Summary
Ici, nous présentons l'imagerie à cellules vivantes qui est une méthode de microscopie non toxique qui permet aux chercheurs d'étudier le comportement des protéines et la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes de levure de fission pendant la mitose et la méiose.
Abstract
L'imagerie cellulaire vivante est une technique de microscopie utilisée pour examiner la dynamique cellulaire et protéique dans les cellules vivantes. Cette méthode d'imagerie n'est pas toxique, n'interfère généralement pas avec la physiologie cellulaire et nécessite une manipulation expérimentale minimale. Les faibles niveaux d'interférence technique permettent aux chercheurs d'étudier les cellules à travers de multiples cycles de mitose et d'observer la méiose du début à la fin. À l'aide d'étiquettes fluorescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP) et la protéine fluorescente rouge (DP), les chercheurs peuvent analyser différents facteurs dont les fonctions sont importantes pour des processus comme la transcription, la réplication de l'ADN, la cohésion et la ségrégation. Couplé e à l'analyse des données à l'aide de Fidji (version gratuite et optimisée de l'ImageJ), l'imagerie cellulaire vivante offre diverses façons d'évaluer le mouvement des protéines, la localisation, la stabilité et le calendrier, ainsi que la dynamique nucléaire et la ségrégation chromosomique. Cependant, comme c'est le cas avec d'autres méthodes de microscopie, l'imagerie cellulaire vivante est limitée par les propriétés intrinsèques de la lumière, qui mettent une limite à la puissance de résolution à des grossissements élevés, et est également sensible à la photoblanchiment ou la phototoxicité à haute longueur d'onde Fréquences. Cependant, avec un certain soin, les investigateurs peuvent contourner ces limitations physiques en choisissant soigneusement les bonnes conditions, les contraintes, et les marqueurs fluorescents pour permettre la visualisation appropriée des événements mitotiques et méiotiques.
Introduction
La microscopie à cellules vivantes permet aux chercheurs d'examiner la dynamique nucléaire sans tuer les cellules de levure de fission et élimine le besoin de fixatifs et de taches létales. Il est possible d'observer la stabilité, le mouvement, la localisation et le moment des protéines étiquetées fluorescentes qui sont impliquées dans des événements importants tels que la réplication, la recombinaison et la ségrégation chromosomiques, en plus de la membrane et du cytosquelettique Mouvements. En maintenant la viabilité cellulaire et la détection du signal non toxique, il y a une intrusion physiologique minimale. Lorsqu'elle est effectuée correctement, cette méthode de microscopie peut réduire les effets de confusion qui découlent de la manipulation technique prolongée ou de la réactivité chimique fausse. En outre, au cours d'une expérience, les chercheurs peuvent faire des observations pertinentes des états nutritionnels et de stress de levure de fission, de l'efficacité proliférante, et du statut apoptotique qui indiquent des paramètres d'imagerie inappropriés ou la physiologie anormale de cellules1 ,2,3.
La mitose et la méiose sont caractérisées par la division nucléaire et cellulaire. Dans la méiose, contrairement à la mitose, le contenu génétique est réduit de moitié à mesure que les cellules parentes donnent naissance à des cellules filles4. Parce que l'imagerie cellulaire vivante fournit une dimension temporelle en plus de la relation spatiale, un grand nombre de cellules peuvent être examinées en temps réel. La microscopie à cellules vivantes a permis aux chercheurs d'examiner la dynamique de la division nucléaire à l'aide d'étiquettes fluorescentes pour les histones5, sous-unités de cohésine6, microtubules7, centrores8, kinétochores9, composants de le corps de poteaux de fuseau (SPB)10, et ceux du complexe de passager de chromosome (CPC)11. En dehors de l'appareil de ségrégation chromosomique, l'imagerie cellulaire vivante a également capturé le comportement des protéines nécessaires, mais pas directement impliqués dans la ségrégation chromosomique. La fonction de ces protéines a été montrée pour influencer la réplication, la recombinaison de chromosome, le mouvement nucléaire, et l'attachement de chromosome aux microtubules12,13,14. Ces observations ont contribué à une meilleure compréhension des événements cellulaires dont les composants fonctionnels n'étaient pas propices à l'examen biochimique ou génétique. Avec de nouveaux progrès dans la technologie de microscopie, les limitations telles que la mauvaise résolution, le photoblanchiment, la phototoxicité, et la stabilité de foyer diminueront, facilitant ainsi de meilleures observations en temps réel de la dynamique nucléaire mitotique et méiotique1, 2,3. La méiose est particulièrement difficile car il s'agit d'une voie de différenciation terminale qui nécessite une attention particulière à la synchronisation.
Le but de ce protocole est de présenter une méthode relativement simple pour examiner la dynamique nucléaire en temps réel de levure de fission dans la mitose et la méiose. Pour ce faire, il est nécessaire d'utiliser des cellules qui n'ont pas été exposées au stress environnemental, de préparer des coussinets d'agarose qui peuvent résister à une imagerie prolongée et de monter des cellules à des densités qui facilitent la visualisation de la dynamique unicellulaire. En outre, ce protocole utilise des cellules transportant des protéines étiquetées fluorescentes qui servent de marqueurs utiles pour la cinétique nucléaire (Hht1-mRFP ou Hht1-GFP), la ségrégation chromosomique (Sad1-DsRed), la dynamique du cytosquelette (Atb2-mRFP), transcriptionnel l'activation dans G1/S (Tos4-GFP), et la stabilité de cohésion dans la méiose (Rec8-GFP). Cette méthode introduit également d'autres marqueursnucléaires et cytosliques (tableau I) qui peuvent être utilisés dans différentes combinaisons pour répondre à des questions sur des processus cellulaires spécifiques. En outre, des outils fidjiens de base sont mis en vedette pour aider les chercheurs à traiter les images en cellule vivante et à analyser différents types de données. La force de cette approche provient de l'utilisation d'observations en temps réel de la dynamique des protéines, le calendrier et la stabilité pour décrire les processus qui font partie intégrante de l'exécution appropriée de la mitose et la méiose.
Protocol
1. Préparation des médias15,16
- Solutions boursières
- Préparer une solution de bouillon de sel 50x en ajoutant 52,5 g de MgCl2'6H20, 0.735 g de CaCl2'2H20, 50 g de KCl, et 2 g de Na2S04 dans une bouteille contenant 1 L d'eau distillée. Mélanger la solution à fond et stériliser par filtration. Placer à 4 oC pour un stockage à long terme.
- Faire une solution de 1000x stock de vitamines en mélangeant 1 g d'acide pantothénique, 10 g d'acide nicotinique, 10 g d'inositol, et 10 mg de biotine dans une bouteille contenant 1 L d'eau distillée. Bien mélanger la solution et stériliser par filtration. Conserver à 4 oC pour un stockage à long terme.
- Préparer une solution de stock minéral 10 000x en ajoutant 5 g d'acide borique, 4 g de MnSO4, 4 g de ZnSO4x 7H2O, 2 g de FeCl2x 6H2O, 1 g de KI, 0,4 g d'acide molybdique, 0,4 g de CuSO4x 5H20 , et 10 g d'acide citrique dans une bouteille contenant 1 L d'eau distillée. Mélanger la solution à fond et stériliser par filtration. Placer à 4 oC pour un stockage à long terme.
- Faire des solutions individuelles de stock de nutriments en ajoutant 7,5 g d'adénine, de leucine, d'histidine ou de lysine dans une bouteille contenant 1 L d'eau distillée. Utilisez seulement 3,75 g pour faire la solution uracil. Stériliser les solutions en autoclant.
REMARQUE: Au fil du temps, l'uracil se précipite hors de la solution. Pour apporter dans la solution à nouveau, réchauffer au micro-ondes à 60% de puissance par incréments de 10 s ou placer dans un bain d'eau de 55 oC pendant 20 min. Faites tourbillonner la solution chaude jusqu'à ce que toutes les amas d'uracil disparaissent.
