Summary
Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.
Abstract
Canlı hücre görüntüleme, yaşam hücrelerinde hücre ve protein dinamiklerini incelemek için kullanılan bir mikroskobik tekniktir. Bu görüntüleme yöntemi toksik değildir, genellikle hücre fizyolojisine müdahale etmez ve minimal deneysel elleçleme gerektirir. Düşük düzeyde teknik girişim, araştırmacıların birden fazla mitozis döngüsü boyunca hücreler incelemelerine ve başından sonuna kadar mayoz gözlemlemek için olanak sağlar. Yeşil floresan protein (GFP) ve kırmızı floresan protein (RFP) gibi floresan etiketleri kullanarak, araştırmacılar fonksiyonları transkripsiyon, DNA çoğaltma, uyum ve ayrım gibi süreçler için önemli olan farklı faktörler analiz edebilirsiniz. Fiji (ücretsiz, optimize edilmiş ımagej sürümü) kullanarak veri analizi ile birleştiğinde, canlı hücre görüntüleme, protein hareketini, lokalizasyonu, stabilitesi ve zamanlamanın yanı sıra nükleer dinamikleri ve kromozom ayrımcılık yöntemlerini değerlendirmenin çeşitli yollarını sunar. Ancak, diğer mikroskopi yöntemleri ile olduğu gibi, canlı hücre görüntüleme ışık iç özellikleri ile sınırlıdır, yüksek büyütmelerde çözünürlük gücüne bir sınır koymak, ve aynı zamanda yüksek dalga boyu fotobleaching veya fototoksisite duyarlıdır Frekanslar. Ancak, bazı bakım ile, araştırmacılar dikkatlice doğru koşulları, suşları ve floresan belirteçleri mitotik ve Mayoz bölünmenin olayların uygun görselleştirme için izin seçerek bu fiziksel sınırlamaları bypass olabilir.
Introduction
Canlı hücre mikroskobu, araştırmacılar nükleer dinamikleri fisyon Maya hücrelerini öldürmeden incelemek ve ölümcül fiksatif ve lekeleri ihtiyacını ortadan kaldırır sağlar. Membran ve sitozin yanı sıra kromozom çoğaltma, yeniden kombinasyon ve ayrım gibi önemli olaylara katılan floresan etiketli proteinlerin istikrar, hareket, lokalizasyonu ve zamanlamasını gözlemlemek mümkündür. Hareket. Hücre canlılığı ve toksik olmayan sinyal tespiti koruyarak, minimal fizyolojik saldırı vardır. Düzgün şekilde gerçekleştirildiğinde, bu mikroskobik Yöntem, genişletilmiş teknik elleçleme veya sahte kimyasal reaktiviteye kaynaklanan karıştırıcı efektleri azaltabilir. Ayrıca, bir deney sırasında, araştırmacılar fisyon Maya beslenme ve stres durumları, proliferatif verimlilik ve uygunsuz görüntüleme parametreleri veya anormal Hücre fizyolojisi 1 gösteren apoptotik durum ilgili gözlemler yapabilirsiniz ,2,3.
Mitoz ve mayoz nükleer ve hücresel bölünme ile karakterize edilir. Meiosis 'te, mitozun aksine, ebeveyn hücrelerinin kız hücrelerini4' e yükselmesine karşın genetik içerik yarıya düşüdür. Canlı hücre görüntüleme uzamsal ilişkinin yanı sıra geçici bir boyut sağladığından, çok sayıda hücre gerçek zamanlı olarak incelenebilir. Canlı hücre mikroskobu, araştırmacılar Histonlar için floresan etiketleri kullanarak nükleer bölünme dinamiklerini incelemek için sağladı5, cohesin altbirimden6, mikrotübüller7, centromeres8, kinetochores9, bileşenleri mil direği gövdesi (SPB)10ve kromozom yolcu KOMPLEKSININ (CPC)11' i. Kromozom ayrışma cihazının dışında, canlı hücre görüntüleme de gerekli proteinlerin davranışını ele geçirdi, ancak doğrudan kromozom ayrımcılık dahil değil. Bu proteinlerin fonksiyonu çoğaltmayı etkileyen gösterilmiştir, kromozom rekombinasyon, nükleer hareket, ve mikrotübüller için kromozom Eki12,13,14. Bu gözlemler, fonksiyonel bileşenleri biyokimyasal veya genetik muayene için etkin olmayan hücresel olayların daha iyi anlaşılması için katkıda bulundular. Mikroskopi teknolojisindeki yeni gelişmeler ile, kötü çözünürlük, photobleaching, fototoksisite ve odaklama stabilitesi gibi sınırlamalar, böylece mitotik ve Mayoz bölünmenin nükleer dinamiklerin daha iyi gerçek zamanlı gözlemlerini kolaylaştıracak, azaltır1, 2,3. Meiosis, zamanlamaya yakın dikkat gerektiren bir Terminal farklılaşma yolu olduğu için özellikle zordur.
Bu protokolün amacı, mitoz ve Meiosis 'te gerçek zamanlı fisyon Maya nükleer dinamiklerini incelemek için nispeten basit bir yöntem sunmaktan ibaret. Bunu başarmak için, çevresel strese maruz kalmadı hücreleri kullanmak için gerekli olan, uzun süreli görüntüleme dayanabilir agaroz pedleri hazırlamak, ve tek hücreli dinamikleri görselleştirme kolaylaştırmak yoğunluklarda hücreleri monte. Dahası, bu protokol nükleer kinetik (Hht1-MRFP veya Hht1-Gfp), kromozom segregasyon (Sad1-DSRed), siterit dinamikleri (Atb2-MRFP), transkripsiyonel için yararlı belirteçleri olarak hizmet floresan etiketli protein taşıyan hücrelerin kullanımı yapar G1/S (Tos4-Gfp) ve mayoz (Rec8-Gfp) uyumu stabilitesi aktivasyonu. Bu yöntem, belirli hücresel süreçlerle ilgili soruları ele almak için farklı kombinasyonlarda kullanılabilecek ek nükleer ve sitosolik işaretçileri (Tablo ı) da tanıtır. Ayrıca, temel Fiji araçları araştırmacılar canlı hücre görüntüleri işlemek ve veri farklı türde analiz yardımcı olmak için özellikli. Bu yaklaşımın gücü, mitozis ve Meiosis 'in doğru şekilde yürütülmesi için integral olan süreçleri açıklamak için protein dinamiklerinin, zamanlamanın ve istikrarı gerçek zamanlı gözlemlerin kullanımından kaynaklanıyor.
Protocol
1. medya hazırlama15,16
- Stok çözümleri
- MgCl252,5 g ekleyerek 50x tuz stok çözümü hazırlayın · 6h20, 0,735 g CAcl2· 2H20, 50 g KCL, ve 2 g na2S04 bir şişe içeren 1 L distile su. Solüsyonu iyice karıştırın ve filtrasyon ile sterilize edin. Uzun süreli depolama için 4 °C ' de yerleştirin.
- 1 g pantotenik asit, 10 g nikoinik asit, 10 g inositol ve 1 L distile su içeren bir şişe biotin 10 mg karıştırarak bir 1, 000x vitamini stok çözüm olun. Solüsyonu iyi karıştırın ve filtrasyon ile sterilize edin. Uzun süreli depolama için 4 °C ' de tutun.
- 10, 000x mineral stok çözeltisi 5 gr Borik asit, 4 gr MnSO 4, 4 g ZnSO4· 7h2o, 2 g FeCl2· 6h2o, 1 g, 0,4 g Molibdıc asit, 0,4 g Cuso4· 5h20 ve 1 L distile su içeren bir şişede 10 gr sitrik asit. Solüsyonu iyice karıştırın ve filtrasyon ile sterilize edin. Uzun süreli depolama için 4 °C ' de yerleştirin.
- 1 L distile su içeren bir şişe içine iki adenin, lösin, histidin veya lizin 7,5 g ekleyerek bireysel besin stok çözümleri yapın. Urasil solüsyonu yapmak için sadece 3,75 g kullanın. Otoklavlama ile çözeltileri sterilize edin.
Not: Zamanla, urasil çözeltinin dışında çökelir. Solüsyona tekrar getirmek için, mikrodalga fırın içinde% 60 ' lik güç 10 s artışlarla veya 55 °C su banyosuna 20 dk. kadar ısıtın. tüm urasil kümeleri yok olana kadar sıcak solüsyonu yerleştirin.
