Summary
Nós apresentamos um método útil para a síntese e a purificação enzimáticas em grande escala de enantiômeros e de regioisômeros específicos dos epóxidos do ácido araquidônico (AA), do ácido docosahexaenóico (DHA), e do ácido eicosapentaenóico (EPA) com o uso de um citocromo bacteriano Enzima P450 (BM3).
Abstract
Os metabólitos epoxidizados de vários ácidos graxos poli-insaturado (PUFAs), denominados ácidos graxos epóxi, têm uma ampla gama de papéis na fisiologia humana. Estes metabolitos são produzidos endogenamente pela classe de enzimas do citocromo P450. Por causa de seus efeitos biológicos diversos e potentes, há um interesse considerável em estudar estes metabolitos. Determinar as funções únicas destes metabolitos no corpo é uma tarefa difícil, como os ácidos graxos epóxi deve primeiro ser obtido em quantidades significativas e com alta pureza. A obtenção de compostos de fontes naturais é muitas vezes trabalhoso, e Hidrolina de epoxida solúvel (sEH) rapidamente hidrolisar os metabolitos. Por outro lado, a obtenção desses metabólitos por meio de reações químicas é muito ineficiente, devido à dificuldade de obtenção de regioisômeros puros e enantiômeros, baixos rendimentos e purificação extensa (e cara). Aqui, nós apresentamos uma síntese enzimática eficiente de 19 (s), 20 (r)-e 16 (s), 17 (r)-ácidos epoxydocosapentaenoic (edps) de DHA através do epoxidação com BM3, uma enzima CYP450 bacteriana isolada originalmente do bacilo megaterium (que é prontamente expresso em Escherichia coli). A caracterização e a determinação da pureza são realizadas com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas (MS). Este procedimento ilustra os benefícios da síntese enzimática de metabolitos da epoxi de PUFA, e é aplicável à epoxidação de outros ácidos gordos, incluindo o ácido araquidônico (AA) e o ácido eicosapentaenóico (EPA) para produzir o epoxyeicosatrienoic análogo ácidos (Eets) e ácidos ver (EEQS), respectivamente.
Introduction
Como o interesse no papel que os ácidos gordos polyinsaturados (particularmente Omega-3 e Omega-6 ácidos gordos polyinsaturados) jogam na biologia humana cresceu nos últimos anos, os investigadores tomaram a observação da escala larga de benefícios atraentes que seus metabolitos Exposição. Em particular, os metabólitos de ácidos graxos epóxi produzidos pela classe de enzimas do citocromo P450 têm sido um grande ponto de foco. Por exemplo, muitos epoxídeos de PUFA, incluindo ácidos epoxyeicosatrienoic (Eets), ácidos ver (edps) e ácidos ver (EEQS), desempenham um papel crítico na regulação da pressão arterial e inflamação1,2 , 3. º , 4. º , 5. Curiosamente, os enantiômeros e regioisômeros específicos dos epoxídeos AA e EPA são conhecidos por terem efeitos variados sobre a vasoconstrição6,7. Enquanto os efeitos fisiológicos dos enantiômeros e regioisômeros de EETs e EEQs foram documentados, pouco se sabe sobre o efeito dos ácidos epoxydocosapentaenóicos análogos (EDPs) formados a partir de DHA. O uso generalizado do óleo de peixe8, que é rico em EPA e DHA, também despertava o interesse na AEPD9. Os benefícios destes suplementos são acreditados para ser em parte devido aos metabolitos a jusante DHA (16,17-EDP e 19,20-EDP sendo o mais abundante) porque in vivo níveis de EDPs coordenar muito bem com a quantidade de DHA na dieta10, o 11.