- Extrait de levure plus suppléments (OUI)
- Dans un flacon de 2 L, ajouter 1 L d'eau distillée, 5 g de base d'extrait de levure, 30 g de glucose et 225 mg chacun d'adénine, d'uracil, de L-histidine, de L-leucine et de L-lysine. Ajouter 20 g d'agar pour faire le milieu solide.
- Utilisez une barre magnétique pour dissoudre complètement les ingrédients dans la solution. L'agar fondra après que le milieu soit stérilisé par autoclaclacage.
REMARQUE: Pour plus de commodité, la poudre OUI prête à l'emploi est également disponible dans le commerce.
- Milieu minimal d'Edimbourg (EMM) et milieu de glutamate de pompon (PMG)
- Dans un flacon de 2 L, mélanger 1 L d'eau distillée avec 3 g de phtalate d'hydrogène de potassium, 2,2 g de Na2HPO4, 5 g de NH4Cl, 20 g de glucose, 20 ml de solution de bouillon de sel, 1 ml de solution de bouillon de vitamine , et 0,1 ml de solution de stock minéral. Remplacer NH4Cl par 2,2 g de sel monosodique d'acide L-glutamique pour préparer le PMG. Pour faire le milieu solide, ajouter 20 g d'agar.
- À l'aide d'une barre magnétique, dissoudre soigneusement les ingrédients. L'agar fondra après que le milieu soit stérilisé par autoclaclacage. Avant d'utiliser, ajoutez des solutions de stock de nutriments au besoin. Pour chaque 1 L de milieu, ajouter 15 ml chacun d'adénine, de leucine, d'histidine et de lysine. Utilisez 30 ml pour l'uracil, car il est moins concentré que les autres solutions nutritives.
REMARQUE: Pour plus de commodité, des poudres EMM et PMG prêtes à l'emploi sont également disponibles sur le marché.
- Extrait de malt (ME)
- Utilisez un flacon de 2 L pour mélanger 1 L d'eau distillée avec 30 g d'extrait de malt et 225 mg chacun d'adénine, d'uracil, d'histidine et de leucine. Ajuster le pH à 5,5. Inclure 20 g d'agar pour faire le milieu solide.
- Dissoudre les composants dans la solution à l'aide d'une barre magnétique. L'agar fondra après que le milieu soit stérilisé par autoclaclacage.
- Sporulation agar avec suppléments (SPAS)
- Dans un flacon de 2 L, ajouter 1 L d'eau distillée, 10 g de glucose, 1 g de KH2PO4, 1 ml de bouillon de vitamines, 45 mg chacun d'adénine, uracil, histidine, leucine et hydrochlorure de lysine. Ajouter 20 g d'agar pour faire le milieu solide.
- Utilisez une barre magnétique pour bien mélanger les ingrédients. L'agar fondra après que le milieu soit stérilisé par autoclaclacage.
2. Fission Levure Culture15,16
- Utilisez OUI milieu solide pour réveiller les souches de levure de fission de la préservation cryogénique. Selon les besoins en température de chaque souche, incuber à 25 oC ou 32 oC pendant 3 à 5 jours.
- Lorsque les colonies sont visibles, préparez une culture liquide de démarrage. Choisissez les cellules de différentes colonies et inoculez-les dans des tubes à essai contenant 3 mL OUI milieu liquide. Poussez à la température appropriée jusqu'à la phase médiane ou tardive.
REMARQUE: Pour une bonne aération, utilisez des tubes ou des flacons dont les volumes sont au moins 5 fois supérieurs au volume de culture liquide prévu. Les vitesses de secousse entre 150-220 tr/min sont habituelles pour la croissance de la culture de routine. - Distribuez 250-500 l de culture de démarrage dans un flacon de 50 ml contenant 9,5-9,75 ml de OUI, EMM ou PMG plus des suppléments appropriés. Permettre aux cellules de se développer à la densité désirée et vérifier sous le microscope pour la morphologie cellulaire appropriée et l'état nutritionnel.
REMARQUE: Pour stocker les souches éveillées jusqu'à un mois, sceller les plaques OUI avec du ruban de paraffine et les placer à 4 oC.
3. Préparation de l'échantillon2
- Configuration de la diapositive microscope
- Ajouter 2 g d'agarose dans un bécher de 500 ml contenant 100 ml de suppléments moyens minimaux plus (mitose) ou liquides (méiose). Chauffer la solution d'agarose dans un four à micro-ondes à 60 % de puissance par incréments de 10 s ou placer dans un bain d'eau de 55 oC pendant 10 min. Faites tourbillonner la solution pour assurer une fonte efficace. Préparer la configuration de la fabrication de diapositives agarose (Figure 1A) pour assurer une préparation rapide des coussinets et empêcher l'agarose fondue de se solidifier prématurément.
- Laisser refroidir l'agarose fondue pendant 1 min à température ambiante et distribuer de 50 à 100 points de l sur des lames de microscope à l'aide de pointes de pipette à large souper. Avant que l'agarose ne refroidisse, placez une lame de microscope sur le dessus pour générer un tampon de propagation d'environ 1,5 à 2 cm de diamètre (figure1B-C). La largeur du tampon d'agarose est généralement proportionnelle à la durée de l'imagerie. En d'autres termes, les coussinets plus épais résistent à des périodes d'imagerie plus longues.
- Utilisez un mélange d'hydrocarbures comme scellant pour assurer une bonne couverture des lames avec d'épais coussinets d'agarose et pour éviter la mort cellulaire de l'exposition aux solvants sur les bords de couverture. Mélanger les parties égales (w/w) de gelée de pétrole, de lanolin et de paraffine dans un bécher de 500 ml. Chauffer les ingrédients sur une plaque chaude à 120 oC pendant 5 min. Au fur et à mesure que les composants fondent, faites tourbillonner soigneusement la solution fondue pour assurer un mélange approprié.
- Configuration de l'échantillon
- Pour l'examen des événements mitotiques, cultivez des cellules des cultures de démarreur dans l'EMM liquide ou pmG plus les suppléments à approximativement mi-log phase (OD595 de 0.4). Centrifuge1 ml de la suspension cellulaire à 1 375 x g pendant 1 min, retirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans le milieu minimal plus les suppléments à un volume final de 100 l.
- Pour l'image des événements méiotiques, cultiver des cellules à partir de cultures de démarrage dans le milieu minimal plus suppléments à la phase de retard du journal (OD595 de 0,7-1.0). Combiner des volumes égaux de cellules de type mate opposées (h- et h') dans une suspension cellulaire de 1 ml. Centrifugeuses cellules à 1 375 x g pendant 1 min et resuspendre la pastille dans le ME liquide. Répétez cette étape trois fois pour assurer l'élimination efficace des nutriments.
- Après le dernier lavage ME, resuspendre les cellules dans 1 ml de ME et l'ajouter à un flacon de 50 ml contenant 9 ml ME. Incuber de 12 à 16 h à 22-25 oC sur une vitesse de rotation minimale (50-100 tr/min). Flocculation cellulaire abondante, qui se traduit par de nombreux amas de levure de fission ronde et indique l'accouplement efficace.
- Prendre un échantillon de 1 ml de la culture d'accouplement et de la centrifugeuse à 1 375 x g pendant 1 min. Éliminer le supernatant, mais laisser 250 l dans le tube pour resuspendre les cellules. Avant de placer les cellules sur des coussinets d'agarose, vortex vigoureusement pendant 5 s pour perturber les amas.