- Maya özü artı takviyeleri (YES)
- 2 L Flask içinde, 1 L distile su, 5 g maya özü tabanı, 30 g glikoz ve 225 mg adenin, urasil, L-histidin, L-leucine ve L-lizin ekleyin. Katı orta yapmak için agar 20 g ekleyin.
- Çözeltinin içine malzemeyi tamamen çözmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Orta otoklavlama ile sterilize edildikten sonra agar eriyecek.
Not: Kolaylık sağlamak için, kullanıma hazır YES tozu da ticari olarak mevcuttur.
- Edinburgh minimal Orta (EMM) ve pombe glutamat Orta (PMG)
- 2 L Flask olarak, 1 L distile su 3 g potasyum hidrojen ftalat, 2,2 g na2HPO4, 5 g NH4CL, glikoz 20 g, 20 mL tuz stok çözüm, 1 ml vitamin stok çözüm birleştirir ve 0,1 mL mineral stok çözeltisi. Yerine NH4Cl ile 2,2 g L-glutamik asit Monosodyum tuz PMG hazırlamak için. Katı orta yapmak için, agar 20 g ekleyin.
- Manyetik karıştırın çubuğu kullanarak, maddeleri iyice çözülür. Orta otoklavlama ile sterilize edildikten sonra agar eriyecek. Kullanmadan önce, gerektiğinde besin stok çözümlerini ekleyin. Her 1 L orta için, 15 mL her adenin, lösin, histidin ve lizin ekleyin. Diğer besin çözeltileri daha az konsantre olduğundan, urasil için 30 mL kullanın.
Not: Kolaylık sağlamak için, kullanıma hazır EMM ve PMG tozları da ticari olarak mevcuttur.
- Malt özü (ME)
- 2 L damıtılmış su 1 L malt özü ve 225 mg her adenin, urasil, histidin ve leucine ile karıştırılır. PH 5,5 için ayarlayın. Katı orta yapmak için agar 20 g içerir.
- Manyetik bir karıştırma çubuğunu kullanarak bileşenleri çözüme dağıt. Orta otoklavlama ile sterilize edildikten sonra agar eriyecek.
- Takviyeleri ile sportif agar (SPAS)
- 2 L Flask içinde, 1 L distile su, 10 g glikoz, 1 g KH2Po4, 1 mL vitamini stok, 45 mg her adenin, urasil, histidin, leucine ve lizin hidroklorür ekleyin. Katı orta yapmak için agar 20 g ekleyin.
- Malzemeyi iyice birleştirmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Orta otoklavlama ile sterilize edildikten sonra agar eriyecek.
2. Fission Maya kültürü15,16
- Kriyojenik koruma fisyon maya suşları uyanmak için Yes katı orta kullanın. Her bir gerilimin sıcaklık gereksinimlerine bağlı olarak, 3-5 gün boyunca 25 °C ya da 32 °C ' de inkübe edilir.
- Koloniler görünür olduğunda, başlangıç sıvı kültürü hazırlayın. Bireysel kolonilerden hücreleri pick ve 3 ml Yes sıvı orta içeren test tüpleri içine aşılamak. Orta veya geç günlük aşamasına uygun sıcaklıkta büyütün.
Not: Uygun havalandırması için, borular veya flsorlar ile ilgili sıvı kültürü hacmine göre en az 5 kat daha büyüktür. 150-220 rpm arasında sallama hızları rutin kültür büyümesi için gelenekcüdür. - 9.75 mL, Evet, EMM veya PMG artı uygun takviyeleri içeren bir 50 mL Flask içine Starter kültürü μL 250-500 dispense. Hücrelerin istenilen yoğunluğa yetişmesine izin verin ve uygun hücre morfolojisi ve beslenme durumu için mikroskop altında kontrol edin.
Not: Bir aya kadar uyanır suşları saklamak için, 4 °C ' de parafin bandı ve yer ile YES plakaları mühür.
3. numune hazırlama2
- Mikroskop slayt kurulum
- En az orta artı takviyeleri (mitoz) veya sıvı Spa (Meiosis) 100 ml içeren bir 500 ml kabı 2 g agaroz ekleyin. 10 sn artışlarla% 60 ' lik bir mikrodalga fırınında agaroz solüsyonu ısıtın veya 10 dakika boyunca 55 °c su banyosuna yerleştirin. verimli erime sağlamak için çözüm girdap. Hızlı Pad hazırlığı için agaroz slayt yapma kurulumunu (Şekil 1a) hazırlayın ve erimiş agaroz 'nin zamanından önce katılaştırmasını engelleyin.
- Erimiş agaroz 'nin oda sıcaklığında 1 dakika soğumasını ve 50-100 μL lekeleri, geniş çap pipet uçları kullanarak mikroskop slaytlarında dağıtmasına izin verin. Agaroz soğutmadan önce, yaklaşık 1,5-2 cm çapı (Şekil 1B-C) bir yayılma Pad oluşturmak için üst bir mikroskop slayt yerleştirin. Agaroz yastık genişliği genellikle görüntüleme süresi uzunluğuyla orantılıdır. Başka bir deyişle, kalın pedler daha uzun görüntüleme dönemleri dayanabilir.
- Kalın agaroz pedleri ile slaytların uygun kapsama sağlamak ve lamel magazini kenarları solvent maruz kalma hücre ölümü önlemek için bir sızdırmazlık maddesi olarak bir hidrokarbon karışımı kullanın. 500 mL 'Lik bir Beaker içinde petrol jölesi, lanolin ve parafin eşit parçaları (w/w) karıştırın. 120 °C ' de sıcak plakalı ısı maddeleri 5 dk. Bileşenleri erime olarak, dikkatle uygun karıştırma sağlamak için erimiş çözüm girdap.
- Örnek kurulum
- Mitotik olayların incelenmesi için, her iki sıvı EMM veya PMG artı takviyeleri yaklaşık orta günlük faz (OD595 0,4) başlangıç kültürlerinden hücreleri büyümek. Santrifüjü 1 ml hücre süspansiyon 1.375 x g 1 dakika, süpernatant kaldırmak ve en az orta artı takviyeleri hücre Pelet 100 μL son hacmine yeniden pelletini.
- Görüntü Mayoz bölünmenin olaylar için, minimum orta artı takviyeleri başlangıç kültürlerinden hücreler büyümek geç günlük faz (OD595 0.7-1.0). 1 mL hücreli süspansiyona karşı montaj ilişkisi tipi hücrelerin eşit hacimlerini (h- ve h+) birleştirin. Santrifüjler at 1.375 x g 1 dakika ve sıvı Me Pelet pelletini. Verimli besin kaldırma sağlamak için bu adımı tekrarlayın.
- Son Me yıkama sonra, benim 1 ml pelletini hücreleri ve bir 50 ml Flask 9 ml Me içeren ekleyin. Minimum dönme hızı (50-100 RPM) üzerinde 22-25 °C ' de 12-16 h için kulkaylık yapın. Bol hücre Flocculation, hangi sonuçları birçok yuvarlak fisyon Maya kümeleri ve verimli çiftleşme gösterir.
- 1 dk. için 1.375 x g 'de çiftleşme kültürü ve santrifüjler, 1ml örnek almak süpernatant ortadan kaldırmak ancak hücreleri yeniden pelletini tüp 250 μL bırakın. Agaroz pedleri üzerine hücreler yerleştirmeden önce, 5 s için güçlü Vortex kümeleri bozmak için.
Not: Kalan 250 μL Me hücrelerini yeniden pelletini için kullanılan hücreler Meiosis girmek yardımcı olmak çiftleşme faktörleri içerir. - % 2 agaroz yastık üzerine 20 μl ya da mitotik veya meiyotik bir hücre süspansiyonu yerleştirin. Slayt ters çevirme ve 2-3 s (Şekil 1D) için bir Lint ücretsiz kağıt havlu üstüne koyarak herhangi bir aşırı orta çıkarın. Slayt ped-tarafı yukarı ayarlayın ve yavaşça hava kabarcıkları (Şekil 1F) oluşturmak için sağlamak, bir cam coverslip yerleştirin.