Estudar os mecanismos e alvos destes ácidos graxos epóxi por Metabolomics, biologia química, e outros métodos tem provado desafiador, em parte porque eles existem como misturas de Regio-e estéreo-isómeros, e um método de obtenção de quantidades puras do são necessários enantiômeros e regioisômeros. Os meios convencionais para sintetizar quimicamente estes compostos provaram ineficaz. O uso de peroxyacid como o ácido meta-chloroperoxybenzoic para o epoxidação tem muitas desvantagens, notàvel a falta do selectivity do epoxidação, que necessita a purificação cara e meticulosa de regioisômeros e de enantiomers individuais. A síntese total dos metabólitos de DHA e EPA é possível, mas também sofre de desvantagens que o tornam impraticável para a síntese em larga escala, como altos custos e baixos rendimentos12,13. A produção global eficiente pode ser conseguida com síntese enzimática, pois as reações enzimáticas são Regio-e estereosseletivas14. Estudos mostram que a epoxidação enzimática de AA e EPA (com BM3) é tanto regioseletiva e enantioseletiva15,16,17,18, mas este procedimento não foi testado com DHA, ou em um grande Escala. O objetivo geral de nosso método era escalar acima e aperfeiçoar esta epoxidação chemoenzimática para produzir ràpida quantidades significativas de ácidos gordos puros da cola Epoxy como seus enantiomers individuais. Usando o método apresentado aqui, os pesquisadores têm acesso a uma estratégia simples e rentável para a síntese de EDPs e outros metabólitos de epóxi PUFA.
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Protocol
Atenção: por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) relevantes antes de utilizar os produtos químicos listados.
1. expressão do selvagem-tipo BM3
- Inocular pBS-BM3 transfected DH5α E. coli (uma doação generosa de Dr. F. Ann Walker) em 5 ml de caldo lb estéril com 0,5 mg de ampicilina adicionado em um tubo de cultura de 20 ml.
- Incubar a cultura celular em uma coqueteleira a 37 ° c por 24 h a 200 rpm. Adicione a cultura de partida durante a noite (5 mL) e 100 mg de ampicilina a 1 L de caldo LB estéril em um frasco de Fernbach ou Erlenmeyer. Agitar a 37 ° c por 6 h a 200 rpm, depois a 30 ° c por 18 h a 200 rpm.
- Colete e centrifugue a cultura celular a 4 ° c por 10 min a 1.000 x g. Descarte o sobrenadante e armazene a pelota da pilha em-78 ° c até a purificação da enzima.
Nota: o sobrenadante pode ser quimicamente esterilizado por tratamento com lixívia ou esterilizado usando uma autoclave e, em seguida, derramado para baixo do dreno.
2. purificação de BM3.
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Lise celular
- Descongelar o pellet de células no gelo e ressuscita em 40 mL de tampão de solubilização gelada (4 ° c) (Tris de 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonil de 0, 1 mM (PMSF;), EDTA de 0, 1 mM; pH 7,8).
Cuidado: PMSF é tóxico pelo contato. - Quando no gelo, proceda as pilhas por 1 minuto com um homogeneizador ultra-sônico (ajuste 10 do poder da saída, dever 100%), seguido por uma ruptura de 1 minuto no gelo a fim lyse as pilhas. Repita este procedimento 6 vezes. Centrifugue o lisado da pilha em 4 ° c por 30 minutos em 11.000 x g aos restos da pilha da pelota.
- Descongelar o pellet de células no gelo e ressuscita em 40 mL de tampão de solubilização gelada (4 ° c) (Tris de 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonil de 0, 1 mM (PMSF;), EDTA de 0, 1 mM; pH 7,8).
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Cromatografia de afinidade
- Prepare uma coluna de cromatografia de troca aniónica forte (ver tabela de materiais; diâmetro: 2,8 cm x 6 cm, volume da coluna: 37 ml) por lavagem com 5 volumes de coluna (CV) de tampão a (10 mm Tris, pH 7,8) a 4 ° c.
- Adicione os lisados de células à coluna equilibrada e lave a coluna com 3 CV de tampão frio a. elute o BM3 lavando a coluna com tampão frio B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Colete a fração eluente marrom-avermelhada. Se a proteína não estiver sendo usada imediatamente, misture-a com um volume igual de glicerol e congelamento de flash com nitrogênio líquido. Armazene a solução congelada em-78 ° c.