REMARQUE: Les 250 lME restants utilisés pour resuspendre les cellules contiennent des facteurs d'accouplement qui aident les cellules à entrer dans la méiose. - Placer 20 l d'une suspension mitotique ou méiotique sur un tampon d'agarose de 2 %. Enlever tout excès de milieu en inversant la glissière et en la plaçant sur le dessus d'une serviette en papier sans papier pour 2-3 s (Figure 1D). Placez le pavé de diapositivevers vers le haut et placez délicatement un bordereau en verre, en veillant à ne pas générer de bulles d'air (Figure 1F).
REMARQUE: L'élimination de l'excès de milieu avec un essuie-tout est plus efficace dans le temps que l'absorption de gravité, ce qui est particulièrement critique dans les expériences de méiose. - Pour créer une monocouche cellulaire, faites pivoter le slip dans le sens des aiguilles d'une montre avec l'index pour un (mitose) ou deux (méiose) tours complets (Figure 1F). Assurez-vous que la matière cellulaire se disperse à travers le tampon d'agarose permettant une meilleure séparation des cellules simples ou des asci. À l'aide d'un petit bâton en bois, distribuez de l'étanchéité fondue le long des bords de la glissière pour sceller chaque tampon d'agarose (Figure 1G).
- Une fois que le tampon d'agarose est scellé, placez-le sur la scène du microscope et laissez-le récalcitre-t-il pendant 10-15 minutes aux conditions d'imagerie appropriées (p. ex., température) (figure 1H) pour permettre aux bulles d'air de se dissiper et laisser se produire tout changement d'agarose de dernière minute. Commencez l'imagerie une fois que la diapositive est efficacement réquidiée et ne la retirez pas de la scène jusqu'à ce que la collecte de données se termine.
REMARQUE: Le contrôle de la température et de l'humidité est déterminé par le système de microscope utilisé et les exigences expérimentales spécifiques. Si vous êtes présent, appliquez le contrôle de la température et de l'humidité à toutes les expériences d'imagerie. En cas d'absence, les chercheurs doivent trouver un moyen de prévenir les fluctuations de température, en particulier lors des expériences de méiose.
4. Imagerie à cellules vivantes2 et traitement
- Utilisez l'objectif 40x pour trouver des champs de vision appropriés à l'image. Passez à l'objectif 60x pour commencer l'acquisition de données. Selon le système de microscope utilisé, le recentrage et la sectionnement ultérieurs sur l'échantillon à chaque moment se produiront manuellement ou par un processus automatisé au microscope ou au logiciel.
REMARQUE: Les images présentées dans ce protocole ont été recueillies à l'aide d'un microscope de déconvolution, d'un microscope à fluorescence équipé d'ensembles de filtres Sedat, RFP et GFP, de stade nano-mouvement, d'objectif 60x NA 1.4 et d'une caméra CCD 12 bits. Les volets mécaniques intégrés et les roues de filtre motorisées ont permis de réduire l'excitation et le photoblanchiment des échantillons. - Utilisez un logiciel approprié pour acquérir et traiter des images. Pour décongestionner les images, utilisez des fonctions de transfert optique fournies par le fabricant.
REMARQUE: Pour plus de détails sur l'équipement de microscope et le logiciel utilisé dans ce protocole, se référer à la Table des matériaux. - Pour utiliser un microscope à fluorescence classique pour acquérir des images en cellule vivante, assurez-vous que le microscope recueille des données numériquement, a des objectifs 40x ou 60x avec des ouvertures numériques (NA) supérieures à 1,2, et est capable d'effectuer des sections optiques.
REMARQUE: Sans ces exigences, les images afficheront une résolution réduite, compromettant la qualité des mesures microscopiques et des observations qualitatives. - Utiliser des programmes de plug-in gratuits (p. ex., Fidji) pour minimiser les erreurs de flou systématiquerésultant de la perte de contraste lors de l'acquisition d'images17,18,19,20 et pour assurer une analyse quantitative appropriée de l'intensité de la fluorescence et d'autres événements temporels et dynamiques au sein de la cellule.
REMARQUE: D'autres programmes de déconvolution commerciale disponibles se trouvent dans le Tableau des matériaux. - Choisissez les ensembles de filtres microscope qui correspondent le mieux aux fluorophores sous observation. Assurez-vous que les filtres d'excitation et d'émission ont les bons laissez-passer de bande qui permettent la détection spécifique des protéines fluorescentes. Par exemple, pour détecter le signal de pCAF, une passe de bande d'excitation et d'émission de 430/25 et 470/30 est appropriée, mais pas pour la fluorescence de La DP.
- Utilisez une approche à réglages peu efficaces (MESA) lorsque l'imagerie de la levure de fission à plusieurs moments. En d'autres termes, évitez l'utilisation prolongée des longueurs d'onde d'excitation et employez la puissance d'excitation et le temps d'exposition les plus bas qui génèrent des données d'imagerie acceptables, mais quantifiables et reproductibles.
- Pour une imagerie prolongée pendant la mitose ou la méiose, limitez l'intervalle entre les points de temps d'acquisition à 5-10 min. Bien que les coussinets d'agarose de 2 % puissent résister à des séances d'imagerie de 12 à 16 h, le déplacement des cellules en raison de l'évaporation de l'agarose est probable. Par conséquent, effectuer des expériences de mitose ou de méiose complètes dans des fenêtres de 4-6 h ou 8-10 h, respectivement.
- Recueillir des données d'imagerie pour 4-8 h comprenant au moins 24-48 points de temps d'acquisition, respectivement, une protéine de fluorescence, et un z-pile par point de temps et canal fluorescent composé de 13 sections avec 0,5 m d'espacement à l'aide d'un objectif 60x. Cela nécessite au moins 0,5-1 Go d'espace de stockage disque dur. Ainsi, en plus d'éliminer le photoblanchiment et le transfert de cellules, créer un flux de travail qui considère les capacités de calcul1,2,3.
REMARQUE: Ces paramètres d'acquisition sont généralement fixés et modifiés dans le logiciel qui contrôle les fonctions du microscope et qui recueille et traite les images. - Pour examiner plus en détail certains processus nucléaires, effectuez l'acquisition d'images tous les 5-10 s, tant que l'émission ne diminue pas considérablement après une exposition fréquente. Effectuer une analyse préliminaire de l'intensité de la fluorescence sur différentes périodes de temps afin de déterminer le point après lequel l'exactitude des données recueillies n'est plus fiable1,3.
- Dans le logiciel d'acquisition d'images et de traitement d'images, utilisez la projection d'intensité maximale sur les piles z d'image pour observer toutes les structures à forte densité de fluorescence sur un plan 2D, quel que soit leur emplacement vertical1,2, 3. Cela facilite un examen rapide des processus nucléaires se produisant dans différents voxels. Recueillir une image de champ lumineux mi-focale pour générer une image de référence des cellules sous observation.
5. ImageAnalysis20,21
REMARQUE: L'analyse d'image dans ce protocole est effectuée à l'aide de Fidji. Pour d'autres programmes d'analyse et les plug-ins Fidji voir Tableau des matériaux.
- Téléchargez une image déconvolved en sélectionnant la fonction Bio-Formats Importer dans le menu Plugins. Dans la fenêtre pop-up Options d'importation, sélectionnez Hyperstack, mode couleur par défaut, et vérifiez autoscale avant d'appuyer sur le bouton OK.
- Assurez-vous que la fenêtre affichée a le nombre correct de canaux de fluorescence et les délais en faisant défiler latéralement sur les barres respectives en bas. Enregistrer comme un fichier Tiff, qui ne compresse pas les données et empêche la perte d'informations.
- Ouvrez une image qui contient une barre d'échelle générée lors du traitement des données par le logiciel microscope. Déterminez la longueur pixel de la barre d'échelle à l'aide de l'outil Straight Line pour tracer une ligne parallèle de taille similaire et sélectionnez Mesure dans le menu Analyze. Ajoutez une barre d'échelle en définissant le ratio pixel-m d'image en sélectionnant l'échelle de set dans le menu Analyse.