Not: Kağıt havlusu ile aşırı orta ortadan kaldırılması, özellikle mayoz deneylerinde kritik olan yerçekimi emiliminden daha uzun süre etkilidir. - Bir hücre monolayer oluşturmak için, bir (mitoz) veya iki (Meiosis) tam döner (Şekil 1F) için işaret parmağı ile lamel magazini saat yönünde döndürün. Hücre maddenin agaroz yastık üzerinde dağıldığından emin olun tek hücrelerin veya ascı daha iyi ayrılması için izin. Küçük bir ahşap sopa yardımıyla, her agaroz Pad (Şekil 1G) mühür için lamel magazini kenarları boyunca erimiş dolgu dağıtmak.
- Agaroz Pad mühürlendikten sonra, mikroskop aşamasına yerleştirin ve uygun görüntüleme koşullarında (örn. sıcaklık) 10-15 dakika için dengelenmesini sağlar (Şekil 1s) hava kabarcıklarının dağılmasına ve son dakika agaroz vardiyaları oluşmasına izin verir. Slayt verimli bir şekilde dengelenmiş ve veri toplama bitinceye kadar sahne alanı 'ndan kaldırmayın bir kez görüntüleme başlayın.
Not: Sıcaklık ve nem kontrolü, kullanılan mikroskop sistemi ve spesifik deneysel gereksinimler tarafından belirlenir. Eğer varsa, sıcaklık ve nem kontrolünü tüm görüntüleme deneylerine uygulayın. Yoksa, araştırmacılar özellikle mayoz deneylerinde sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için bir yol geliştirmelidir.
4. canlı hücre görüntüleme2 ve işleme
- Görüntüye uygun görünüm alanlarını bulmak için 40X hedefini kullanın. Veri edinme başlamak için 60x hedefe geçin. Kullanılan mikroskop sistemine bağlı olarak, her zaman noktasında örnek üzerinde sonraki refocusing ve kesişme el ile veya bir mikroskop veya yazılım otomatik işlem yoluyla ortaya çıkar.
Not: Bu protokolde sunulan görüntüler, sedat, RFP ve GFP filtre setleri, nano hareket aşaması, 60x NA 1,4 objektif objektif ve 12-bit CCD kamera ile donatılmış bir deconvolution, floresan mikroskop kullanılarak toplandı. Dahili mekanik panjurlar ve düşük uyarma maruz kalma ve numunelerin photobleaching için izin motorlu filtre tekerlekleri. - Görüntüleri almak ve işlemek için uygun yazılımı kullanın. Görüntüleri deconvolve için, üretici tarafından sağlanan optik aktarım fonksiyonları istihdam.
Not: Bu protokolde kullanılan mikroskop donanımları ve yazılımları hakkında ayrıntılı bilgi için malzeme tablosunabakın. - Canlı hücre görüntüleri elde etmek için geleneksel bir floresan mikroskop kullanmak için mikroskop dijital veri toplar emin olun, 40X veya 60x 1,2 daha büyük sayısal diyafram (NA) hedefleri vardır ve optik seksiyonlama yapabilir.
Not: Bu gereksinimler olmadan, görseller mikroskobik ölçümler ve nitel gözlemler kalitesini tehlikeye, düşük çözünürlük gösterecektir. - Görüntü edinme17,18,19,20 sırasında kontrast kaybına neden olan sistematik bulanıklık hatalarını en aza indirmek ve uygun nicel analizini sağlamak için ücretsiz plug-in programları (örn., Fiji) kullanın yoğunluğu ve hücre içindeki diğer temporal ve dinamik olayların.
Not: Diğer mevcut ticari deconvolution programları malzeme tablosunda bulunabilir. - En iyi gözlem altında fluorophores eşleşen mikroskop filtre setleri seçin. Uyarma ve emisyon filtrelerinin floresan proteinlerin spesifik olarak algılanmasını sağlayan sağ bant geçişleri olduğundan emin olun. Örneğin, CFP sinyalini algılamak için 430/25 ve 470/30 bir uyarma ve emisyon bandı geçişi uygundur, ancak RFP floresans için değil.
- Çoklu zaman noktalarında görüntüleme fisyon Maya zaman en az etkili ayarlar yaklaşımı (MESA) kullanın. Başka bir deyişle, uyarılma dalga boylarını uzun süreli kullanmaktan kaçının ve kabul edilebilir, henüz ölçülebilir ve tekrarlanabilir görüntüleme verileri üreten en düşük uyarma gücü ve pozlama süresini kullanın.
- Mitoz veya Meiosis sırasında uzun süreli görüntüleme için, toplama zaman noktaları arasındaki aralığı 5-10 dk 'ye sınırlandırın. % 2 agaroz pedleri 12 ila 16 h görüntüleme seanslarına dayanabilse de, agaroz buharlaşma nedeniyle hücre değiştirme olasılığı yüksektir. Bu nedenle, sırasıyla 4-6 h veya 8-10 h pencerelerde tam mitoz veya mayoz denemeleri gerçekleştirin.
- En az 24-48 edinme zaman noktalarından oluşan 4-8 h için görüntüleme verilerini, sırasıyla bir floresan proteini, zaman noktası başına bir z-yığını ve 60x amacı kullanılarak 0,5-μm aralıkla 13 bölümden oluşan floresan kanalı toplayın. Bu, en az 0.5-1 GB sabit disk depolama alanı gerektirir. Böylece, photobleaching ve hücre değiştirme ortadan kaldırılması yanı sıra, bilgisayar yetenekleri1,2,3dikkate alan bir iş akışı oluşturun.
Not: Bu edinme parametreleri genellikle mikroskop fonksiyonlarını kontrol eden ve görüntüleri toplayan ve işleyen yazılımla ayarlanır ve değiştirilir. - Daha yakın ayrıntılı olarak belirli nükleer süreçleri incelemek için, her 5-10 s görüntü edinme gerçekleştirmek, emisyon sık maruz kaldıktan sonra önemli ölçüde azalmaz sürece. Toplanan verilerin doğruluğunu artık güvenilir olan noktası belirlemek için farklı zaman aralıklarında bir ön floresan yoğunluğu Analizi yürütmek1,3.
- Görüntü edinme ve görüntü işleme yazılımı, dikey konumu ne olursa olsun 2B düzlemde yüksek floresan yoğunluğu ile tüm yapıları gözlemlemek için görüntü z-yığınları üzerinde maksimum yoğunluk projeksiyon kullanın1,2, 3' ü yapın. Bu, farklı voxels içinde meydana gelen nükleer süreçlerin hızlı bir şekilde incelenmesi kolaylaştırır. Gözlem altında hücrelerin bir referans resmi oluşturmak için bir orta odak parlak alan görüntü toplayın.
5. ımageanaliz20,21
Not: Bu protokoldeki görüntü analizi Fiji kullanılarak gerçekleştirilir. Diğer analiz programları ve Fiji eklentileri için malzeme tablosunugörmek.
- Eklentileri menüsü altında Bio-formatları ithalatçı özelliğini seçerek bir deconvolved görüntü yükleyin. Içe aktarma seçenekleri açılır penceresinde hyperstack, varsayılan renk modu'nu seçin ve Tamam düğmesine basmadan önce Otomatik Ölçekle 'yi işaretleyin.
- Görüntülenen pencerenin alt kısmındaki ilgili çubuklarda yan kaydırarak doğru sayıda floresan kanalı ve zaman çerçevesi olduğundan emin olun. Verileri sıkıştırmaz ve bilgi kaybını engelleyen bir tiff dosyası olarak kaydedin.
- Mikroskop yazılımı tarafından veri işleme sırasında oluşturulan bir ölçek çubuğunu içeren bir görüntüyü açın. Benzer boyutta paralel bir çizgi çizmek ve analiz menüsünden ölçü 'i seçmek için düz çizgi aracını kullanarak ölçek çubuğunun piksel uzunluğunu belirleyin. Analiz menüsünden ölçek ayarla seçeneğini belirleyerek görüntü pikseline μm oranını ayarlayarak bir ölçek çubuğu ekleyin.
- Ölçeklendirmeli açılır pencerede, hesaplanan uzaklığı piksellere ve bilinen mesafeye μm cinsindengirin, piksel en boy oranını 1,0 olarak ayarlayın, mikron uzunluğu birimolarak yerleştirin ve genel kutuyu tıklatmadan önce kontrol edin Ok düğmesine basın.