3. epoxidação de DHA por BM3
- Prepare a reacção adicionando 0,308 g (0,940 mmol) de DHA em 18,8 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) a 2 L de tampão de reacção de agitação (fosfato de potássio de 0,12 M, 5 mM MgCl2, pH 7,4) juntamente com 20 nm da enzima BM3 descongelada. A concentração enzimática pode ser determinada pelo método de ensaio espectral de monóxido de carbono/ditionita19.
- Enquanto a solução está mexendo, comece a reação adicionando 1 equivalente de NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido, sal de tetrassódico, 0,808 g, 0,940 mmol) dissolvido em tampão de reação. Mexa a reação por 30 min enquanto borbulhando ar através da mistura de reação com um balão cheio de ar anexado a uma seringa e agulha.
- Utilizando um espectrofotômetro (ver tabela de materiais), verifique a absorvância da mistura de reacção a 340 nm para determinar se o NADPH está esgotado. Se não houver absorvância remanescente indicando o consumo de NADPH, a reação está completa.
Nota: normalmente, a reacção é concluída após 30 min. - Saciar a mistura de reacção adicionando lentamente 1 M de ácido oxálico, Dropwise, até que o pH da solução atinja 4.
4. extração de AEPD
- Extraia a solução tampão extinto com 2 L de éter dietílico (anidro, sem peróxido) 3 vezes. Colete a camada de éter (6 L) e seque com sulfato de magnésio anidro (MgSO4).
- Filtre o MgSO4 da solução e concentre a camada de éter seco em um evaporador rotativo para produzir o resíduo bruto da EDP.
- Purificar o resíduo por cromatografia em coluna flash (um cartucho de sílica 40 g é suficiente). Comece em 10% acetato de etilo (etoac) em hexanos e rampa até 60% etoac em hexanos mais de 22 min.
Nota: três picos principais são obtidos e recolhidos, eluição na ordem de 1. DHA não reagido; 2. mistura de isómeros EDP; e 3. di-epoxida (produtos de oxidação normal (ver Figura 1)). - Combine as frações e concentre-as no evaporador rotativo. A partir deste exemplo, 0, 74 g, (24%) de DHA não reagido, 0,151 g (47%) dos isómeros da EDP, e 0, 76 g, (22%) de di-epoxida foram obtidos.
5. esterificação de AEPD, separação de 16 (s), 17 (r)-e 19 (s), 20 (r)-EDP e saponificação de ésteres
Cuidado: o Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazometano) é muito tóxico pelo contato e pela inalação. Use somente em uma capa das emanações com o equipamento protetor pessoal apropriado.
- Diluir os epóxidos (0,151 g, 0,435 mmol) em um balão de fundo redondo ou um pequeno frasco para injetáveis com 2 ml de metanol anidro (MeOH) e 3 ml de tolueno anidro, adicione uma barra de agitação e adicione TMS-diazometano (1,2 equivalentes molar, ou 0,26 ml de uma solução de 2 M em hexanes) Argon.
- Aguarde 10 min e adicione TMS-diazometano adicional (0, 50 mL) até que uma cor amarela pálida permaneça.
- Após 30 min, concentre cuidadosamente a mistura usando o evaporador rotativo e purifique o resíduo por cromatografia em coluna flash. Elute com 4% etoac em hexanos (usando uma coluna de gel de sílica 40 g ou cartucho) por 22 min. Neste exemplo, 19, 20-éster metílico de EDP (0,116 g, 74%) e 16, 17-éster metílico de EDP (0, 29 g, 19%), foram obtidos como óleos claros (rendimento total, 93%).
- Recolher as frações contendo os regioisómeros de éster metílico purificados. 19 (s), 20 (R)-elutos do éster metílico de EDP primeiramente, seguidos por 16 (s), 17 (R)-éster metílico de EDP.
- Se qualquer fração mista permanecer (contendo ambos os isómeros; pode ser avaliada por cromatografia em camada delgada (TLC) em 8:1 hexano/EtOAc e manchada com permanganato de potássio (KMnO4)), recromatógrafo-los com o mesmo sistema de solvente como antes.