- Dans la fenêtre pop-up Set Scale, entrez la distance calculée en pixels et la distance connue en m, définir le rapport d'aspect Pixel à 1,0, mettre micron comme unité de longueur, et cochez la case Global avant de cliquer sur le Bouton OK.
- Utilisez l'option Mesures d'ensemble dans le menu Analyse pour choisir différents paramètres à quantifier lors de la sélection de la mesure. Aux fins de ce protocole, sélectionnez les mesures suivantes : Zone, Périmètre, Valeur grise moyenne, Médiane, Min et valeur grise max, Densité intégrée, Position de pile, et Affichage étiquette.
- Selon la précision des données recueillies, entrez plus de 1 pour l'option des lieux décimals et cochez la case notation scientifique si nécessaire. Après l'application de la commande Mesure, une fenêtre contextuelle Résultats affiche les valeurs de chaque paramètre pertinent. Enregistrer les résultats comme un fichier .csv pour l'analyse future dans un programme de statistiques.
REMARQUE: Il n'est pas nécessaire de séparer une image dans ses canaux fluorescents constitutifs pour déterminer la longueur, à moins qu'il n'y ait interférence de signal entre les différentes couleurs dans ce cas suivre l'étape détaillée ci-dessous. - Dans le cas d'interférence de signal, sélectionnez L'outil Couleur et Canaux du menu Image et analysez chaque couleur séparément. Pour mesurer la longueur des structures non linéaires, cliquez à droite sur l'outil de ligne et utilisez l'option Ligne segmentée ou ligne à main levée pour retracer les objets désirés.
- Pour les structures linéaires ou pour déterminer la distance entre deux points, utilisez la fonction Straight Line et sélectionnez Mesure dans le menu Analyse. Les valeurs de longueur de m seront automatiquement ajoutées aux paramètres précédemment sélectionnés dans l'option Mesures de l'ensemble.
- Pour mesurer les changements dans la taille du signal et l'intensité de la fluorescence, créez d'abord une bibliothèque de région d'intérêt (ROI), qui augmente la précision de quantification et facilite les mesures rapides à travers une pile d'images. Sélectionnez L'outil Couleur et Canaux dans le menu Image.
- Dans la fenêtre contextielle Channels, vérifiez le canal de couleur pour lequel l'intensité ou la zone sera mesurée. Choisissez les fonctionnalités Ajuster et Seuil dans le menu Image. Vérifiez la case d'arrière-plan Dark, sélectionnez la méthode Par défaut (sauf si les données recueillies ne l'exigent pas), et choisissez Red pour rectifier les signaux d'intérêt.
REMARQUE: La mesure de la stabilité des protéines, du mouvement et de la localisation dépend étroitement du seuil de couleur utilisé pour créer des bibliothèques de retour sur investissement. Il est important de choisir la méthode de seuil correcte pour le type de signal de marqueur fluorescent à visualiser17,18. - Utilisez l'outil Wand pour mettre en évidence chaque structure d'intérêt et appuyez sur la lettre T sur le clavier pour ajouter le retour sur investissement sélectionné à la fenêtre de gestionnaire de retour sur investissement pop-up. Répétez ce processus pour chaque tranche (délai) dans la pile d'images et stockez tous les ROC en cliquant sur le bouton Plus et en sélectionnant Enregistrer.
- Ouvrez le dossier de retour sur investissement zippé pour charger le gestionnaire de retour sur investissement et cliquez sur chaque identificateur de retour sur le panneau latéral gauche. Sélectionnez Mesure du menu Analyse et répétez cette commande sur chaque identificateur DE retour sur investissement pour quantifier les objets d'intérêt dans toutes les tranches de la pile d'images.
- Si le déplacement de cellule n'est pas un problème et que le plan focal reste le même pour toutes les tranches de la pile, cliquez sur Multi mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement. Dans la fenêtre contexty, sélectionnez Mesurer toutes les tranches au lieu d'une rangée par tranche pour itérer les mesures à travers la pile d'images. Enregistrez les résultats sous forme de fichier csv et analysez les mesures dans un programme de statistiques.
- Pour plusieurs signaux nucléaires comprenant la structure d'intérêt, appuyez sur la touche Shift tout en sélectionnant des objets avec l'outil Wand pour créer un seul retour sur investissement. Alternativement, créez un retour sur investissement de taille constante avec l'outil ovale pour englober tous les signaux d'intérêt.
REMARQUE: Cette approche ovale peut être nécessaire pour mesurer et décrire le comportement du signal sur une zone où le signal de fluorescence change de taille et d'intensité au fil du temps. L'intensité du signal, dans ce cas, est la densité moyenne du signal sur une zone donnée. - Déterminer qualitativement la co-localisation de deux signaux fluorescents par le changement de couleur de la région de chevauchement du signal. Cependant, comme la zone de co-localisation se rétrécit, il est plus difficile de distinguer le chevauchement des signaux. Dans ce cas, suivez les étapes détaillées ci-dessous.
- À l'aide de l'outil canaux, tel que décrit à l'étape 5.6, tracez une ligne droite sur chaque signal en question et sélectionnez la commande De profil de parcelle dans le menu Analyse.
- Répétez cette étape pour toutes les couleurs en question en utilisant la même ligne tracée.
- Dans la parcelle de fenêtre pop-up de l'échantillon qui apparaît après chaque étape de profilage, appuyez sur le bouton Liste pour appeler une fenêtre Valeurs de parcelle, et enregistrez les mesures pour chaque signal comme un fichier csv.
- Dans un programme de statistiques, créez un graphique qui trace la valeur grise pour chaque signal par rapport à son emplacement correspondant (en m) le long de la ligne tracée. L'absence de chevauchement entre les parcelles de profil de signal indique généralement l'absence de co-localisation.
REMARQUE: Utilisez l'outil Profil de parcelle sur les images projetées pour examiner la colocalisation du signal. Ceci n'est fiable que si un tel chevauchement est également observé à travers l'image z-stack.
- Pour surveiller le comportement dynamique des protéines fluorescentes au fil du temps, utilisez l'outil Multi Kymograph que l'on trouve dans le menu Analyze. L'image résultante montre le mouvement du signal fluorescent à travers une série d'instantanés condensés dans chaque tranche de la z-pile, qui représente des points de temps individuels.
- Utilisez l'outil canaux tel que décrit à l'étape 5.6 pour isoler l'objet d'intérêt dans le canal correct. Assurez-vous que l'objet ou la structure sélectionné ne se déplace pas considérablement à travers la z-pile. Placez une ligne droite ou un rectangle sur l'objet, sélectionnez l'outil Multi Kymograph dans le menu Analyze et entrez la largeur désirée de la ligne superposant l'objet.
- Créez des panneaux d'images qui montrent la dynamique nucléaire sur une fenêtre de temps spécifique à l'aide de l'outil canaux tel que décrit à l'étape 5.6 et en sélectionnant les outils Stacks et Make Montage à partir du menu Image. Dans la fenêtre pop-up Make Montage, entrez le nombre de colonnes et de lignes souhaitées, fixez un facteur d'échelle de 1,0, choisissez les premières et dernières tranches (périodes), et modifiez la largeur de la frontière à au moins 5 avant d'appuyer sur OK. Il est possible de choisir les images dans la pile à afficher en changeant les incréments en fonction de la séquence désirée.
- Pour générer un film, téléchargez l'hyperpile désirée, sélectionnez Enregistrer comme fichier avi dans le menu Fichier, n'en choisissez aucun pour La compressionet entrez un taux de cadre de 2-8 fps. Sélectionnez la commande Make Montage tout en choisissant Composite dans l'outil canaux pour fusionner ou séparer toutes les couleurs composant l'image.
