Summary
Vi presenterar en metod som är användbar för storskalig enzymatisk syntes och rening av specifika enantiomerer och regioisomerer av epoxider av arakidonic Acid (AA), dokosahexaensyra (DHA), och eikosapentaenoic syra (EPA) med användning av en bakteriell cytokrom P450-enzymet (BM3).
Abstract
Den epoxidiserade metaboliter av olika fleromättade fett syror (PUFAs), kallas epoxi fett syror, har ett brett spektrum av roller i människans fysiologi. Dessa metaboliter produceras endogent av cytokrom P450 klass av enzymer. På grund av deras varierande och potenta biologiska effekter, det finns ett stort intresse för att studera dessa metaboliter. Att bestämma de unika rollerna för dessa metaboliter i kroppen är en svår uppgift, eftersom epoxifettsyror först måste erhållas i betydande mängder och med hög renhet. Att erhålla föreningar från naturliga källor är ofta arbets intensiva, och lösliga epoxihartser glukosidhydrolaser (Seh) hydrolysera snabbt metaboliterna. Å andra sidan, att få dessa metaboliter via kemiska reaktioner är mycket ineffektiv, på grund av svårigheten att få rena regioisomerer och enantiomerer, låg avkastning, och omfattande (och dyra) rening. Här presenterar vi en effektiv enzymatisk syntes av 19 (s), 20 (r)-och 16 (s), 17 (r)-epoxydokosapentaenoic-syror (EDPs) från DHA via EPOXIDERING med BM3, ett bakteriellt CYP450-enzym isolerat ursprungligen från Bacillus megaterium (som lätt uttrycks i Escherichia coli). Karakterisering och bestämning av renhet utförs med kärnmagnetisk resonanspektroskopi (NMR), högeffektiv vätskekromatografi (HPLC), och masspektrometri (MS). Detta förfarande illustrerar fördelarna med enzymatisk syntes av PUFA epoximetaboliter, och är tillämplig på epoxidering av andra fett syror, inklusive arakidonsyra (AA) och eikosapentaenoic syra (EPA) för att producera den analoga epoxyeicosatrienoic syror (EETs) och epoxyeicosatetraenoic syror (EEQs).
Introduction
Som intresse för den roll som fleromättade fett syror (särskilt Omega-3 och Omega-6 fleromättade fett syror) spelar i människans biologi har vuxit under de senaste åren har forskarna tagit notis om det stora utbudet av tilltalande fördelar som deras metaboliter Utställning. I synnerhet, epoxy fett syra metaboliter som produceras av cytokrom P450 klass av enzymer har varit en stor punkt i fokus. Till exempel, många PUFA epoxider, inklusive epoxyeicosatrienoic syror (Eets), epoxydocosapentaenoic syror (EDPs) och epoxyeicosatetraenoic syror (eeqs), spelar en avgörande roll i regleringen av blod tryck och inflammation1,2 , 3 för att , 4 för att , 5. intressant, de specifika enantiomererna och lägesisomererna av AA och EPA epoxider är kända för att ha varierande effekter på vasokonstriktion6,7. Medan de fysiologiska effekterna av enantiomererna och regioisomerer av EETs och EEQs har dokumenterats, är lite känt om effekten av den analoga epoxydocosapentaenoic syror (EDPs) bildas från DHA. Utbredd användning av fiskolja8, som är rik på både EPA och DHA, har också väckt intresse i Europeiska data tillsyns mannen9. Fördelarna med dessa tillskott tros vara delvis på grund av nedströms DHA metaboliter (16, 17-EDP och 19, 20-EDP är den vanligast förekommande) eftersom in vivo nivåer av data tillsyns mannen samordna mycket väl med mängden DHA i kosten10, med 11.
