP produziert zeigt durch Epoxidation von DHA mit BM3, bewertet als >99% S,R isomer (Methode wie in Abbildung 3beschrieben ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 . Insgesamt enzymatische EpoxidationSreaktionschema und relevante Strukturen von AA, EPA, EETs und EEQs mit dieser Methode produziert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6 . Chiral ErFS plc, der die Enantioreinheit von 17,18-EEQ (Säureform) von BM3 anzeigt. Abbildung 6A zeigt ein chirales HPLC-Chromatogramm von "racemic" 17,18-EEQ (eine künstliche Mischung authentischer Standards beider Enantiomere14), während Abbildung 6B ein chirales HPLC-Chromatogramm von Enantiopure 17(S), 18(R )-EEQ durch Epoxidation von EPA mit BM3, bewertet als >99% S, R-Isomer (Methode wie in Abbildung 3beschrieben ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir präsentieren hier eine operativ einfache und kostengünstige Methode zur Vorbereitung der beiden am häufigsten vorkommenden Epoxidmetaboliten von DHA - 19,20 und 16,17-EDP. Diese Epoxidfettsäuren können in hochenantiopurer (als S,R-Isomere) Form mit Wildtyp-BM3-Enzym hergestellt werden. Im Folgenden werden mehrere kritische Punkte beschrieben, die zur Fehlerbehebung verwendet werden können, und die Erweiterung unserer Methode zur Herstellung von enantiopuren Epoxidmetaboliten von AA und EPA.
BM3-Speicherrichtlinien
Die Lagerung des gereinigten BM3-Enzyms ist möglich, indem die Proteinlösung mit gleichem Glyzerinvolumen und Blitzeinfrieren mit flüssigem Stickstoff vor der Lagerung in einem -78 °C Gefrierschrank gemischt wird. Sobald das Enzym eingefroren ist, kann es bis zu einem Jahr gelagert werden. Das Enzym kann nur einmal aufgetaut werden, muss auf Eis aufgetaut werden und kann nur 4 h auf Eis gelassen werden. Wieder einfrieren, und wenn das Enzym ohne Eisbad auftauen kann, wird das Enzym deaktiviert.
Richtlinien für die chemische Lagerung
Viele der für das Verfahren erforderlichen Verbindungen sind luftempfindlich. Dazu gehören DHA und andere PUFAs, EDPs und andere Epoxid-Metaboliten, und NADPH. Um die Peroxidation (und andere oxidative Prozesse) dieser Verbindungen zu verhindern, spülen Sie immer die Behälter, in denen sie gelagert werden, mit Argon oder Stickstoff und lagern Sie bei -78 °C.
Ein weiterer wichtiger Hinweis ist die Lösung, in der die DHA gespeichert ist. Obwohl DHA in DMSO nicht sehr stabil ist, ist BM3 mit Ethanol und Methanol nicht kompatibel, daher muss DMSO verwendet werden. Um seiner geringen Stabilität entgegenzuwirken, muss das DHA-Gemisch am selben Tag wie die Epoxidation frisch zubereitet werden. Der gesamte DMSO-Anteil in der Reaktionsmischung muss unter 1% gehalten werden, um eine Deaktivierung des Enzyms zu vermeiden. Da NADPH eine kurze Haltbarkeit hat, sollte die Konzentration zusätzlich zur Reaktion mit dem Spektralphotometer überprüft werden. Dadurch wird sichergestellt, dass dem Reaktionsgemisch immer 1 Äquivalent des NADPH zugesetzt wird.
Leitlinien für die Epoxidationsreaktion
Der Luftstrom vom Ballon in das Reaktionsgemisch muss aufrechterhalten werden, um die Reaktion sauerstoffoxygeniert zu halten, da Sauerstoff für die Epoxidation notwendig ist. Das Gemisch muss auch schnell gerührt werden, da PUFAs in Wasser nicht sehr löslich sind (die Löslichkeit von DHA beträgt im Reaktionspuffer 125 M). Die Reaktion wird mit Oxalsäure abgeschreckt, um Proteine zu denaturieren (da es Metall chelatisiert und Cofaktoren entfernt) und Säure behält DHA seine neutrale Form, die für die Extraktion von Diethylether notwendig ist. Das Abschrecken des Reaktionsgemisches muss langsam erfolgen, um eine säurekatalysierte Hydrolyse der EDV zu vermeiden.
RICHTLINIEN für die EDP-Extraktion und -Reinigung
Ether wurde aus mehreren Gründen speziell als Extraktionslösungsmittel ausgewählt. Dichlormethan kann das Protein aus der Lösung herausschneiden, was die Extraktion erschwert. EtOAc extrahiert Glycerin (hinzugefügt mit der Enzym-Stammlösung), das schwer zu entfernen ist und die Blitzchromatographie stört.
EDP-Regioisomere in ihrem freien Säurezustand sind nicht leicht zu trennbar, weshalb die Regioisomere in der ersten Blitzsäulenchromatographie zu einem einzigen Peak vermischt werden. Sobald sie in die Methylester umgewandelt wurden, sind die Regioisomen leicht trennbar. Darüber hinaus sind die Ester in der Regel stabiler als die entsprechenden Säuren für die Langzeitlagerung, wenn die Säureform nicht sofort benötigt wird.
Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/alternative Methoden
Unsere Methode bietet eine einfache und effektive Methode zur Erlangung von enantioreinen EDP, die viele Vorteile gegenüber bestehenden und alternativen Methoden hat. Erstens ist die chemische Epoxidation von DHA und anderen PUFAs und ihren Derivaten weder regioselektiv noch enantioselektiv, und komplizierte Gemische werden häufig gewonnen. Mehrere Blitzchromatographiesäulen und präparative HPLC, einschließlich chiraler präparativer HPLC, sind daher notwendig, um enantiopure Epoxidfettsäuren aus diesen Mischungen zu reinigen, die arbeitsintensiv sind und nur sehr geringe Mengen der gewünschten Metaboliten. Die Gesamtsynthese kann auch zur Herstellung von Epoxid-Fettsäuren eingesetzt werden, aber sie ist streng, zeitaufwändig, erfordert mehrere Schritte und gibt eine geringe Gesamtausbeute, während das BM3-Enzym leicht auszudrücken und zu reinigen ist, und die Epoxidation innerhalb kurzer Zeit abgeschlossen ist. zeit. Unsere Methode ist auch kostengünstig: eine kommerzielle Quelle20 bietet derzeit 16,17- und 19,20-EDV (als ihre Racemates) für 528 USD /0,5 mg. 1 g NADPH kann auch für 500-800 USD gekauft werden, und kann verwendet werden, um mehr als zweihundert mal so viel wie 19,20- zu produzieren EDP (und etwa fünfzigmal so viel wie 16,17-EDP) kommerziell zu einem ähnlichen Preis angeboten - und in enantiopure Formen, die derzeit nicht kommerziell erhältlich sind.
Einschränkungen der Methode
Da dieses Enzym bevorzugt die letzte Doppelbindung von DHA epoxidiert, ist das Hauptprodukt 19,20-EDP (obwohl auch 16,17-EDP produziert wird). Daher können andere DHA-Regioisomere, die gewünscht werden könnten (z. B. 13,14-EDP, 10,11-EDP), nicht durch enzymatische Epoxidation mit Wildtyp BM3 hergestellt werden. Da nur die SR-Enantiomere von BM3 hergestellt werden, sind die RS-Enantiomereunzugänglich, obwohl unsere zuvor veröffentlichte chemische Inversionsmethode14 zur Synthese verwendet werden kann. Zusätzlich wären aufgrund der geringen Löslichkeit lipophiler PUFAs im Reaktionspuffer sehr große Mengen pufferfür die Großproduktion (ca. 500-1.000 mg) von EDP erforderlich, was die Extraktion zeitaufwändig oder unerschwinglich machen könnte.
Andere Anwendungen der Methode
Erfreulicherweise ist dieses enzymatische Epoxidationsprotokoll auch auf EPA und AA anwendbar (relevante Strukturen sind in Abbildung 5dargestellt). Die Für die Epoxidation aller drei Fettsäuren erforderlichen Konzentrationen, Puffer und Reaktionszeiten sind gleich. Für die EPA wird auch das Wildtyp-BM3-Enzym und die eEQ-Fraktion, die aus EPA gewonnen wird (56% Ertrag von Monoepoxid), nach der Veresterung beträgt 14:1 17,18-EEQ:14,15-EEQ. Ähnlich wie bei den Beobachtungen für EDV ist der 17,18-EEQ hoch enantiopure (>99% 17(S), 18(R)-EEQ, siehe Abbildung 6), wie er von chiralen HPLC beurteilt wird (siehe Abbildung 3 Legende und Materialtabelle). Identität von Enantiomern wurde zuvor gemeldet17. Für AA muss die F87V BM3 Mutante jedoch stattdessen verwendet werden, da der Wildtyp BM3 eine Hydroxylase für AA21ist. Expression und Reinigung dieser Mutante verwendet auch das obige Protokoll, und Epoxidation wird in analoger Weise durchgeführt. Bei dieser Methode wird 14,15-EET als einziges Regioisomer erhalten. Da 14,15-EET-freie Säure nach der Epoxidation untrennbar mit unreagiertem AA verbunden ist, ist eine Veresterung notwendig; 14,15-EET Methylester wird in 52% Ausbeute aus AA gewonnen. Chiral HPLC (siehe Abbildung 3 Legende und Tabelle der Materialien) der Säure zeigt hoch enantiopure (>99%) 14(S),15(R)-EET (wie bereits berichtet)15. Die chemischen Verschiebungen für diese EPA- und AA-Metaboliten sind wie folgt: 17(S),18(R)-EEQ Methylester:1H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,53-5,34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 H), 2,96 (td, J = 6,4, 4,2 Hz, 1 H), 2,90 (td, J = 6,3, 4,2 Hz, 1 H), 2,85-2,79 (m, 6 H), 2,44-2,38 (m, 1 H), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,26-2,20 (m, 1 H) , 2,11 (q, J = 6,7 Hz, 2 H), 1,71 (Quintett, J = 7,4 Hz, 2 H), 1,66-1,50 (m, 2 H), 1,05 (t, J = 7,5 Hz, 3 H); 14(S),15(R)-EET Methylester: 1 H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,53-5,33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 H), 2,95-2,92 (m, 2 H), 2,81 (dt, J = 17,8, 5,8 Hz, 4 H), 2,40 (dt, J = 14,1, 6,8 Hz, 1 H), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,23 (dt, J = 14,1, 6,8 Hz, 1 H) , 2,11 (q, J = 6,8 Hz, 2 H), 1,71 (Quintett, J = 7,4 Hz, 2 H), 1,56-1,41 (m, 4 H), 1,38-1,30 (m, 4 H), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3 H).
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) und Startup-Fonds der Michigan State University finanziert. Die Autoren danken Dr. Jun Yang (University of California at Davis) und Lalitha Karchalla (Michigan State University) für die Unterstützung bei der Optimierung der enzymatischen Reaktion und Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) Unterstützung bei der HRMS-Datenerfassung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
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