REMARQUE: Deux fichiers avi (Film1-2) sont fournis dans ce protocole. Utilisez-les aux Fidji pour essayer différentes fonctionnalités mises en évidence tout au long de l'étape 5. - Pour afficher une cellule représentative unique, utilisez Transform and Rotate à partir du menu Image et entrez des degrés de rotation. Les nombres négatifs font pivoter les objets vers la gauche, tandis que les valeurs positives tournent les objets vers la droite. Une fois que la cellule est dans la bonne orientation, dessiner un rectangle qui englobe toute la cellule à travers la z-pile ou pendant les périodes d'intérêt et sélectionnez Crop dans le menu Image. Procédez comme mentionné dans les étapes 5.16 et 5.16.1 pour générer un panneau d'image ou un film.
- Pour générer un film, téléchargez l'hyperpile désirée, sélectionnez Enregistrer comme fichier avi dans le menu Fichier, n'en choisissez aucun pour La compressionet entrez un taux de cadre de 2-8 fps. Sélectionnez la commande Make Montage tout en choisissant Composite dans l'outil canaux pour fusionner ou séparer toutes les couleurs composant l'image.
- Ajoutez une barre d'échelle au panneau d'image ou au film en sélectionnant la barre Outils et échelle du menu Analyze. Dans la fenêtre pop-up Scale Bar, entrez 5-15 pour la largeur en microns pour les cellules simples ou 100-250 pour des champs de vision entiers, choisissez blanc ou noir pour la couleur, et choisissez un emplacement approprié pour placer la barre d'échelle.
- Pour les films, il est utile de montrer la progression du temps lors d'événements nucléaires. Pour afficher le changement d'heure entre les images, sélectionnez Image, cliquez sur Stacks, utilisez l'outil Time Stamper, indiquez l'image de début de la série de temps et sélectionnez un emplacement approprié pour l'affichage temporel.
Representative Results
Que l'imagerie cellulaire vivante soit utilisée pour la mitose ou la méiose, il est crucial d'utiliser des cellules de levure de fission saines avant de faire n'importe quel type d'observation. La qualité des données obtenues repose fortement sur le matériau de départ. Si les cellules meurent de faim en raison de la limitation des nutriments ou de la surcroissance, elles présentent un excès de vacuoles et une diminution de la taille des cellules (Starvation, Figure 2A). Pour les expériences de mitose, il est préférable d'éviter d'utiliser des cellules qui montrent un stress cellulaire (Starvation, Figure 2A). Sinon, les résultats expérimentaux seront incohérents et irréproductibles. Pour contourner cette limitation, choisissez des contrôles de type sauvage appropriés et familiarisez-vous avec les différents phénotypes de mutants d'intérêt. Par exemple, les cellules mitotiques affamées pendant 12 h cessent de reproduire activement l'ADN. Depuis Tos4-GFP expression est associée à l'activité G1 / S-phase22,23, cellules logarithmiques portant ce marqueur et un pour la division nucléaire (Sad1-DsRed10) montrent pan-nucléaire Tos4-GFP expression, Sad1-DsRed foci la séparation et la septation continue (suggérant la réplication active de l'ADN et la division cellulaire) (Log, Figure 2A), tandis que les cellules affamées ne montrent aucune activité de ce genre (Starvation, Figure 2A). Ce résultat est compatible avec les effets de la limitation des nutriments dans la levure de fission, qui diminue la transcription dans G1, active le point de contrôle du cycle cellulaire G1/S, et favorise l'entrée G05. Pour les expériences de méiose, les cellules doivent atteindre une densité élevée, mais sans atteindre la phase stationnaire. Par la suite, les cellules des deux types de matés sont mélangées et incubées ensemble dans des médias à faible teneur en azote. Le fait de ne pas s'accoupler, comme c'est le cas lorsque les cellules ne sont pas suffisamment affamées d'azote, les empêchera d'entrer dans la méiose (inefficace, figure 2B). La flocculation robuste de la suspension des cellules d'accouplement augmente l'interaction cellule-cellule et indique ainsi un accouplement réussi et une induction méiotique efficace (Efficace, Figure 2B).
Les tampons de gel Agarose et la perturbation physique des amas cellulaires garantissent une bonne visualisation des cellules individuelles ou asci (Log, Figure 2A; Efficace, Figure 2B). Les coussinets doivent fournir une plate-forme rigide, mais humide sur laquelle les cellules sont simultanément fixées en place et protégées contre la dessiccation. De plus, les coussinets doivent être suffisamment épais pour résister aux changements dus à l'évaporation et fournir une surface nivelée qui permet une mise au point appropriée tout au long de l'acquisition d'image (figure 1C). La rotation des glissements de couverture est nécessaire pour séparer et répartir les cellules dans les agrégats d'accouplement (figure1F; Efficace, Figure 2B). Sans cette étape, peu d'asci mais de nombreuses cellules haploïdes sont observées parce que les asci sont piégés dans des couches inaccessibles d'amas d'accouplement, tandis que les cellules haploïdes sont libres de peupler toutes les taches monocouches disponibles (Figure 2B). Même pour les expériences mitotiques, où l'agglutination cellulaire est moins problématique, la rotation des glissements de cap déplace les cellules autour du coussinet pour créer une seule couche cellulaire avec suffisamment d'espace entre les cellules pour réduire les effets de toilage et permettre la duplication cellulaire (Log, Figure 2A ).
Atb2 est un composant de la tubuline impliquée dans la ségrégation chromosomique dans la mitose de levure de fission et la méiose7,14. Lorsqu'il est étiqueté fluorescent, ce composant cytosquelette permet d'examiner les étapes qui caractérisent la séparation nucléaire dans la mitose. Pendant la prophase (0'-20', Figure 3A),la nucléation du fuseau mitotique se produit dans le côté nucléaire des corps de poteaux de fuseau (SPBs), comme indiqué par les fibres Atb2-mRFP fixées sur un fond pan-nucléaire Htt1-GFP5. Pendant la transition métaphase-anaphase (20'-40', Figure 3A),le fuseau mitotique s'étend vers l'extérieur et le noyau se divise en deux. Comme la cellule entre dans la télophase (60'-80', Figure 3A), Atb2-mRFP se dilate bidirectionnellement jusqu'à ce que les chromosomes soient entièrement séparés. Après ce point, les fibres Atb2-mRFP se regroupent et se propagent à travers la surface cellulaire pour retrouver leur forme interphase dans chacune des cellules filles résultantes. La cytokinésie (la figure3A)se produit seulement après la formation d'un septum et divise la cellule par fission. Suite à des changements dans l'intensité Hht1-GFP au cours d'un cycle mitotique révèle trois étapes importantes dans la dynamique nucléaire: métaphase-anaphase (intensité moyenne, compactage de l'ADN: 20'-40', Figure 3A-B), télophase (faible intensité, séparation de l'ADN: 60'-80', Figure 3A-B), et G1 (augmentation de l'intensité, duplication de l'ADN : 100'-120', Figure 3A-B). De même, mais en utilisant des cellules qui ne portent que Hht1-mRFP et en utilisant l'outil multi-kymographe (voir l'étape 5.15) aux Fidji, il est possible d'observer la division mitotique de la métaphase à la téléophase et d'évaluer les mouvements nucléaires impliqués pendant chromatid sœur appropriée ségrégation (Normal, Figure 3C). Les kymographes mal-ségrégation montrent l'activité du signal entre les deux principales trajectoires nucléaires, ce qui indique une possible mauvaise ségrégation due à la fragmentation des chromosomes ou à une séparation chromatide inappropriée (Lagging, Figure 3C).