- Ölçümseçildiğinde ölçmek için farklı parametreler seçmek üzere analiz menüsünün altındaki ölçümler ayarla seçeneğini kullanın. Bu protokol amacıyla aşağıdaki ölçümleri seçin: alan, çevre, Ortalama gri değer, medyan, Min & maksimum gri değer, entegre yoğunluk, yığın konumuve ekran etiketivardır.
- Toplanan verilerin hassasiyetine bağlı olarak, ondalık basamak seçeneği için 1 ' den fazla girin ve gerekirse bilimsel gösterim kutusunu işaretleyin. Hesaplama komutu uygulandıktan sonra, sonuçlar açılır penceresi her bir parametre için değerleri gösterecektir. Sonuçları bir istatistik programında gelecekteki analiz için. csv dosyası olarak kaydedin.
Not: Bu durumda aşağıda ayrıntılı adım takip farklı renkler arasında sinyal paraziti olmadıkça, uzunluğunu belirlemek için onun kurucu floresan kanalları içine bir görüntü ayırmak için gerekli değildir. - Sinyal paraziti durumunda, Görüntü menüsünden renk ve kanallar aracı 'nı seçin ve her bir rengi ayrı olarak analiz edin. Doğrusal olmayan yapıların uzunluğunu ölçmek için, çizgi aracı 'nı sağ tıklatın ve istenen nesneleri izlemek için bölümlenmiş çizgi veya FreeHand Line seçeneğini kullanın.
- Doğrusal yapılar için veya iki nokta arasındaki mesafeyi belirlemek için düz çizgi özelliğini kullanın ve analiz menüsünden Ölçü seçin. Μm cinsinden uzunluk değerleri, ölçümleri ayarla seçeneğinin altında önceden seçilen parametrelere otomatik olarak eklenir.
- Sinyal boyutu ve floresan yoğunluğunda yapılan değişiklikleri ölçmek için, önce bir ilgi alanı (YG) Kütüphanesi oluşturun, bu da ölçüm doğruluğunu artırır ve görüntü yığınında hızlı ölçümleri kolaylaştırır. Resim menüsünün altındaki renk ve Kanallar aracını seçin.
- Kanallar açılır penceresinde, yoğunluk veya alanın ölçüleceği renk kanalını kontrol edin. Görüntü menüsünün altındaki Ayarla ve eşik özelliklerini seçin. Karanlık arka plan kutusunu kontrol edin, varsayılan yöntemi seçin (toplanan veriler tarafından aksi gerekmedikçe) ve ilgi sinyallerini bindirme için kırmızı seçeneğini belirleyin.
Not: Protein stabilitesi, hareketi ve lokalizasyonu ölçümü, YG kitaplıkları oluşturmak için kullanılan renk eşiğine yakından bağlıdır. 17,18olarak görselleştirilen floresan işaret sinyalinin türü için doğru eşik yöntemini seçmek önemlidir. - Her ilgi yapısını vurgulamak için Değnek aracını kullanın ve seçilen YG 'Yi açılır YG Yöneticisi penceresine eklemek için klavyede T harfini basın. Görüntü yığınındaki her dilim (zaman çerçevesi) için bu işlemi yineleyin ve daha fazla düğmeye tıklayarak ve Kaydet'ı seçerek tüm Rois deposunu saklayın.
- YG yöneticisini yüklemek Için sıkıştırılmış YG klasörünü açın ve sol taraftaki paneldeki her YG tanımlayıcısını tıklayın. Analiz menüsünden Ölçü seçin ve görüntü yığınının tüm dilimleri ilgi NESNELERI ölçmek için her YG tanımlayıcısı bu komutu yineleyin.
- Hücre değişimi bir sorun değilse ve odak düzlem yığının tüm dilimleri için aynı kalır, YG yöneticisinde Multi Measure tıklayın. Açılır pencerede, ölçümleri görüntü yığını boyunca yinelemek için, dilim başına bir satır yerine Tüm dilimleri ölçün 'i seçin. Sonuçları bir CSV dosyası olarak kaydedin ve ölçümleri bir istatistik programında analiz edin.
- İlgi yapısını içeren birden fazla nükleer sinyal için, tek bir YG oluşturmak için Wand aracıyla nesneleri seçerken Shift tuşuna basın. Alternatif olarak, tüm ilgi sinyalleri kapsayacak şekilde Oval aracı ile sabit boyutta bir YG oluşturun.
Not: Bu oval yaklaşım, floresan sinyalinin boyutta ve zamanla yoğunlukta değiştiği bir alan üzerinde sinyal davranışını ölçmek ve açıklamak için gerekli olabilir. Sinyal yoğunluğu, bu durumda, belirli bir alan üzerinde ortalama sinyal yoğunluğudur. - İki Floresan sinyalinin ortak lokalizasyonu ile sinyal çakışan bölgenin renk değişikliğiyle niteliksel olarak belirlenir. Ancak, ortak yerelleştirme bölgesi daralır, sinyal çakışmayı ayırt etmek daha zordur. Bu durumda, aşağıda ayrıntılı adımları izleyin.
- 5,6 adımda açıklandığı gibi kanallar aracını kullanarak, söz konusu sinyalin üzerine düz bir çizgi çizin ve analiz menüsünün altındaki profil çizim komutunu seçin.
- Aynı çizilmiş satırı kullanarak söz konusu tüm renkler için bu adımı yineleyin.
- Her profil oluşturma adımının ardından görünen örnek açılır penceresinin grafiği , bir Çizim değerleri penceresini çağırmak için liste düğmesine basın ve her sinyal için ölçümleri bir CSV dosyası olarak kaydedin.
- İstatistik programında, her sinyal için gri değeri çizilen çizgi boyunca ilgili konumuna (μm cinsinden) karşı çizer bir grafik oluşturun. Sinyal profili çizimleri arasında örtüşme eksikliği genellikle Co-yerelleştirme eksikliği gösterir.
Not: Sinyal Co-yerelleştirme incelemek için yansıtılmış görüntüler üzerinde Plot profil aracını kullanın. Bu, sadece bu tür bir çakışma görüntü z-yığını aracılığıyla gözlenen güvenilirdir.
- Zaman içinde floresan proteinlerin dinamik davranışını izlemek için analiz menüsünün altında bulunan Multi kymograph aracını kullanın. Elde edilen görüntü, tek bir zaman noktalarını temsil eden z-yığınının her dilimi içinde bir dizi yoğunlaştırılmış Snapshot aracılığıyla floresan sinyal hareketini gösterir.
- Kanallar aracı , doğru kanalda ilgi nesne yalıtmak için adım 5,6 açıklandığı gibi kullanın. Seçili nesne veya yapı z-yığını önemli ölçüde vardiya değil emin olun. Nesnenin üzerine düz bir çizgi veya dikdörtgen yerleştirin, analiz menüsünden Multi kymograph aracını seçin ve nesnenin üzerinde yer alan çizginin istediğiniz genişliğini girin.
- 5,6 adımda açıklandığı gibi kanallar aracını kullanarak ve Görüntü menüsünden yığınlar ve montaj yap araçlarını seçerek belirli bir zaman penceresinde nükleer dinamikleri gösteren görüntü panelleri oluşturun. Montaj yap açılır penceresinde, istenen sütun ve satır sayısını girin, 1,0 ölçek faktörü ayarlayın, Ilk ve son dilimleri (zaman dilimlerini) seçin ve Tamam 'a basmadan önce kenarlık genişliğini en az 5 olarak değiştirin. Hangi görüntüleri değiştirerek göstermek için yığınında seçmek mümkündür artışları istenen sıra uyacak şekilde.
- Bir film oluşturmak için istenen hyperstack 'i yükleyin, Dosya menüsünden bir avı dosyası olarak Kaydet seçin, sıkıştırmaiçin hiçbiri seçin ve 2-8 fps kare hızını girin. Görüntüyü kapsayan tüm renkleri birleştirmek veya ayırmak için Kanallar aracında kompozit alırken montaj yap komutunu seçin.