- Concentrar as frações contendo os regioisómeros individuais.
Nota: neste ponto, a identidade e a pureza podem ser avaliadas por RMN (usando CDCl3 como o solvente; ver a legenda para a Figura 2). - Para converter os regioisómeros de éster metílico de EDP individuais nas suas formas de ácido, diluir o éster EDP em THF: Water (aproximadamente 0,7 mL/0,1 mmol de éster). Adicionar 2 M aquosa LiOH (3 equivalentes molar) e mexa durante a noite.
Nota: a completude da reacção pode ser avaliada por TLC, utilizando 3:1 hexanes/EtOAc, manchando com KMnO4; o produto tem um fator de retenção de ~ 0,3. - Saciar a reação lentamente com ácido fórmico, até que o pH da mistura atinja 3-4. Adicionar água e acetato de etila (1-2 mL/0.100 mmol de éster) e separar as camadas. Extraia a camada de água com EtOAc (3 x 5 mL), lave com solução de salmoura saturada (NaCl) e seque a camada EtOAc sobre o sulfato de sódio anidro (na2so4).
- Concentre a solução de acetato de etila utilizando um evaporador rotativo, adicione hexanos (10 ml) e concentre-se novamente. Repita duas vezes para remover azeotropicamente o ácido fórmico residual. Purify o resíduo pela cromatografia de coluna instantânea, farmacológicos com 10-30% etoac sobre 15 minutos.
- Concentre as frações desejadas e seque em vacuo para pagar o ácido purificado.
Nota: nesta fase, a pureza enantiomérica pode ser avaliada (por HPLC quiral, ver as legendas para a Figura 3 - Figura 4 para coluna e condições). A pureza química pode ser avaliada por CLAE C18 (achiral) (ver tabela de materiais e referência 14).
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Representative Results
O cromatograma de coluna flash (realizado usando um sistema automatizado de purificação de flash como descrito abaixo) obtido após a purificação da mistura bruta de epoxidação enzimática é mostrado na Figura 1. Após a esterificação e separação dos regioisómeros, foram obtidos 16 (s) puros, 17 (r)-EDP e 19 (s), 20 (r)-ésteres metílicos de EDP. Tipicamente, eles estão presentes em uma proporção aproximada de 1:4 a 1:5, sendo que o principal produto é 19 (S), 20 (R)-EDP. Não são obtidos outros regioisómeros EDP (por exemplo, 13, 14-ou 10, 11-EDP). Os espectros de 1H-RMN de 16 (s), 17 (r)-EDP (Figura 2a) e 19 (s), 20 (r)-EDP (Figura 2b) ésteres metílicos juntamente com suas estruturas são mostrados abaixo, indicando a alta pureza destes compostos C18 (achiral) HPLC dos formulários ácidos indicou também purezas > 98%. Sua identidade foi confirmada ainda pela espectroscopia maciça de alta resolução (ambas as formas do ácido e do éster), que renderam índices da massa/carga e padrões da fragmentação consistentes com os EDPs identificados. A pureza enantiomérica foi determinada por HPLC quiral, em comparação com a enantiopure autêntica e padrões mistos da AEPD (em sua forma ácida, Figura 3a e figura 4a). Como pode ser observado na Figura 3B e na Figura 4B, ambas as edps obtidas por epoxidação enzimática são altamente enantiopure após a saponificação (> 99% um enantiomer). As identidades destes enantiômeros foram relatadas previamente para ser 16 (s), 17 (r)-e 19 (s), 20 (r)-EDP18.