Comme mentionné précédemment, dans la levure en herbe et fission, Tos4 est transcrit en G1 et fonctionne pendant la réplication de l'ADN dans la phaseS 22,23. Cela peut être observé dans un kymographe où l'expression Tos4-GFP augmente dans le noyau après Sad1-DsRed10 foyers se déplacent vers des directions opposées (indiquant la division nucléaire), mais avant les formes septum, qui précède la cytokinésie (39', Figure 3D ; 36', figure 3E). La phase d'activité tos4-GFP élevée commence à la fin de la transition M-G1/S (45', Figure 3E) et se termine en G2 ('gt;60', Figure 3E),juste après la division cellulaire. Bien que très diffuse au cours de G1, l'intensité du signal Tos4-GFP augmente après l'anaphase et tout au long de la phase S et co-localise avec des foyers Sad1-DsRed séparés (45'-60', Figure 3E). Ce résultat indique la période de septation dans la levure de fission quand la duplication de génome a commencé dans les cellules de fille (G1/S), mais la cytokinesis n'a pas encore eu lieu.
Hht1 est histone H3 dans la levure de fission et est généralement modifié avec des étiquettes fluorescentes pour visualiser l'ADN nucléaire5,14. Dans la mitose, à mesure que les cellules passent de la métaphase à la télophase (20'-120', Figure 3A),deux changements distincts de la masse nucléaire sont observés. Le premier changement implique une contraction de la taille nucléaire en métaphase (20', Figure 3A), tandis que le second montre le fractionnement du noyau pendant l'anaphase (40', Figure 3A). En plus de partager ces changements avec des cellules mitotiques, les cellules méiotiques présentent une oscillation nucléaire (c.-à-d. le respire-cheval) (-100' à -50', Figure 4A-B) lors d'une recombinaison homologue et d'une nouvelle réduction de la taille du noyau à la fin de l'anaphase II (70'-90', Figure 4A). Hht1-mRFP est utilisé pour examiner les phénotypes de mauvaise ségrégation tels que les chromosomes à la traîne ou fragmentés (lagging, Figure 3C). Il est également utilisé pour observer et décrire la dynamique nucléaire dans chacune des phases de la méiose (figure 4A-B). La masse nucléaire est grande et fluctue en taille pendant une grande partie de la queue de cheval (HT : -100' à -50', figure 4A-B)). Au fur et à mesure que les cellules entrent en métaphase (MT : -40' à 0', Figure 4A-B),la taille et l'oscillation nucléaires diminuent, ce qui correspond à une augmentation de l'activité de condensation à ce stade. Le début de l'anaphase I (MI: 10'-60', Figure 4A-B) et II (MII: 70'-90', Figure 4A-B) est associé à une nouvelle réduction nucléaire et à l'absence de mouvement nucléaire, ce qui est bien corrélé avec les deux divisions nucléaires qui caractérisent méiose I et II (MI et MII). Ainsi, la méiose est associée aux fluctuations de taille nucléaire lorsque les chromosomes homologues s'alignent et se recombinent et avec des réductions de taille nucléaire après deux cycles de séparation des chromosomes. Les allèles qui modifient ces dynamiques nucléaires sont probablement associés à la régulation de la stabilité du génome dans la méiose12,13.
Rec8 est la sous-unité de la cohésine méiotique dans la levure de fission. Il est chargé sur la chromatine après la réplication de l'ADN (mei-S) et maintient chromatides soeur attachés les uns aux autres jusqu'à l'anaphase II. Après la métaphase I, Rec8 est retiré des bras chromosomiques par separase et est protégé au centromere par Sgo1-PP2A. À la fin de la ségrégation homologuée, Rec8 est également éliminé au centromètre, permettant ainsi la séparation chromatide sœur (Figure 5A)6,24. Rec8-GFP avec des marqueurs de la ségrégation chromosomique comme Sad1-DsRed ou Hht1-mRFP permettent la visualisation de la dynamique de cohésion pendant la méiose. Le signal Rec8-GFP est pannucléaire pendant le mei-S (lt; lt;-90', Figure 5A-B), prophase I (-90' à -50', Figure 5A-B),et metaphase I (-40' à 0', Figure 5A-B). Cette observation indique l'association de Rec8-GFP le long des axes de chromosomes qui suit la duplication d'ADN. Au fur et à mesure que les cellules entrent dans l'anaphase I (10', Figure 5A-B),l'intensité du Rec8-GFP diminue dans tout le noyau mais reste forte au centromètre, où elle forme une mise au point dans chaque masse nucléaire (20'-70', Figure 5A-B). Ce résultat est compatible avec la dégradation de Rec8-GFP le long des bras de chromosome mais pas au centromère, qui s'ensuit après la ségrégation d'homolog. Avant l'anaphase II, la mise au point Rec8 disparaît, libérant chromatides soeur pour la séparation dans MII (70'-80', Figure 5A-B). Le marqueur Rec8-GFP est donc utile pour examiner les conditions qui perturbent l'établissement, l'enlèvement et la stabilité globale de la cohésion méiotique. Associé à un marqueur de la division nucléaire tel que Hht1-mRFP5,13, Rec8-GFP peut être utilisé pour répondre aux questions de la façon dont le calendrier de cohésion et la stabilité avant et pendant la méiose affectent la ségrégation chromosomique appropriée12 ,13. Ce protocole ne traite pas des protéines dont la dynamique se produit principalement dans le cytosol. Cependant, le tableau I montre quelques protéines cytosoliques qui sont couramment utilisées pour examiner le cytosquelette et les processus membranaires nécessaires à l'endocytose, à l'exocytose et à la cytokinésie, entre autres processus.