Att studera mekanismerna och målen för dessa epoxifettsyror genom metabolomik, kemisk biologi och andra metoder har visat sig vara utmanande, delvis på grund av att de existerar som blandningar av Regio-och stereo-isomerer, och en metod för att erhålla rena mängder av enantiomerer och regioisomerer krävs. Konventionella medel för kemiskt syntetisera dessa föreningar har visat sig vara ineffektiva. Användning av peroxisyror som meta-kloroperoxybensoesyra för epoxidering har många nack delar, särskilt bristen på epoxidering selektivitet, vilket nödvändiggör dyra och mödosamt rening av enskilda regioisomerer och enantiomerer. Total syntes av DHA och EPA metaboliter är möjligt, men också lider av nack delar som gör det opraktiskt för storskalig syntes såsom höga kostnader och låga avkastningar12,13. Effektiv total produktion kan åstadkommas med enzymatisk syntes, eftersom enzymatiska reaktioner är Regio-och stereoselektiva14. Studier visar att enzymatisk epoxidering av AA och EPA (med BM3) är både regioselektiv och enantioselective15,16,17,18, men detta förfarande har inte testats med DHA, eller på en stor Skala. Det övergripande målet med vår metod var att skala upp och optimera denna kemoenzymatiska epoxidering för att snabbt producera betydande mängder av rena epoxifettsyror som deras individuella enantiomerer. Med hjälp av den metod som presenteras här har forskarna till gång till en enkel och kostnads effektiv strategi för syntes av data tillsyns mannen och andra PUFA epoximetaboliter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Var försiktig: konsultera alla relevanta material säkerhets data blad (MSDS) innan du använder de listade kemikalierna.
1. uttryck av vildtyps BM3
- Inokulera pBS-BM3 transfekterade DH5α E. coli (en generös donation från Dr. F. Ann Walker) i 5 ml steril lb-buljong med 0,5 mg ampicillin tillsatt i en 20 ml kultur tub.
- Inkubera cell kulturen i en shaker vid 37 ° c i 24 timmar vid 200 RPM. Tillsätt natten förrätt kultur (5 mL) och 100 mg ampicillin till 1 L steril LB buljong i en fernbach eller Erlenmeyer kolv. Skaka vid 37 ° c i 6 h vid 200 rpm, sedan vid 30 ° c i 18 h vid 200 RPM.
- Samla och centrifugera cell kulturen vid 4 ° c i 10 min vid 1 000 x g. Kassera supernatanten och förvara cellpelleten vid-78 ° c till enzym rening.
Anmärkning: supernatanten kan antingen kemiskt steriliseras genom behandling med blek medel eller steriliseras med hjälp av en autoklav och sedan hälls ner i avloppet.
2. rening av BM3.
-
Celllys
- Tina cellpelleten på is och resuspendera i 40 mL iskall (4 ° c) lösningsbuffert (10 mM tris, 0,01 mM Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
Varning: PMSF är giftigt vid kontakt. - Medan på isen, Sonikera cellerna för 1 min med ett ultraljud Homogenisatorer (output power inställning 10, tull 100%), följt av en 1 min paus på isen för att lysera cellerna. Upprepa denna procedur 6 gånger. Centrifugera cellen lysat vid 4 ° c i 30 min vid 11 000 x g till pellets cell skräp.
- Tina cellpelleten på is och resuspendera i 40 mL iskall (4 ° c) lösningsbuffert (10 mM tris, 0,01 mM Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
-
Affinitet kromatografi
- Förbered en stark anjonbyteskromatografi (se tabell över material; diameter: 2,8 cm x 6 cm, kolonnvolym: 37 ml) genom tvättning med 5-KOLONNVOLYMER (CV) av buffert a (10 mm tris, pH 7,8) vid 4 ° c.
- Tillsätt celllysaterna till den utjämna kolonnen och Tvätta kolonnen med 3 CV för kallbuffert A. eluera BM3 genom att tvätta kolonnen med kallbuffert B (10 mM tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Samla in den rödbruna eluentfraktionen. Om proteinet inte används omedelbart, blanda det med en lika stor volym glycerol och Flash frysa med flytande kväve. Förvara den frusna lösningen vid-78 ° c.