Figura 1 . Cromatograma da purificação da mistura bruta obtida da epoxidação enzimática de DHA (junto com estruturas relevantes). O pico médio (monoepoxide) contém as EDPs desejadas. A purificação foi realizada usando um sistema automatizado de purificação de flash (ver tabela de materiais). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Exemplo 1espectros de H-RMN de 16 (s) puros, 17 (r)-éster metílico de EDP (2a) e 19 (s), 20 (r)-éster metílico de EDP (2B). Os espectros foram gravados em 500 megahertz no CDCl3 (o solvente é visível em 7,26 ppm e na água residual em 1,6 ppm). As mudanças químicas são as seguintes: 16 (S), 17 (R)-éster metílico EDP: 1H-RMN (500 MHz; CDCl3): δ 5.57 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2.99-2.95 (m, 2 h), (m, 6 h), 6, 8 h), 3, 2 h (m), 2,29-2.21 (m, h), 2,11-2,05 (J = 7,5 Hz); 0,99 19 (S), 20 (R)-éster metílico EDP: 1H-RMN (500 MHz; CDCl3): δ 5.54 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2,97 (td, j = 6,4, 4,2 hz, 1 h), 2,91 (td, J = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2,85-1/2 (m, 8 h), 2.44-2.36 (m, 5 h), 2,27-2.21 (m, 1 h), 1.65-1.51 (m, 3 h), 1, 6 (t, J = 7,5 Hz , 3 H). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. HPLC quiral que indica a enantiopurity de 16,17-EDP (forma ácida) produzida por BM3. A Figura 3a mostra um CROMATOGRAMA de HPLC quiral de "racemic" 16, 17-EDP (uma mistura artificial de padrões autênticos de ambos os enantiômeros14), enquanto a Figura 3B mostra um cromatograma de HPLC quiral de Enantiopure 16 (S), 17 (R )-EDP produzida por epoxidação de DHA com BM3, avaliada como > 99% S, R isômero. A coluna é à base de celulose (ver tabela de materiais, 250 x 4,6 mm, 5 μm, 1.000 Å) eluição com isocrática 45% 50 mM de bicarbonato de amônio (NH4HCO3) em metanol (30 min), com uma concentração de amostra de 0,5 mm e vazão de 1 ml/min. por favor Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. HPLC quiral que indica a enantiopurity de 19,20-EDP (forma ácida) produzida por BM3. Figura 4a mostra um cromatograma quiral da HPLC de "racemic" 19, 20-EDP (uma mistura artificial de padrões autênticos de ambos os enantiômeros14), visto que a Figura 4B mostra um CROMATOGRAMA quiral da HPLC do Enantiopure 19 (S), 20 (R)-EDP produziu por epoxidação de DHA com BM3, avaliada como > 99% S,R isômero (método descrito para a Figura 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Esquema de reação de epoxidação enzimática global e estruturas relevantes de AA, EPA, EETs e EEQs produzidos por este método por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . HPLC quiral indicando enantiopurity de 17,18-EEQ (forma ácida) produzida por BM3. A Figura 6a mostra um CROMATOGRAMA de HPLC quiral de 17, 18-EEQ "racemic" (uma mistura artificial de padrões autênticos de ambos os enantiômeros14), enquanto a Figura 6B mostra um cromatograma de HPLC quiral de Enantiopure 17 (S), 18 (R )-EEQ produzido por epoxidação de EPA com BM3, avaliado como > 99% S,R isômero (método descrito para a Figura 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentamos aqui um método operacionalmente simples e econômico para a preparação dos dois metabólitos epoxídicos mais abundantes de DHA-19, 20 e 16,17-EDP. Estes ácidos graxos epóxi podem ser preparados em altamente enantiopure (como seu S, R-isómeros) forma usando selvagem-tipo BM3 enzima. Vários pontos críticos que podem ser usados para solução de problemas, e a extensão do nosso método para a preparação de metabólitos epóxi enantiopure de AA e EPA, são descritos abaixo.
BM3 diretrizes de armazenamento
Armazenar a enzima BM3 purificada é possível misturando a solução de proteína com volume igual de glicerol e congelamento de flash com nitrogênio líquido antes do armazenamento em um freezer de-78 ° c. Uma vez que a enzima é congelada, pode ser armazenada por até um ano. A enzima só pode ser descongelada uma vez, deve ser descongelada no gelo, e só pode ser deixada no gelo por 4 h. congelamento novamente, e permitindo que a enzima para descongelar sem um banho de gelo irá desativar a enzima.