Figure 1 : Préparation des coussinets d'agarose pour l'imagerie cellulaire vivante. (A) Mise en place de la préparation des diapositives assemblée à l'aide d'un porte-tuyaux, d'un ruban adhésif de laboratoire et de lames de microscope. Placer des glissières perpendiculaires les unes aux autres crée une poche où le tampon d'agarose se forme. L'ajout de morceaux de ruban adhésif de laboratoire sur les côtés ajuste la largeur du tampon d'agarose aux spécifications requises. (B) L'agarose fondue est laisser refroidir avant de la mettre sur des lames de microscope pour faire des garnitures. Dans cette étape, il est nécessaire de distribuer le volume d'agarose lentement pour éviter de créer des bulles d'air. (C) La glissière supérieure est placée sur l'endroit d'agarose distribué pour former un coussinet circulaire avec une surface droite, des bords uniformes, et aucune fissure d'agarose visible. (D) Après avoir mis un échantillon de suspension cellulaire sur le tampon d'agarose, inverser la glissière et placer au-dessus d'une serviette en papier sans papier pour enlever le milieu liquide supplémentaire. (E) Placez soigneusement un bordereau sur le tampon d'agarose, en veillant à ne pas piéger les bulles d'air et en vérifiant que le plan de mise au point est plat pour éviter le déplacement des cellules et les problèmes de mise au point. (F) Lentement et prudemment, tournez le coverslip dans le sens des aiguilles d'une montre pour perturber les amas cellulaires et générer une monocouche cellulaire qui permet l'expansion cellulaire et une meilleure visualisation cellulaire. (G,H) Utilisez un mélange d'hydrocarbures chauffés pour sceller les coussinets d'agarose et leur permettre d'équilibrer à la température désirée avant l'imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Choisir les bonnes cellules. (A) Les panneaux supérieurs montrent les cellules de levure de fission laissées à mourir de faim dans EMM plus suppléments pour 72 h et panneau inférieur montre les cellules subissant une croissance logarithmique. Dans les cellules qui sont laissées à mourir de faim, les morphologies de petites cellules peuvent être appréciées. La flèche rouge ouverte montre des granules vacuolar qui sont caractéristiques de la famine. Dans les cultures logarithmiques, les cellules montrant des morphologies allongées et des septa (flèche rouge) abondent, indiquant la dynamique active du cyclisme. Les panneaux de droite montrent des cellules exprimant des signaux Tos4-GFP et Sad1-DsRed pendant la famine et la prolifération. L'expression pannucléaire Tos4-GFP et les signaux Sad1-DsRed qui se localisent aux pôles cellulaires opposés sont observés lors de la prolifération active, mais pas dans la famine. (B) Le panneau supérieur montre les cellules du même type de mate (h) ne s'accouplent pas efficacement. La flèche rouge ouverte montre une paire de cellules vacuolaires subissant la karyogamie. Ce n'est pas inhabituel dans les cultures de cellules h, où 10% des cellules peuvent passer de type mate à h-. Le panneau inférieur montre les asci résultant de l'accouplement efficace. Les ascizytiques prennent plusieurs formes, y compris les formes de zig-zag (flèche rouge) et de cellule bananière (flèche ouverte rouge). Barre d'échelle de 5 m de longueur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Dynamique nucléaire mitotique. (A) Les protéines Histone H3 (Hht1-GFP) et microtubule (Atb2-mRFP) ont été suivies au cours d'un cycle de mitose (120 min). Les signaux individuels pour Hht1-GFP et Atb2-mRFP sont affichés en panneaux noirs et blancs, tandis que la fusion BF les montre dans leurs couleurs respectives. (B) Quantification de l'intensité Hht1-mGFP sur un cycle mitotique. Le changement des niveaux de Hht1 est indicatif de la division nucléaire pendant la mitose et la duplication d'ADN dans G1. (C) Kymographs montrant une ségrégation normale ou anormale dans la mitose où les voies nucléaires qui en résultent bifurquent et conservent l'intégrité de l'ADN ou s'écartent et favorisent la fragmentation chromosomique ou la séparation chromatide prématurée, respectivement. (D,E) Panneaux de kymographe et de micrographe montrant la durée de M-to-G1/S révélée par la ségrégation de Sad1-DsRed et l'apparition des signaux tos4-GFP nucléaires. Notez les panneaux moyens en E qui ont été générés à l'aide du FIRE LUT aux Fidji pour créer une carte thermique à forte intensité qui facilite l'identification des taches à haute expression Tos4-GFP; dans ce cas, localisé au noyau et chevauchant les signaux Sad1-DsRed, comme prévu. Barre d'échelle de 5 m de longueur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Dynamique nucléaire méiotique. (A) Série de panneaux montrant le mouvement, le compactage et la division du noyau (Hht1-mRFP) pendant la méiose. La queue de cheval (HT) montre de vastes oscillations nucléaires d'un côté à l'autre suivies de Metaphase (MT), où le mouvement latéral nucléaire diminue et s'arrête entièrement juste avant l'anaphase I. Dans la méiose I (MI), la masse nucléaire principale se divise en deux, tandis que dans la méiose II (MII) quatre noyaux sont générés pendant le processus de séparation chromatide sœur. (B) Quantification du changement de zone nucléaire (Hht1-mRFP) en prophase, métaphase, MI et MII. La zone nucléaire est dynamique pendant les oscillations HT, se condense en MT, et diminue encore dans la taille pendant MI et MII, où peu de mouvement nucléaire est observé (long axe nucléaire). La mesure de l'axe nucléaire le plus long (long axe nucléaire) repose sur l'idée qu'à mesure qu'un cercle s'étire, il cesse d'avoir un diamètre constant et génère au moins deux axes principaux : long et court. Ainsi, lorsque la surveillance change dans le noyau, les changements dans l'axe long ou court fournissent des indications de mouvement nucléaire. Barre d'échelle de 5 m de longueur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Dynamique de la cohésine méiotique. (A) Série de panneaux montrant comment le changement de signal Rec8-GFP est en corrélation avec la dynamique nucléaire méiotique. Pendant le HT et le MT, le signal Rec8-GFP est pannucléaire et suit le mouvement nucléaire (Hht1-mFRP). Dans MI, Rec8-GFP se dissipe du noyau, ne laissant qu'une paire de foyers, ce qui est compatible avec l'élimination Rec8 des bras chromosomiques et l'établissement de la protection Sgo1-PP2A au centromere. Comme la cellule s'approche MII, les foyers Rec8-GFP commencent à disparaître et ne sont plus vus juste avant l'anaphase II. (B) Quantification de l'intensité Rec8-GFP de HT à MII. Semblable à ce qui est vu dans A, signal GFP est élevé à travers HT et MT, diminue considérablement pendant MI et disparaissent complètement dans MII. Ce modèle corrobore la dynamique de la cohésine aux bras chromosomiques et au centromètre, où il maintient les chromatides soeurs attachés jusqu'à ce qu'ils soient séparés dans le MII. Barre d'échelle de 5 m de longueur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| protéine | fonction | Commentaires | étiquette | Références | ||
| Hht1 (Hht1) | Histone H3 impliqué dans l'emballage de l'ADN | Utilisé pour examiner la dynamique chromosomique | Hht1-mRFP | 5,14 Annonces | ||
| Tos4 (tos4) | La fonction Tos4 se produit pendant la phase G1 | Employé pour étudier le calendrier G1 | Tos4-GFP | 22,23 | ||
| Rad21/ Rec8 | Cohesin sous-unités impliquées dans le maintien chromatids soeur ensemble après la réplication | Utilisé pour analyser la stabilité de la cohésion pendant la ségrégation mitotique (Rad21) et méiotique (Rec8) | Rad21-GFP/Rec8-GFP | 6,24 Annonces | ||
| Rad11 (en) | L'activité de RPA se produit pendant la réparation mitotique d'ADN, la recombinaison méiotique, et se termine dans la métaphase | Employé pour étudier la réparation d'ADN dans la mitose et la dynamique de recombinaison dans la méiose | Rad11-YFP | 5,13 Annonces | ||
| Rad52 (en) | L'acivité rad52 a lieu pendant la réparation mitotique de l'ADN et la recombinaison méiotique | Employé pour étudier la réparation d'ADN dans la mitose et la dynamique de recombinaison dans la méiose | Rad52-CFP | 5,13 Annonces | ||
| Cnp1 (en anglais) | Histone H3 CENP-A localise spécifiquement au centromere | Utilisé pour suivre la dynamique de ségrégation chromosomique dans la mitose et la méiose | Cnp1-mCherry | 13 (en) | ||
| Swi6 (en anglais) | Protéine homologue HP1 impliquée dans la formation d'hétérochromatine | Employé pour étudier la mobilisation de l'hétérochromatine au centromètre et aux télomères | Swi6-GFP | 13 (en) | ||
| Triste1 | Sad1 est impliqué dans la localisation du corps du poteau à broches à l'enveloppe nucléaire | Employé pour analyser la ségrégation chromosomique dans la mitose et la méiose | Sad1-mCherry | 10 Ans et plus | ||
| CYTOSOL ET MEMBRANE | ||||||
| Atb2 (en) | Tubulin alpha 2 impliqué dans l'organisation de cytosquelette de microtubule | Utilisé pour examiner la ségrégation chromosomique dans la mitose et la méiose | Atb2-mRFP (en) | 7,14 Annonces | ||
| Ync13 (en) | Régulateur d'exocytose et d'endocytose impliqué dans le transport par la vésicule | Employé pour étudier l'intégrité de cellule-mur pendant la cytokinesis | Ync13-mECitrine | 25 Annonces | ||
| Rlc1 (en) | Sous-unité Myosin II impliquée dans la contraction de l'anneau contractile | Utilisé pour explorer la dynamique de la maturation et de la contraction du septum | RIc1-mCherry (en) | 25 Annonces | ||
| Ccr1 (en) | NADPH-cytochrome p450 réductase qui fait partie de la membrane externe ER, plasma, et mitochrondrial | Employé pour examiner la dynamique membranaire-associée telle que l'endocytose, l'exocytose, et la cytokinesis | Ccr1N-GFP | 5 Annonces | ||
| Gef1 (En) | Rho guanyl-nucléotide facteur d'échange impliqué dans l'établissement et le maintien de la polarité cellulaire | Utilisé pour examiner la dynamique globale de polarité cellulaire dépendante des microtubules | Gef1-mCherry-GBP | 26 Annonces | ||
| Fus1 (Fus1) | Formin impliqué dans l'assemblage de mise au point de fusion d'actin pendant la cytogamie | Utilisé pour étudier la dynamique de fusion associée à l'accouplement de levure de fission | Fus1-sfGFP | 27 Annonces | ||
| Mnn9 (en) | Sous-unité de mannolsyltransferase impliquée dans la glycosylation protéine N-liée dans l'appareil de Golgi | Employé pour étudier la maturation de la cargaison dans le Golgi au fur et à mesure qu'il progresse de cis-Golgi à trans-Golgi | Mnn9-mCherry | 28 Annonces | ||
| Num1 (en) | Facteur d'ancrage cortical pour la dyneine impliquée dans le cheval-tailing | Utilisé pour examiner l'ancrage de la dyneine mitochondriale pendant l'oscillation nucléaire dans la prophase méiotique I | Num1-yEGFP | 29 Ans et plus | ||
Tableau 1 : Marqueurs de la dynamique nucléaire et cytoslique.