3. epoxidering av DHA genom BM3
- Bered reaktionen genom att tillsätta 0,308 g (0,940 mmol) DHA i 18,8 mL dimetylsulfoxid (DMSO) till 2 L omrörningsbuffert (0,12 M kalium fosfat, 5 mM MgCl2, pH 7,4) tillsammans med 20 nM i det TINADE BM3-enzymet. Enzymet koncentrationen kan bestämmas av kolmonoxid/dithionitspektralanalys metod19.
- Medan lösningen omrörning, börja reaktionen genom att tillsätta 1 motsvarande NADPH (nikotinamid adenin nikotinamidadenindinukleotid fosfat reduceras, Tetra Sodium salt, 0,808 g, 0,940 mmol) upplöst i reaktionsbuffert. Rör om reaktionen i 30 minuter medan bubblande luft genom reaktions blandningen med en luftfylld ballong fäst vid en spruta och nål.
- Med hjälp av en spektrofotometer (se material tabell), kontrol lera reaktions blandningens absorbans vid 340 Nm för att avgöra om NADPH är utarmat. Om det inte finns någon kvarvarande absorbans som indikerar förbrukningen av NADPH, är reaktionen klar.
Normalt är reaktionen slutförd efter 30 min. - Släcka reaktions blandningen genom att sakta tillsätta 1 M oxalsyra, droppvis, tills pH-värdet i lösningen når 4.
4. utsugning av data tillsyns mannen
- Extrahera den kylda buffertlösningen med 2 L dietyleter (vatten fri, peroxid fri) 3 gånger. Samla in eterskiktet (6 L) och torka med vatten fritt magnesiumsulfat (MgSO4).
- Filtrera MgSO4 från lösningen och koncentrera det torkade eterskiktet på en rotationsindunstare för att ge den råa EDP-återstoden.
- Rena återstoden av Flash kolonnkromatografi (en 40 g kiseldioxid patron är tillräcklig). Börja med 10% etylacetat (EtOAc) i hexanes och ramp upp till 60% EtOAc i hexanes över 22 min.
Obs: tre stora toppar erhålls och samlas in, avgivande i storleksordningen 1. oreagerade DHA; 2. blandning av EDP-isomerer; och 3. (normala överoxidations produkter (se figur 1)). - Kombinera fraktioner och koncentrera dem på den roterande för ångaren. Från detta exempel, 0,074 g, (24%) av oreagerade DHA, 0,151 g (47%) av EDP-isomerer och 0,076 g (22%) av di-Epoxid erhölls.
5. esterifiering av Europeiska data tillsyns mannen, separation av 16 (s), 17 (r)-och 19 (s), 20 (r)-EDP och saponifikation av estrar
Varning: Trimetylsilyldiazmetan (TMS-diazmetan) är mycket giftigt vid både kontakt och inandning. Använd endast i ett Dragskydd med rätt personlig skyddsutrustning.
- Späd epoxiderna (0,151 g, 0,435 mmol) i en rundkolv eller en liten injektions flaska med 2 mL vatten fri metanol (MeOH) och 3 mL vatten fri toluen, tillsätt en rör-bar och tillsätt TMS-diazmetan (1,2 molar ekvivalenter, eller 0,26 mL av en 2 M lösning i hexanes) under argon.
- Vänta 10 min och tillsätt ytterligare TMS-diazometan (0,050 mL) tills en blekgul färg återstår.
- Efter 30 min, noggrant koncentrera blandningen med hjälp av den roterande för ångaren och rena återstoden av Flash kolonnkromatografi. Elute med 4% EtOAc i hexanes (med hjälp av en 40 g kiselgel kolumn eller patron) för 22 min. I detta exempel har 19, 20-EDP-metylester (0,116 g, 74%) och 16, 17-EDP-metylester (0,029 g, 19%), erhölls som klara oljor (total avkastning, 93%).
- Samla upp de fraktioner som innehåller de renade EDP-metylesterregioisomererna. 19 (s), 20 (r)-EDP-metylesterelutes först, följt av 16 (s), 17 (r)-EDP-metylester.
- Om några blandade fraktioner finns kvar (som innehåller båda isomerer, kan bedömas med tunnskiktskromatografi (TLC) i 8:1 hexan/EtOAc och färgas med kaliumpermanganat (KMnO4)), omkromatografi dem med samma lösnings medels system som tidigare.