Not: Bu protokolde iki avi dosyası (Movie 1-2) sağlanır. 5. adımda vurgulanan farklı özellikleri denemek için Fiji 'de bunları kullanın. - Tek bir temsili hücreyi göstermek için, görüntü menüsünden Dönüştür ve Döndür 'ü kullanın ve döndürme derecelerini girin. Pozitif değerler nesneleri sağa döndürürken negatif sayılar nesneleri sola döndürün. Hücre uygun yönde olduğunda, z-yığını veya ilgi zaman dilimleri sırasında tüm hücreyi kapsayan bir dikdörtgen çizin ve görüntü menüsünden kırpma seçin. Adım 5,16 ve 5.16.1 bir görüntü paneli veya film oluşturmak için belirtildiği gibi devam edin.
- Bir film oluşturmak için istenen hyperstack 'i yükleyin, Dosya menüsünden bir avı dosyası olarak Kaydet seçin, sıkıştırmaiçin hiçbiri seçin ve 2-8 fps kare hızını girin. Görüntüyü kapsayan tüm renkleri birleştirmek veya ayırmak için Kanallar aracında kompozit alırken montaj yap komutunu seçin.
- Analiz menüsünden Araçlar ve ölçek çubuğu seçerek Görüntü paneline veya filme bir ölçek çubuğu ekleyin. Ölçek çubuğu açılır penceresinde, tek hücreler veya tüm görünüm alanları için 100-250 için mikron cinsinden genişlik için 5-15 girin, renk için beyaz veya siyah 'ı seçin ve Ölçek çubuğunu yerleştirmek için uygun bir konum seç.
- Film için, nükleer olaylar sırasında zaman ilerlemesi göstermek yararlıdır. Çerçeveler arasında zaman değişimi göstermek için resim'i seçin, yığınlar 'ı tıklatın, zaman Stamper aracını kullanın, zaman serisindeki başlangıç çerçevesini belirtin ve zaman göstergesi için uygun bir konum seçin.
Representative Results
Canlı hücre görüntüleme mitoz veya Meiosis için kullanılıp kullanılmayacağını, her türlü gözlem yapmadan önce sağlıklı fisyon Maya hücreleri istihdam etmek çok önemlidir. Elde edilen verilerin kalitesi yoğun olarak başlangıç malzemesine dayanır. Hücre besin sınırlaması veya aşırı büyüme nedeniyle açlıktan, onlar aşırı vakoller ve azalan hücre boyutu gösterecektir (açlık, Şekil 2a). Mitozis deneyleri için, hücresel stres gösteren hücreleri kullanmaktan kaçınmak en iyisidir (açlık, Şekil 2a). Aksi takdirde, deneysel sonuçlar tutarsız ve yeniden üretilemeyen olacaktır. Bu sınırlama aşmak için, uygun vahşi tip kontrolleri seçin ve ilgi mutantların çeşitli fenotipleri aşina olun. Örneğin, mitotik hücreler için açlıktan 12 h aktif DNA çoğaltmak için ateşkes. Tos4-Gfp ifadesi G1/S-faz etkinliği22,23, bu marker ve nükleer bölünme (Sad1-DSRed10) göstermek Pan-nükleer Tos4-Gfp ifade, Sad1-DSRed odakları taşıyan Logaritmik hücreler ile ilişkili olduğundan ayrılık ve devam eden septasyon (aktif DNA replikasyonu ve hücre bölünmesi düşündürmektedir) (log, Figure 2A), açlık hücreleri böyle bir aktivite gösterirken (açlık, Şekil 2a). Bu sonuç, G1 'de transkripsiyonu azaltan, G1/S hücre döngüsü kontrol noktasını aktive eden ve G0 giriş5' i destekleyen, fisyon Maya 'daki besin sınırlamasının etkileri ile uyumludur. Mayoz deneyler için, hücreler yüksek yoğunluklu, ancak sabit faz ulaşmadan büyümek gerekir. Daha sonra, her iki montaj ilişkisi türünün hücreleri karışık ve düşük azot medyasında birlikte inkübe edilir. Hücre yeterli nitrojen değil, onlar mayoz (verimsiz, Şekil 2B) girmesini engelleyecektir değildir zaman Mate için başarısızlık. Montaj hücre süspansiyonunun sağlam flokülasyon hücre-hücre etkileşimi artırır ve böylece başarılı çiftleşme ve verimli Mayoz bölünmenin indüksiyon gösterir (verimli, Şekil 2B).
Agarose jel yastıkları ve hücre kümeleri fiziksel bozulma tek hücrelerin veya Asci doğru görselleştirme garanti (log, Şekil 2a; Verimli, Şekil 2B). Pedler, hücrelerin aynı anda yerinde sabitlendiği ve kurutmaya karşı korunan, sert ama nemli bir platform sağlamalıdır. Buna ek olarak, pedler evaporasyon nedeniyle değişikliklere dayanacak kadar kalın olmalıdır ve görüntü edinme boyunca uygun odaklama sağlayan bir tesviye yüzeyi sağlar (Şekil 1C). Coverslip döndürme ayırmak ve çiftleşme toplamları içinde hücreleri yaymak için gereklidir (Şekil 1F; Verimli, Şekil 2B). Bu adım olmadan, birkaç ascı ama çok sayıda haploid hücreler görülür, çünkü Asci çiftleşme kümeleri erişilemeyen katmanları içinde sıkışıp kaldığından, haploid hücreler mevcut tüm tek tabakalı lekeleri doldurmak için ücretsizdir (Şekil 2B). Hatta hücre küpleme daha az sorunlu mitotik deneyler için, lamel magazini rotasyon hücreler arasında yeterli boşluk ile tek bir hücre tabakası oluşturmak için Pad etrafında hareket hücreler kalabalığı etkilerini azaltmak ve hücre çoğaltma için izin (log, Şekil 2a ).
Atb2, fisyon Maya mitozu ve mayoz7,14' te kromozom segregasyonu ile ilgili bir α-tubulin bileşenidir. Floresan etiketli zaman, bu sitozit bileşeni mitozis nükleer ayrımı karakterize aşamaları incelenmesi için izin verir. Profaz (0 '-20 ', Şekil 3A) sırasında, mitotik iğ Nükleasyon Spindle Pole organları (KMS) nükleer tarafında oluşur, Atb2-MRFP lifleri tarafından ortaya çıkan bir HTT1-Gfp5 Pan-nükleer arka plan. Metafaz-anaphase geçişi sırasında (20 '-40 ', Şekil 3A) mitotik iğ dışa doğru uzanır ve çekirdeğin ikiye ayrılır. Hücre telofase girdiğinde (60 '-80 ', Şekil 3A), Atb2-MRFP kromozomlar tamamen ayrılıncaya kadar çift taraflı olarak genişletir. Bu noktadan sonra, Atb2-MRFP lifleri yeniden gruplandırın ve ortaya çıkan kız hücrelerinin her birinde interfaz formunu geri kazanmak için hücre yüzeyine yayılır. Sitokinez (> 120 ', Şekil 3A) sadece bir septum formlarından sonra oluşur ve hücreleri Fission ile böler. Mitotik bir döngüde Hht1-GFP yoğunluğundaki değişiklikler nükleer dinamiklerin üç önemli adımını ortaya çıkarır: metafaz-anaphaz (Orta yoğunluk, DNA sıkıştırma: 20 '-40 ', Şekil 3A-B), telofase (düşük yoğunluk, DNA ayrımı: 60 '-80 ', Şekil 3A-B) ve G1 (artan yoğunluk, DNA çoğaltılması: 100 '-120 ', Şekil 3A-b). Benzer şekilde, ama sadece Hht1-MRFP taşıyan ve Multi-kymograf aracı istihdam hücreleri kullanarak (bakınız adım 5,15) Fiji, bu telofaz metafaz mitotik bölünme gözlemlemek ve uygun kardeş kromatid sırasında dahil nükleer hareketler değerlendirmek mümkündür (normal, Şekil 3c). Mis-segregasyon kymographs iki ana nükleer yollar arasında sinyal etkinliğini göstermek, kromozom parçalanma veya uygunsuz kromatid ayrımı nedeniyle olası yanlış ayrım gösteren (gecikme, Şekil 3c).