Diretrizes de armazenamento químico
Muitos dos compostos necessários para o procedimento são sensíveis ao ar. Estes incluem DHA e outros PUFAs, EDPs e outros metabólitos epóxi, e NADPH. Para evitar a peroxidação (e outros processos oxidativos) destes compostos, lave sempre os recipientes em que são armazenados com argônio ou nitrogênio e armazene a-78 ° c.
Outra nota importante é a solução na qual o DHA é armazenado. Embora o DHA não seja muito estável no DMSO, o BM3 é incompatível com etanol e metanol, de modo que o DMSO deve ser usado. Para neutralizar sua baixa estabilidade, a mistura de DHA deve ser preparada recentemente no mesmo dia que a epoxidação. A percentagem total de DMSO na mistura de reacção deve ser mantida abaixo de 1% para evitar a desativação da enzima. Adicionalmente, porque NADPH tem uma vida útil curta, a concentração deve ser verific com o espectrofotômetro antes da adição à reação. Isto assegura-se de que 1 equivalente do NADPH esteja adicionado sempre à mistura da reação.
Diretrizes de reação de epoxidação
O fluxo de ar do balão na mistura da reação deve ser mantido a fim manter a reação oxigenada porque o oxigênio é necessário para o epoxidation. A mistura também deve ser agitada rapidamente, uma vez que os PUFAs não são muito solúveis em água (a solubilidade de DHA é ≤ 125 μM no tampão de reação). A reação é extinto com ácido oxálico para a proteína de desnaturalização (como quelates metal e remove cofactors) e ácido mantém DHA sua forma neutra, o que é necessário para a extração de éter dietílico. A têmpera da mistura de reacção deve ser feita lentamente para evitar a hidrólise catalisada por ácido dos AEPD.
Diretrizes de extração e purificação da EDP
O éter foi escolhido especificamente como solvente de extração por várias razões. Dichloromethane pode precipita a proteína fora da solução, que complica a extração. EtOAc extrai o glicerol (adicionado com a solução do estoque da enzima), que é difícil de remover e interfere com a cromatografia instantânea.
Os regioisómeros da EDP no seu estado de ácido livre não são facilmente separáveis, razão pela qual os regioisómeros são misturados num único pico na primeira cromatografia em coluna flash. Uma vez que eles são convertidos para os ésteres metílicos, os regioisómeros são prontamente separáveis. Adicionalmente, os ésteres são geralmente mais estáveis do que os ácidos correspondentes para o armazenamento a longo prazo se a forma ácida não é necessária imediatamente.
Significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos
Nosso método fornece um método simples e eficaz para a obtenção de EDPs enantiopure, que tem muitas vantagens sobre os métodos existentes e alternativos. Em primeiro lugar, a epoxidação química de DHA e outros PUFAs e seus derivados não é regiosseletiva ou enantioselective, e misturas complicadas são muitas vezes obtidas. As colunas múltiplas da cromatografia instantânea e a HPLC preparativa, incluindo a HPLC preparativa quiral, são conseqüentemente necessárias purificar ácidos gordos da cola Epoxy do enantiopure destas misturas, que são labor intensivo e podem produzir somente quantidades muito pequenas do desejado Metabolitos. A síntese total também pode ser empregada para produzir ácidos graxos epóxi, mas é rigorosa, demorada, requer várias etapas, e dá um rendimento geral baixo, enquanto a enzima BM3 é fácil de expressar e purificar, e a epoxidação está completa dentro de um curto período de Tempo. Nosso método também é rentável: uma fonte comercial20 atualmente oferece 16, 17-e 19, 20-EDP (como seus racemates) para 528 USD/0,5 mg. 1 g de NADPH também pode ser comprado para ~ 500-800 USD, e pode ser usado para produzir mais de 200 vezes a quantidade de 19, 20- A EDP (e aproximadamente 50 vezes o montante de 16, 17-EDP) ofereceu comercialmente por um preço semelhante-e em formas de enantiopure, que atualmente não estão disponíveis comercialmente.