- Koncentrera fraktionerna som innehåller de enskilda regioisomererna.
Anmärkning: vid denna punkt kan identitet och renhet bedömas av NMR (med hjälp av CDCl3 som lösnings medel, se legenden för figur 2). - För att omvandla enskilda EDP-metylesterregioisomerer till deras sura former, späd EDP-estern i THF: vatten (ca 0,7 mL/0,1 mmol ester). Tillsätt 2 M vattenhaltig LiOH (3 molar ekvivalenter) och rör över natten.
Anmärkning: fullständigheten av reaktionen kan bedömas av TLC, med hjälp av 3:1 hexanes/EtOAc, färgning med KMnO4; produkten har en lagrings faktor på ~ 0,3. - Släj reaktionen långsamt med myrsyra, tills blandningens pH når 3-4. Tillsätt vatten och etylacetat (1-2 mL/0.100 mmol ester) och separera lagren. Extrahera vatten skiktet med EtOAc (3 x 5 mL), tvätta med mättad saltlösning (NaCl) och torka EtOAc-skiktet över vatten fritt natriumsulfat (na2so4).
- Koncentrera etylacetatlösningen med en rotationsindunstare, tillsätt hexanes (10 mL) och koncentrera igen. Upprepa två gånger för att azeotropiskt ta bort restmyrsyra. Renar återstoden genom att blinka kolonnkromatografi, avgivande med 10-30% etoac över 15 min.
- Koncentrera de önskade fraktionerna och torka i vakuum att ge den renade syran.
Anmärkning: i detta skede, Enantiomeric renhet kan bedömas (genom kirala HPLC, se legenderna för figur 3 - figur 4 för kolumn och villkor). Kemisk renhet kan bedömas med C18 (achiral) HPLC (se material tabell och referens 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blixt kolonnkromatogrammet (utfört med hjälp av ett automatiserat system för blixt rening enligt beskrivningen nedan) som erhålls vid rening av den råa blandningen från enzymatisk epoxidering visas i figur 1. Efter esterifiering och separation av regioisomerer erhölls rena 16 (s), 17 (r)-EDP och 19 (s), 20 (r)-EDP-metylestrar. Typiskt, de är närvarande i en ungefärlig 1:4 till 1:5 förhållande, med den största produkten är 19 (S), 20 (R)-EDP. Inga andra EDP-regioisomerer (t. ex. 13, 14-eller 10, 11-EDP) erhålls. De 1H-NMR-spektra av 16 (s), 17 (r)-EDP (figur 2A) och 19 (s), 20 (r)-EDP (figur 2b) metylestrar tillsammans med deras strukturer visas nedan, vilket anger den höga renhets graden hos dessa föreningar C18 (achiral) HPLC av syran bildar också indikerade renhet > 98%. Deras identitet bekräftades ytterligare genom en hög upplöst massspektroskopi (både av syra-och Ester formerna), som gav massa-/laddningsförhållanden och fragmenteringsmönster som överensstämde med den identifierade data tillsyns mannen. Enantiomerisk renhet bestämdes med hjälp av kirala HPLC, i jämförelse med den autentiska enantiopure och den blandade standarden hos data tillsyns mannen (i deras sura form, figur 3a och figur 4a). Som kan observeras i figur 3B och figur 4b, är både data tillsyns mannen som erhålls genom enzymatisk epoxidering mycket enantiopure efter saponifikation (> 99% en enantiomer). Identiteterna för dessa enantiomerer rapporterades tidigare vara 16 (s), 17 (r)-och 19 (s), 20 (r)-EDP18.