Daha önce de belirtildiği gibi, tomurcuklanan ve fisyon Maya, Tos4, S faz22,23DNA çoğaltma sırasında G1 ve fonksiyonlar içinde transkripsiyon. Bu bir kymograf görülebilir nerede Tos4-Gfp ifade çekirdeğinde artar sonra Sad1-DSRed10 odakları zıt yönlere hareket (nükleer bölünme gösteren), ama önce sitokinez öncesinde septum formları, (39 ', şekil 3D ; 36 ', Şekil 3e). Yüksek Tos4-Gfp aktivitesinin aşaması M-G1/S geçişi (45 ', Şekil 3e) sonunda başlar ve G2 (> 60', Şekil 3e), hücre bölünmesi hemen sonra biter. G1 sırasında büyük ölçüde yayılırken, Tos4-Gfp sinyal yoğunluğu sonrası anafaz artar ve S-faz boyunca ve ayrılmış Sad1-DSRed odakları (45 '-60 ', Şekil 3e) ile ortak yerelleştirir. Bu sonuç, genom yinelemeyi kız hücrelerinde (G1/S) başladığında, ancak sitokinezi henüz oluşmamıştır, fisyon Maya septasyon dönemi ortaya çıkarır.
Hht1, fisyon Maya 'da histon H3 ve yaygın olarak nükleer DNA5,14görselleştirmek için floresan etiketleri ile değiştirilir. Mitozis 'de, metafaz 'dan telofaz (20 '-120 ', Şekil 3A) ' ya kadar hücre geçişi olarak, nükleer kütleye iki ayırt edici değişiklik görülür. İlk değişiklik metafaz nükleer büyüklüğü bir kasılma içerir (20 ', Şekil 3A), ikincisi anafaz sırasında çekirdek bölme gösterir iken (40 ', Şekil 3A). Bu değişiklikleri mitotik hücrelerle paylaşmanın yanı sıra, Mayoz bölünmenin hücreler nükleer salınımı (yani at taslama) (-100 ' to-50 ', Şekil 4A-B) Homolog rekombinasyon sırasında ve anafaz II (70 '-90 ') sonunda çekirdeğin boyutunun daha da azaltılması sergiliyor. Şekil 4A). Hht1-mRFP gibi gecikme veya parçalanmış kromozomlar (gecikme, Şekil 3c) gibi yanlış ayrım fenotipleri incelemek için kullanılır. Ayrıca, mayoz (Şekil 4A-B) aşamalarının her birinde nükleer dinamikleri gözlemlemek ve açıklamak için de kullanılır. Nükleer kütle büyük ve at-tailing çok sırasında boyutu dalgalanıyor (HT:-100 ' to-50 ', Şekil 4A-B)). Hücreler metafaz (MT:-40 ' e 0 ', Şekil 4A-B), nükleer boyut ve salınım azalmasına, bu aşamada artmış yoğuşma aktivitesiyle tutarlı olarak girer. Her iki anafaz başlangıç ı (mı: 10 '-60 ', Şekil 4A-b) ve II (MIS: 70 '-90 ', Şekil 4A-b) daha fazla nükleer azaltma ve nükleer hareket eksikliği ile ilişkilidir, hangi karakterize iki nükleer bölünmeler ile iyi ilişkilendirir mayoz ı ve II (mı & MIS). Böylece, mayoz, Homolog kromozom hizalanır ve yeniden birleştirildiğinde ve iki mermi kromozom ayrılması sonrasında nükleer boyut indirimleri ile nükleer boyut dalgalanmaları ile ilişkilidir. Bu nükleer dinamikleri değiştirecek olan alleles, mayoz12,13' te genom istikrar Yönetmeliği ile ilişkilidir.
Rec8, fisyon Maya 'daki meiyotik kohesin α-kleisin altbirim 'tir. DNA replikasyonu (Mei-S) sonrası kromatin üzerine yüklenir ve anafaz II 'ye kadar kardeş kromatitler birbirlerine bağlı tutar. Metafaz sonra, Rec8 ve ayraz tarafından kromozom kollarından kaldırılır Sgo1-PP2A tarafından sentromer korunur. Homolog ayrımcılığı sonunda, Rec8 de centromere de ortadan kaldırılmıştır, böylece kardeş kromatid ayrımı için izin (Şekil 5A)6,24. Rec8-GFP, Sad1-DsRed veya Hht1-mRFP gibi kromozom segregasyon belirteçleri ile birlikte Meiosis sırasında uyum dinamiklerinin görselleştirilmesine izin verir. Rec8-Gfp sinyali Mei-S (< <-90 ', Şekil 5A-b) sırasında Pan-nükleer, profaz ı (-90 ' to-50 ', Şekil 5A-b) ve metafaz ı (-40 '-0 ', Şekil 5A-b). Bu gözlem, DNA yinelemeyi izleyen kromozomlar eksenleri boyunca Rec8-GFP ilişkisini ortaya çıkarır. Hücreler bir anafaz ı (10 ', Şekil 5A-b) girdiğinizde, Rec8-Gfp yoğunluğu çekirdeğin tamamında azalır, ancak centromere 'de güçlü kalır, her nükleer kütlesinde bir odak oluşturur (20 '-70 ', Şekil 5A-b). Bu sonuç, kromozom kolları boyunca Rec8-GFP bozulması ile tutarlı ama centromere değil, Bu homolog ayrım sonra ensues. Anafaz II önce, Rec8 Focus kaybolur, MII (70 '-80', Şekil 5A-B) ayrılması için kardeş kroromatids serbest. Rec8-Gfp Marker, böylece, kurulması, kaldırılması ve Mayoz bölünmenin uyumu genel stabilitesi bozar koşulları incelemek için yararlıdır. Hht1-MRFP5,13, Rec8-Gfp gibi nükleer bölünme işaretiyle eşleştirilmiş, mayoz öncesinde ve süresince uygun kromozom segregasyon 12 ' ye karşı nasıl uyum zamanlaması ve istikrarı ele almak için istihdam edilebilir ,13. Bu protokol, dinamikleri öncelikle sitsol içinde meydana gelen proteinlere hitap etmez. Ancak, tablo ben sıklıkla endositoz, eklositoz ve diğer süreçler arasında sitokinez için gerekli sitoiskelet ve membran süreçlerini incelemek için kullanılan birkaç sitosolik protein gösterir.