Limitações do método
Como esta enzima preferencialmente epoxidiza a última dupla ligação de DHA, o principal produto é de 19,20-EDP (embora 16, 17-EDP também é produzido). Portanto, outros regioisómeros de DHA que podem ser desejados (por exemplo, 13, 14-EDP, 10,11-EDP) não podem ser produzidos por epoxidação enzimática com tipo selvagem BM3. Além disso, como apenas os Sr-enantiômeros são produzidos por BM3, os RS-enantiômeros são inacessíveis, embora o nosso método de inversão química anteriormente publicado14 pode ser usado para sintetizá-los. Adicionalmente, por causa da baixa solubilidade de PUFAs lipofílicos no tampão da reação, as quantidades muito grandes de amortecedor seriam necessárias para a produção em grande escala (ca. 500-1000 MGS) de EDPs, que poderia potencial fazer a extração demorado ou proibitivo.
Outras aplicações do método
Agradavelmente, este protocolo de epoxidação enzimática também é aplicável a EPA e AA (as estruturas relevantes são mostradas na Figura 5). As concentrações, o tampão, e o tempo de reação exigidos para o epoxidação de todos os três ácidos gordos são os mesmos. Para a EPA, a enzima Wild-Type BM3 também é utilizada, e a fração EEQ obtida da EPA (56% de rendimento de monoepoxida), após a esterificação é ~ 14:1 17,18-EEQ: 14,15-EEQ. Semelhante às observações feitas para a AEPD, o 17, 18-EEQ obtido é altamente enantiopure (> 99% 17 (S), 18 (R)-EEQ, ver Figura 6) como avaliado pela HPLC quiral (ver Figura 3 legenda e tabela de materiais). A identidade dos enantiômeros foi relatada previamente17. Para AA, no entanto, o mutante F87V BM3 deve ser usado em vez de Wild-Type BM3 é um hidroxilase para AA21. Expressão e purificação deste mutante também usa o protocolo acima, e epoxidação é realizada de forma análoga. Por este método, 14, 15-EET é obtido como o único regioisomer. Como 14, o ácido livre de 15 EET é inseparável do AA não reagido depois da epoxidação, a esterificação é necessária; 14, 15-EET éster metílico é obtido em 52% rendimento de AA. HPLC quiral (ver Figura 3 legenda e tabela de materiais) do ácido indica altamente enantiopure (> 99%) 14 (S), 15 (R)-EET (conforme relatado anteriormente)15. As mudanças químicas para estes metabolitos EPA e AA são as seguintes: 17 (S), 18 (R)-EEQ éster metílico:1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 h), 2,96 (TD, J = 6,4, 4,2 Hz, 1 h), 2,90 (td, j = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2,85-2.79 (m, 6 h), 2.44-2,38 (m, 1 h), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 2 h), 2.26-2.20 (m, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,7 Hz, 2 h), 1,71 (quinteto, j = 7,4 Hz, 2 h), 1,66-1,50 (m, 2 h), 1, 5 (t, j = 7,5 Hz, 3 h); 14 (S), 15 (R)-EET metil éster: 1. º H-RMN (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 h), 2.95-8, 5h (m, 2 horas), 2,81 (DT, j = 17,8, 5,8 Hz, 4 h), 2,40 (dt, j = 14,1, 6,8 hz, 1 h), 2,32 (t, j = 7,5 Hz, 2 h), 2,23 (DT, j = 14,1, 6,8 Hz, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,8 Hz, 2 h), 1,71 (quinteto, j = 7,4 Hz, 2 h), 1,56-1,41 (m, 4 h), 1,38-1,30 (m, 4 h), 0,90 (t, j = 7,1 Hz, 3 h).
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado por r00 ES024806 (institutos nacionais de saúde), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fundos de arranque da Universidade Estadual de Michigan. Os autores desejam agradecer ao Dr. Jun Yang (Universidade da Califórnia em Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) para obter assistência com a otimização da reação enzimática, e Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass espectrometria e Metabolomics Facility) para obter assistência com a aquisição de dados da HRMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
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