Figur 1 . Kromatogram från rening av rå blandning erhållen från enzymatisk epoxidering av DHA (tillsammans med relevanta strukturer). Den mellersta toppen (monoepoxid) innehåller den önskade data tillsyns mannen. Rening utfördes med hjälp av ett automatiserat system för blixt rening (se material tabell). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Exempel 1H-NMR-spektra av ren 16 (s), 17 (r)-EDP-metylester (2a) och 19 (s), 20 (r)-EDP-metylester (2b). Spectra registrerades vid 500 MHz i CDCl3 (spädnings vätskan är synlig vid 7,26 ppm och restvatten vid 1,6 ppm). De kemiska förskjutningarna är följande: 16 (S), 17 (R)-EDP-metylester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.57-5.35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2,99-2,95 (m, 2 h), 2.87-2,83 (m, 6 h), 2.47-2.37 (m, 6 h), 2.29-2,21 (m, 2 h), 2.11-2,05 (m, 2 h), 0,99 (t, J = 7,5 Hz, 3 h); 19 (S), 20 (R)-EDP-metylester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.54-5.35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2,97 (td, j = 6,4, 4,2 hz, 1 h), 2,91 (td, J = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2,85-2.82 (m, 8 h), 2,44-2,36 (m, 5 H), 2,27-2,21 (m, 1 h), 1,65-1,51 (m, 3 H), 1,06 (t, J = 7,5 Hz , 3 H). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 3. Kirala HPLC som indikerar enantiopuritet på 16, 17-EDP (syra form) framställt av BM3. Figur 3a visar ett KIRALT HPLC-kromatogram av "racemisk" 16, 17-EDP (en konstgjord blandning av autentiska standarder för båda enantiomererna14), medan figur 3b visar ett kiralt HPLC-kromatogram av Enantiopure 16 (S), 17 (R )-EDP framställt genom epoxidering av DHA med BM3, bedömt som > 99% S, R isomer. Kolonnen är cellulosabaserade (se material tabell, 250 x 4,6 mm, 5 μm, 1 000 Å) elning med Isokratisk 45% 50 mM ammoniumbikarbonat (NH4HCO3) i metanol (30 min), med en prov koncentration på 0,5 mm och flödes hastighet på 1 ml/min. Vänligen Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 4. Kirala HPLC som indikerar enantiopuritet på 19, 20-EDP (syra form) producerat av BM3. Figur 4a visar ett kiralt HPLC-kromatogram av "racemisk" 19, 20-EDP (en konstgjord blandning av autentiska normer för båda enantiomererna14), medan figur 4b visar ett kiralt HPLC-kromatogram av Enantiopure 19 (S), 20 (R)-EDP framställt genom epoxidering av DHA med BM3, bedömt som > 99% S,R isomer (metod som beskrivs i figur 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Övergripande enzymatiska epoxidering reaktions schema och relevanta strukturer av AA, EPA, Eets, och eeqs produceras av denna metod vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Chiral HPLC som indikerar enantiopuritet av 17, 18-EEQ (syra bildar) producerat av BM3. Figur 6a visar ett KIRALT HPLC-kromatogram med "racemisk" 17, 18-eeq (en konstgjord blandning av autentiska standarder för båda enantiomererna14), medan figur 6b visar ett kiralt HPLC-kromatogram av Enantiopure 17 (S), 18 (R )-Eeq framställt genom epoxidering av EPA med BM3, bedömt som > 99% S,R isomer (metod som beskrivs i figur 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en operationellt enkel och kostnads effektiv metod för beredning av de två vanligast förekommande epoximetaboliterna av DHA-19, 20 och 16, 17-EDP. Dessa epoxi fett syror kan framställas i mycket enantiopure (som deras S, R-isomerer) form med VILDTYPS BM3 enzym. Flera kritiska punkter som kan användas för fel sökning, och förlängningen av vår metod för att förbereda enantiopure epoximetaboliter av AA och EPA, beskrivs nedan.
BM3 lagring rikt linjer
Det är möjligt att förvara det renade BM3-enzymet genom att blanda protein lösningen med lika stor volym glycerol och Flam frysning med flytande kväve före förvaring i frys-78 ° c. När enzymet är fryst, kan det lagras i upp till ett år. Enzymet kan bara Tinas en gång, måste tinas på is, och kan bara lämnas på is för 4 h. frysning igen, och tillåter enzymet att Tina utan ett isbad kommer att avaktivera enzymet.