Resim 1: canlı hücre görüntüleme için agaroz pedleri hazırlanması. (A) bir pipet ucu tutucu, laboratuvar bandı ve mikroskop slaytları kullanılarak monte edilen slayt hazırlama seti. Slaytlar birbirine dik yerleştirerek agaroz yastık formları bir cep oluşturur. Yandan laboratuvar teyp parçaları ilavesi agaroz Pad genişliğini gerekli spesifikasyonlara göre ayarlar. (B) Molten agaroz pedleri yapmak için mikroskop slaytlar üzerinde ayarlamadan önce soğumaya izin verilir. Bu adımda, hava kabarcıkları yaratmaktan kaçınmak için agaroz hacmini yavaşça dağıtmak gerekir. (C) üst slayt düz bir yüzey, hatta kenarlar ve görünmez agaroz çatlaklar ile dairesel bir Pad oluşturmak için dağıtılmaktadır agaroz noktaya yerleştirilir. (D) agaroz yastık üzerinde hücre süspansiyon örneği koyduktan sonra, ekstra sıvı orta kaldırmak için bir Lint-ücretsiz kağıt havlu üstüne slayt ve yer ters çevirin. (E) dikkatle agaroz yastık üzerine bir lamel magazini yerleştirin, herhangi bir hava kabarcıkları tuzak ve odak uçağı hücre kayması ve odaklama sorunları önlemek için düz olduğunu kontrol emin olun. (F) yavaş ve dikkatli bir şekilde, hücre kümeleri bozmak ve hücre genişleme ve daha iyi hücre görselleştirme için izin veren bir hücre tek tabakalı oluşturmak için saat yönünde lamel magazini döndürün. (G,H) Agaroz pedlerini mühürlemek ve görüntüleme işleminden önce istenilen sıcaklığa dengelenmelerini sağlamak için ısıtmalı hidrokarbon karışımı kullanın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: doğru hücreleri çekme. (A) üst paneller, EMM artı 72 h ve alt panel için takviyeleri açlıktan sol fisyon Maya hücreleri gösteren hücreleri Logaritmik büyüme geçiren gösterir. Açlıktan kalan hücrelerde, küçük hücre morfolojileri takdir edilebilir. Kırmızı Açık ok, açlık karakteristik olan vakuoler granül gösterir. Logaritmik kültürlerde, uzatılmış morfolojileri ve septa (kırmızı ok) gösteren hücreler, aktif Bisiklet dinamiklerini gösterir. Sağ taraftaki paneller, açlık ve proliferasyon sırasında Tos4-GFP ve Sad1-DsRed sinyallerini ifade eden hücreleri gösterir. Pan-nükleer Tos4-GFP ifade ve Sad1-DsRed sinyalleri karşı hücre direkleri lokalize aktif proliferasyon sırasında görülür, ama açlık değil. (B) üst panel aynı montaj ilişkisi tipi (h +) hücrelerini etkili bir şekilde montaj ilişkisi yapamamasını gösterir. Kırmızı Açık ok, karyogamy geçiren bir çift vakolar hücresi gösterir. Bu, hücrelerin% 10 ' unda Mate-Type ' a geçebileceğiniz h + hücrelerinin kültürlerinde olağandışı değildir. Alt panel etkili çiftleşme kaynaklanan ascı gösterir. Zygotic Asci, Zig-Zag (kırmızı ok) ve muz hücresi şekilleri (kırmızı açık ok) dahil olmak üzere birden fazla form alır. Ölçek çubuğu = 5 μm uzunluğunda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: mitotik nükleer dinamikler. (A) histon H3 (HHT1-Gfp) ve microtubül (Atb2-MRFP) proteinleri bir mitozis döngüsü sırasında takip edildi (120 dk). Hht1-GFP ve Atb2-mRFP için bireysel sinyaller siyah ve beyaz panellerde gösterilir, BF birleşmesi onları kendi renklerinde gösterir. (B) mitotik bir döngüde Hht1-mGFP yoğunluğunun ölçülmesini. Hht1 düzeylerinde değişiklik, G1 'de mitozis ve DNA çoğaltılması sırasında nükleer bölünmenin göstergesidir. (C) kymographs ortaya çıkan nükleer yolların ya Lamda ve DNA bütünlüğünü korur ya da sapmak ve kromozom parçalanma veya prematüre kromatid ayrımı teşvik mitozis normal veya anormal ayrım gösteren, sırasıyla. (D,E) Sad1-DsRed ayrımı ve nükleer Tos4-GFP sinyallerinin görünümü ile ortaya çıkan M-G1/S süresini gösteren kymograf ve mikrograf panelleri. Yüksek Tos4-GFP ifade ile lekeler tanımlaması kolaylaştıran bir yoğunluk-dereceli Termal harita oluşturmak için Fiji FIRE LUT kullanılarak oluşturulan E orta paneller Not; Bu durumda, çekirdek ve çakışan Sad1-DsRed sinyalleri, beklendiği gibi lokalize. Ölçek çubuğu = 5 μm uzunluğunda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Meiyotik nükleer dinamikler. (A) Meiosis sırasında çekirdeğin (Hht1-MRFP) hareketini, sıkıştırımını ve bölünmeyi gösteren panel serisi. Horse-tailing (HT) yaygın yan-yan nükleer osilasyonlar tarafından izlenen metafaz (MT), nerede nükleer lateral hareketin azalır ve tamamen anafaz önce hemen durur gösterir ı. Mayoz ı (mı), ana nükleer kitle ikiye bölünmüştür, mayoz II iken (MII) dört çekirdekler kardeş kroromatid ayrımı sürecinde oluşturulur. (B) profaz, METAFAZ, mı & MII 'de nükleer alan değişimini (Hht1-MRFP) ölçmek. Atom alanı HT salınımları sırasında dinamiktir, MT 'de yoğunlaşır ve az nükleer hareketin gözlemlendiği mı & MII sırasında boyutu daha da azalır (uzun nükleer eksen). En uzun nükleer eksen ölçümü (uzun nükleer eksen) bir daire uzanıyor gibi fikir dayanmaktadır, bu sabit bir çap var durur ve en az iki ana eksen üretir: uzun ve kısa. Böylece, çekirdeğdeki değişiklikleri izlerken, uzun veya kısa eksendeki değişiklikler nükleer hareketin göstergelerini sağlar. Ölçek çubuğu = 5 μm uzunluğunda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: meiotic kohesin dinamikleri. (A) REC8-Gfp sinyal değişiklerinin meiyotik nükleer dinamiklerle nasıl ilişkilidir olduğunu gösteren panel serisi. HT ve MT sırasında Rec8-GFP sinyali Pan-nükleer ve nükleer hareketi takip eder (Hht1-mFRP). Mı, Rec8-GFP çekirdeğden dağıtıyor, sadece bir çift odak bırakarak, hangi kromozom kolları Rec8 kaldırılması ile tutarlı ve centromere Sgo1-PP2A koruma kurulması. Hücre MII yaklaşımlar gibi, Rec8-Gfp odakları ortadan kaybolur ve artık anafaz II önce görülmeden başlar. (B) REC8-Gfp yoğunluğunun HT 'den MII 'ye ölçülmesini. Ne görülme benzer bir, Gfp sinyal HT ve MT ile yüksek, mı sırasında önemli ölçüde azalır ve tamamen MII kaybolur. Bu model, kromozom kollarına ve centromere 'de cohesin dinamiklerini doğruluyor, burada kardeş kromatitler, MII 'de ayrılmaya hazır olana kadar gergin tutar. Ölçek çubuğu = 5 μm uzunluğunda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Protein | Işlev | Yorum | Etiket | Başvuru | ||
| Hht1 | Histone H3 DNA ambalajında yer aldı | Kromozom dinamiklerini incelemek için kullanılır | Hht1-mRFP | 5, 14 | ||
| Tos4 | G1 aşamasında Tos4 işlevi oluşuyor | G1 zamanlaması çalışmak için istihdam | Tos4-GFP | 22, 23 | ||
| Rad21/Rec8 | Cohesin alt paketleri çoğaltma aşağıdaki kardeş kromatitler tutmak dahil | Mitotik (Rad21) ve meiyotik ayrım sırasında uyum kararlılığını analiz etmek için kullanılır (Rec8) | Rad21-GFP/Rec8-GFP | 6, 24 | ||
| Rad11 | RPA aktivitesi mitotik DNA onarımı, Mayoz bölünmenin rekombinasyon sırasında oluşur ve metafaz biter | Mayoz 'te mitozis ve rekombinasyon dinamikinde DNA onarımı çalışması için istihdam | Rad11-YFP | 5, 13 | ||
| Rad52 | Rad52 Asime mitotik DNA onarımı ve Mayoz bölünmenin rekombinasyon sırasında gerçekleşir | Mayoz 'te mitozis ve rekombinasyon dinamikinde DNA onarımı çalışması için istihdam | Rad52-CFP | 5, 13 | ||
| Cnp1 | Histone H3 cenp-A sentromer özellikle yerelleştirir | Mitozis ve mayoz 'te kromozom segregasyon dinamiklerini takip etmek için kullanılır | Cnp1-mCherry | 13 | ||
| Swi6 | HP1 homologu protein heterokromatin oluşumu dahil | Sentromer ve telomerlerin içinde heterokromatin seferberlik çalışması için istihdam | Swi6-GFP | 13 | ||
| Sad1 | Sad1 nükleer zarf mil kutup gövdesi yerelleştirme yer almaktadır | Mitoz ve mayoz içinde kromozom ayrımı analiz etmek için kullanılır | Sad1-mCherry | 10 | ||
| SITSOL & membran | ||||||
| Atb2 | Tubulin Alpha 2 Mikrotubul sitastre kuruluşunda yer aldı | Mitoz ve mayoz 'te kromozom ayrımı incelemek için kullanılır | Atb2-mRFP | 7, 14 | ||
| Ync13 | Vezikül aracılı ulaşım ile ilgili exocytosis ve endositoz regülatörü | Sitokinez sırasında hücre duvarı bütünlüğünü incelemek için kullanılır | Ync13-mECitrine | 25 | ||
| Rlc1 | Myosin II altbirim sözleşme halka kasılma dahil | Septum olgunlaşma ve kasılma dinamiklerini keşfetmek için kullanılır | RIc1-mCherry | 25 | ||
| Ccr1 | ER, plazma ve mitochrondrial dış membranın bir parçası olan NADPH-sitokrom P450 redüktaz | Endositoz, exocytosis ve sitokinez gibi membran ilişkili dinamikleri incelemek için kullanılır | Ccr1N-GFP | 5 | ||
| Gef1 | Rho guanyl-Hücre polaritesi kurulması ve bakımı içinde yer alan nükrene değişimi faktörü | Global, Microtubule bağımlı hücre polarite dinamiklerini incelemek için kullanılır | Gef1-mCherry-GBP | 26 | ||
| Fus1 | Sitgamy sırasında actın Fusion Focus montajında yer alan formin | Füzyon dinamiği, fisyon Maya çiftleşme ile ilgili çalışma için kullanılır | Fus1-sfGFP | 27 | ||
| Mnn9 | Golgi cihazında protein N bağlantılı glikozilasyon dahil mannolsyltransferase altbirim | BDT-Golgi ' den Trans-Golgi ' e ilerledikçe Golgi 'de kargo olgunlaşma çalışması için istihdam | Mnn9-mCherry | 28 | ||
| Num1 | At-tailing dahil Dynein için kortikal çapa faktörü | Mayoz bölünmenin profaz ı içinde nükleer salınım sırasında mitokondri bağımlı Dynein çapa incelemek için kullanılır | Num1-yEGFP | 29 | ||
Tablo 1: nükleer ve sitosolik dinamiklerin belirteçleri.