Film 1 : Transition M-to-G1/S montrant le corps de poteau de fuseau (SPB ; Sad1-DsRed) séparation précédant la septation et l'accumulation du signal nucléaire Tos4-GFP. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Film 2 : Achèvement du cycle mitotique montrant l'extension de microtubule (Atb2-mRFP) corrélée avec la division nucléaire (Hht1-GFP). Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Discussion
L'imagerie à cellules vivantes pendant la mitose et la méiose offre la possibilité d'examiner la dynamique nucléaire sans perturber considérablement la physiologie de la levure de fission lors de l'acquisition de données. Cependant, il faut faire preuve de prudence pour s'assurer que les cellules atteignent les densités désirées exemptes de stress environnementaux; et pour la méiose, que les cellules sont représentées pendant le temps de la différenciation terminale et pas trop tôt ou tard. L'encombrement cellulaire excessif, la famine, et les températures de croissance inappropriées sont des facteurs communs qui contribuent aux observations irréproductibles. En outre, pendant la construction de la souche, il est crucial de tester que les étiquettes fluorescentes n'interfèrent pas avec les fonctions des gènes cibles ni n'ont d'impact sur la condition physique globale des cellules. Le fait de ne pas inspecter de près les phénotypes des souches portant des marqueurs fluorescents peut entraîner des résultats incohérents et incomparables dans des génotypes similaires.
Bien que les coussinets d'agarose de microscope soient simples à assembler, ils peuvent également poser un obstacle à l'obtention de données d'imagerie précieuses. Créer des coussinets d'agarose est aussi simple que de placer trois lames de microscope parallèles les unes aux autres, de distribuer de l'agarose fondue sur la glissière du milieu et de mettre une glissière qui transverse le haut des autres diapositives. Il est toutefois utile d'assembler un appareil de curseur qui permet des modifications de largeur pour fabriquer des coussinets d'agarose résistants et spécifiques à la situation. Un simple curseur qui donne une flexibilité de largeur de garniture se compose d'une plate-forme (porte-tête de bouts de pipette ou du banc), de deux glissières de microscope, et de la bande de laboratoire agissant comme mécanisme d'ajustement de pad-largeur (figure 1A). L'épaisseur exacte du tampon dépendra des exigences de temps d'imagerie, de la marque agarose, de la température, du scellant de coverslip, du taux d'évaporation, etc. Ainsi, il est important de calibrer le système d'imagerie avant l'acquisition de donnéesafin d'augmenter la reproductibilité technique et d'améliorer la qualité de l'imagerie cellulaire 1,2,3. La surface de la garniture, la rigidité et la composition sont essentielles lors de l'acquisition prolongée d'images. Agarose a une faible fluorescence de fond, peut être facilement moulé, et à la concentration appropriée, résiste à la déformation structurelle due à l'évaporation. De plus, la combinaison de la levure de fission avec de l'agarose ne compromet pas la qualité de l'image et permet une observation étendue des cycles multiples de mitoses et de méiose. En outre, il est important d'éviter les bulles d'air pour la microscopie time-lapse. À l'intérieur des coussinets d'agarose et à l'intérieur de l'échantillon, les poches d'air se dilatent au fil du temps, ce qui provoque le déplacement des cellules et perturbe les plans focaux. Pourvu que les cellules soient efficacement dispersées par rotation de coverlet, les chercheurs peuvent suivre des processus mitotiques sur plusieurs générations et des événements méiotiques de la fusion nucléaire à la sporulation. La fabrication et le choix du bon coussin pour les expériences d'imagerie prend du temps à maîtriser, mais une fois atteint, peut contribuer à des observations au microscope très instructif.
Comme c'est le cas avec d'autres méthodes, la microscopie en cellule vive n'est pas exempte de limitations techniques. L'utilisation de protéines fluorescentes introduit des limites aux expériences qui limitent la portée de ce qui peut être étudié. Le blanchiment photo et la phototoxicité sont des problèmes typiques de l'acquisition prolongée d'images. Ils peuvent être contrecarrés en n'exposant pas les cellules à de courtes longueurs d'onde trop longues ou trop fréquentes. Pour les expériences impliquant GFP, CFP, YFP, mRFP, et DsRed, protéines fluorescentes typiques utilisées dans l'imagerie à cellules vivantes de levure de fission, il est courant d'employer 5-15% de lumière d'excitation et 100-500 ms temps d'exposition pour des expériences de routine. Ces paramètres changent, cependant, en fonction des exigences spécifiques de l'expérience du chercheur. En outre, les z-stacks composés de 9-13 sections avec 0,5 m d'espacement à l'aide d'un objectif 60x est suffisant pour résoudre l'épaisseur d'une cellule de levure de fission. En outre, il est important de confirmer que les marqueurs fluorescents ne perturbent pas la régulation ou la fonction appropriée des protéines cibles ou ne génèrent pas de faux phénotypes. Ainsi, il est conseillé de construire des souches contenant différentes étiquettes fluorescentes et d'affinité pour le même gène cible pour corroborer les observations par différents moyens. En outre, il incombe aux chercheurs de s'assurer que les paramètres expérimentaux peuvent être reproduits à travers les expériences et que les données recueillies sont aptes à l'analyse en aval1,3. Aucune technologie ne peut remplacer la pratique éprouvée consistant à valider méticuleusement les systèmes expérimentaux par une observation attentive et un examen rigoureux de la linéarité dans la détection des signaux fluorescents.
Enfin, il est crucial d'analyser les données de microscopie dans des formats qui ne modifient pas les images brutes. Fidji fournit d'excellents outils de documentation pour suivre les mesures des données brutes et permet aux chercheurs d'examiner différents paramètres cellulaires en une seule session. Ces caractéristiques, ainsi que sa richesse de tutoriels en ligne et une vaste couverture documentaire, font de Fidji un outil important pour mesurer, analyser et présenter des données d'imagerie cellulaire en direct qui décrivent la dynamique nucléaire de la levure de fission dans la mitose et la méiose.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier Natalia La Fourcade et Mon LaFerte d'avoir rendu la préparation de ce manuscrit plus agréable. Merci aux membres du laboratoire de Forsburg qui ont contribué à l'achèvement de ce travail avec leur perspicacité, leurs idées d'expériences et leur soutien moral. Ce projet a été soutenu par NIGMS R35 GM118109 à SLF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
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