Rikt linjer för kemisk lagring
Många av de föreningar som krävs för förfarandet är luft-känsliga. Dessa inkluderar DHA och andra PUFAs, data tillsyns mannen och andra epoximetaboliter, och NADPH. För att förhindra lipidperoxidation (och andra oxidativa processer) av dessa föreningar, spola alltid behållarna där de lagras med argon eller kväve och förvara vid-78 ° c.
En annan viktig anmärkning är den lösning där DHA lagras. Även om DHA är inte mycket stabil i DMSO, BM3 är oförenligt med etanol och metanol, så DMSO måste användas. För att motverka dess låga stabilitet måste DHA-blandningen beredas på nytt samma dag som epoxidation. Den totala DMSO-procenten i reaktions blandningen måste hållas under 1% för att undvika att enzymet inaktive ras. Dessutom, eftersom NADPH har en kort hållbarhets tid, bör koncentrationen kontrol leras med spektrofotometern före tillägg till reaktionen. Detta säkerställer att 1 motsvarighet till NADPH alltid tillsätts reaktions blandningen.
Epoxidation reaktion rikt linjer
Luft flödet från ballongen till reaktions blandningen måste upprätthållas för att reaktionen ska vara syresyrade eftersom syre är nödvändigt för epoxidering. Blandningen måste också röras snabbt, eftersom PUFAs inte är mycket lösliga i vatten (DHA: s löslighet är ≤ 125 μM i reaktionsbufferten). Reaktionen slätas med oxalsyra för att denaturera protein (eftersom det kelater metall och tar bort koffekt) och syra håller DHA dess neutral form, vilket är nödvändigt för dietyleter extraktion. Släckning av reaktions blandningen måste göras långsamt för att undvika syra katalyserad hydrolys av data tillsyns mannen.
Rikt linjer för EDP-extraktion och rening
Ether valdes specifikt som extraktionsmedel av flera skäl. Diklormetan kan utlösa proteinet ur lösningen, vilket komplicerar extraktionen. EtOAc extraherar glycerol (tillsätts med enzymet stam lösning), som är svårt att ta bort och stör blixten kromatografi.
EDP-regioisomerer i deras fria syra tillstånd är inte lätt att separera, vilket är anledningen till att regioisomererna blandas in i en enda topp i den första Flash kolumnkromatografi. När de omvandlas till metylestrar, lägesisomererna är lätt att separera. Dessutom är estrar i allmänhet mer stabila än de motsvarande syror för långtids lagring om syran form inte behövs omedelbart.
Metodens betydelse med avseende på befintliga/alternativa metoder
Vår metod ger en enkel och effektiv metod för att erhålla enantiopure EDPs, som har många fördelar jämfört med befintliga och alternativa metoder. För det första, kemisk epoxidering av DHA och andra PUFAs och deras derivat är varken regioselective eller enantioselective, och komplicerade blandningar erhålls ofta. Flera flash-kromatografi kolumner och förberedande HPLC, inklusive kirala förberedande HPLC, är därför nödvändigt att rena enantiopure epoxy fett syror från dessa blandningar, som är arbets intensiva och kan producera endast mycket små mängder av den önskade Metaboliter. Total syntes kan också användas för att producera epoxifettsyror, men det är rigorösa, tids krävande, kräver flera steg, och ger en låg total avkastning, medan BM3 enzymet är lätt att uttrycka och rena, och epoxidering är komplett inom en kort period av Tid. Vår metod är också kostnads effektiv: en kommersiell källa20 erbjuder för närvarande 16, 17-och 19, 20-EDP (som deras tävlings kamrater) för 528 usd/0,5 mg. 1 g NADPH kan också köpas för ~ 500-800 USD, och kan användas för att producera över 200 gånger mängden 19, 20- EDP (och cirka 50 gånger det belopp på 16, 17-EDP) som erbjuds kommersiellt för ett liknande pris-och i enantiopure former, som för närvarande inte är kommersiellt tillgängliga.