Film 1: M-G1/S geçiş mili kutup gövdesi gösteren (SPB; Sad1-DsRed) ayırma önceki septasyon ve Tos4-GFP nükleer sinyal birikimi. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Film 2: mikrotübül (Atb2-mRFP) uzantısı nükleer (Hht1-GFP) bölünme ile korelasyon gösteren mitotik döngüsünün tamamlanması. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Discussion
Mitoz ve mayoz sırasında canlı hücre görüntüleme, veri edinme sırasında nükleer dinamikleri büyük ölçüde parçalama işlemi yapmadan incelemek için fırsat sunar. Ancak, hücrelerin çevresel gerilimlerin istenilen yoğunluklarına yetişmesini sağlamak için dikkat edilmelidir; ve Meiosis için, hücrelerin Terminal farklılaşma sırasında görüntülenmiş ve çok erken veya geç değil. Aşırı hücresel kalabalık, açlık ve uygunsuz büyüme sıcaklıkları, yeniden üretilemeyen gözlemlere katkıda bulunan ortak faktörlerdir. Buna ek olarak, gerinim yapımı sırasında, floresan etiketleri hedef genler fonksiyonları veya etkisi genel hücre Fitness müdahale yok test etmek için çok önemlidir. Floresan işaretçileri taşıyan suşların phenoypes yakından incelemek için başarısızlık benzer genotypes arasında tutarsız ve eşsiz sonuçlara neden olabilir.
Mikroskop agaroz pedleri montajı basit olmasına rağmen, onlar da değerli görüntüleme verileri elde etmek bir engel oluşturabilir. Agaroz pedleri oluşturmak, birbirine paralel üç mikroskop kaydırağı yerleştirmek, orta slaytta erimiş agaroz dağıtmak ve diğer slaytların üst kısmına transayet eden bir slayt koyarak kadar basittir. Ancak, dayanıklı, duruma özgü agaroz pedleri üretmek için Genişlik modifikasyonları sağlayan bir Slayt Maker aparatı birleştirmek için yararlıdır. Ped genişliği esnekliği sağlayan basit bir slayt yapımcısı bir platformdan (pipet uçları tutucu veya tezgah), iki mikroskop kaydırağı ve pad-Width ayar mekanizması (Şekil 1a) olarak hareket eden laboratuar bandı içerir. Tam ped kalınlığı görüntüleme süresi gereksinimleri, agaroz marka, sıcaklık, lamel magazini sızdırmazlık maddesi, buharlaşma oranı, vb bağlıdır. Böylece, teknik yeniden üretilebilirliği artırmak ve canlı hücre görüntüleme1,2,3kalitesini artırmak için veri edinme önce görüntüleme sistemi kalibre etmek önemlidir. Uzun süreli görüntü edinme sırasında Pad yüzeyi, rijitlik ve kompozisyon esastır. Agarose düşük arka plan floresan vardır, kolayca kalıplanabilir, ve uygun konsantrasyon, buharlaşma nedeniyle yapısal deformasyona karşı. Dahası, agaroz ile fisyon Maya medyasını birleştirerek görüntü kalitesini tehlikeye atmaz ve birden fazla mitoz ve mayoz döngüsünün genişletilmiş gözlem sağlar. Ayrıca, zaman atlamalı microkopi için herhangi bir hava kabarcıkları önlemek önemlidir. Agaroz pedleri içinde ve numunenin içinde, hava cepleri zaman içinde genişleyerek hücre değiştirme ve odak düzlemlerini bozmaya neden olur. Sağlanan hücreler verimli lamel magazini rotasyon tarafından yaymak, araştırmacılar birkaç nesilden mitotik süreçler ve sporulation nükleer füzyon Mayoz bölünmenin olaylar takip edebilirsiniz. Görüntüleme deneyleri için doğru Pad yapma ve seçme ana zaman alır, ancak bir kez elde, son derece bilgilendirici mikroskop gözlemlere katkıda bulunabilir.
Diğer yöntemlerle olduğu gibi, canlı hücre mikroskobu da teknik sınırlamalar içermeyen bir durumdur. Floresan etiketli proteinler kullanımı incelenebilir ne kapsamını sınırlamak deneyler sınırları tanıtır. Fotoğraf ağartma ve fotoğraf-toksisite uzun süreli görüntü edinme tipik sorunlarla. Onlar çok uzun veya çok sık kısa dalga boyları için hücreleri açığa değil tarafından karşı olabilir. GFP, CFP, YFP, MRFP ve DSRed içeren deneyler için, tipik floresan proteinleri fisyon Maya canlı hücre görüntülemede kullanılan, rutin deneyler için 5-15% uyarma ışık ve 100-500 MS pozlama süresi istihdam yaygındır. Ancak bu parametreler, araştırmacının belirli deneme gereksinimlerine göre değişir. Buna ek olarak, 60x hedef kullanarak 0,5 μm aralıkla 9-13 bölümden oluşan z-yığınları, bir fisyon Maya hücresinin kalınlığını çözmek için yeterlidir. Ayrıca, floresan işaretçileri doğru düzenleme veya hedef proteinlerin işlevini bozmaz veya sahte fenotürleri oluşturmak onaylamak önemlidir. Böylece, farklı araçlarla gözlemler için aynı hedef geni farklı floresan ve benzeşme etiketleri içeren suşları oluşturmak için tavsiye edilir. Ayrıca, deneysel parametrelerin deneyler arasında çoğaltılabileceğini ve toplanan verilerin Akış Analizi1,3için uygun olduğunu sağlamak araştırmacıların sorumluluğundadır. Hiçbir teknoloji, floresan sinyallerini tespit etmek için dikkatli gözlem ve doğrusallık titiz muayene ile titizlikle doğrulama deneysel sistemlerin zaman test uygulama değiştirebilirsiniz.
Son olarak, RAW görüntüleri değiştirmez biçimlerde mikroskobik veri analiz etmek çok önemlidir. Fiji ham veri ölçümleri izlemek için mükemmel dokümantasyon araçları sağlar ve araştırmacılar tek bir oturumda farklı hücre parametrelerini incelemek için izin verir. Bu özelliklerin yanı sıra, online öğreticiler ve kapsamlı literatür kapsamı zenginliği, Fiji 'nin mitozis ve Meiosis 'teki fisyon Maya 'nın nükleer dinamiklerini tarif eden canlı hücre görüntüleme verilerini ölçmek, analiz etmek ve sunmak için önemli bir araç haline getirmek.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar bu yazının hazırlanması için daha keyifli bir çaba yapmak için Natalia La Fourcade ve Mon LaFerte teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmanın tamamlanması için onların anlayış, deney fikirleri ve ahlaki destek katkıda Forsburg Lab üyeleri sayesinde. Bu proje NIGMS R35 GM118109 tarafından SLF tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
- Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).
- Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
- Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
- Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
- Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
- Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
- Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
- Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
- Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
- Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
- Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
- Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).
- Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
- Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
- Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).
- Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
- Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
- Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).