Metodens begränsningar
Eftersom detta enzym företrädes vis epoxidizes den sista dubbel bindningen av DHA, den största produkten är 19, 20-EDP (även om 16, 17-EDP produceras också). Därför kan andra DHA regioisomerer som kan önskas (t. ex. 13, 14-EDP, 10, 11-EDP) inte framställas genom enzymatisk epoxidering med vildtyps-BM3. Också, som endast SR-enantiomererna PRODUCERAS av BM3, RS-enantiomererna är otillgängliga, även om vår tidigare publicerade kemiska inversion metod14 kan användas för att syntetisera dem. Dessutom, på grund av den låga lösligheten av lipofila PUFAs i reaktionsbufferten, skulle mycket stora mängder buffert vara nödvändig för storskalig produktion (ca. 500-1000 mg) av data tillsyns mannen, som potentiellt skulle kunna göra utvinning tids krävande eller oöverkomliga.
Andra tillämpningar av metoden
Detta enzymatiska epoxidering-protokoll är också tillämpligt på EPA och AA (relevanta strukturer visas i figur 5). De koncentrationer, buffert och reaktions tid som krävs för epoxidering av alla tre fett syror är densamma. För EPA, den wild-typ BM3 enzymet används också, och EEQ fraktion erhålls från EPA (56% avkastning av monoepoxid), efter esterification är ~ 14:1 17, 18-EEQ: 14, 15-EEQ. I likhet med de observationer som gjorts för data tillsyns mannen är den erhållna 17, 18-EEQ mycket enantiopure (> 99% 17 (S), 18 (R)-eeq, se figur 6) som bedöms av kirala HPLC (se figur 3 legend och material tabell). Enantiomerernas identitet rapporterades tidigare17. För AA måste dock F87V BM3 Mutant användas i stället som vildtyp BM3 är en hydroxylas för AA21. Uttryck och rening av denna Mutant använder också ovanstående protokoll, och epoxidering utförs på ett analogt sätt. Med denna metod, 14, 15-EET erhålls som den enda regioisomer. Eftersom 14, 15-EET fri syra är oskiljaktig från oreagerade AA efter epoxidation är esterification nödvändig; 14, 15-EET metylester erhålls i 52% avkastning från AA. Kirala HPLC (se figur 3 legend och tabell över material) av syran indikerar mycket enantiopure (> 99%) 14 (S), 15 (R)-EET (som tidigare rapporter ATS)15. De kemiska förskjutningarna för dessa EPA-och AA-metaboliter är följande: 17 (S), 18 (R)-EEQ-metylester:1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 h), 2,96 (TD, j = 6,4, 4,2 Hz, 1 h), 2,90 (td, j = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2,85-2.79 (m, 6 h), 2,44-2.38 (m, 1 h), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 2 h), 2,26-2,20 (m, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,7 Hz, 2 h), 1,71 (kvintett, j = 7,4 Hz, 2 h), 1,66-1.50 (m, 2 h), 1,05 (t, j = 7,5 Hz, 3 h); 14 (S), 15 (R)-EET metylester: 1 den första H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 h), 2,95-2.92 (m, 2 h), 2,81 (DT, J = 17,8, 5,8 Hz, 4 h), 2,40 (dt, j = 14,1, 6,8 hz, 1 h), 2,32 (t, j = 7,5 Hz, 2 h), 2,23 (DT, j = 14,1, 6,8 Hz, 1 h) , 2,11 (q, J = 6,8 Hz, 2 h), 1,71 (kvintett, j = 7,4 Hz, 2 h), 1,56-1,41 (m, 4 h), 1,38-1,30 (m, 4 h), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3 h).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intresse konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av R00 ES024806 (nationella institut för hälsa), DMS-1761320 (National Science Foundation) och start medel från Michigan State University. Författarna vill tacka Dr jun Yang (University of California på Davis) och Lalitha Karchalla (Michigan State University) för att få hjälp med optimering av enzymatiska reaktionen, och Dr. Tony Schilmiller (MSU masspektrometri och metabolomics Facility) för hjälp med data insamling för HRMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
