Summary
כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.
Abstract
הדמיה של תא חי היא טכניקה מיקרוסקופית המשמשת לבדיקת הדינמיקה של תאים וחלבונים בתאי החיים. שיטת דימות זו אינה רעילה, בדרך כלל אינה מפריעה לפיזיולוגיה של התאים, ודורשת טיפול ניסיוני מינימלי. רמות נמוכות של הפרעות טכניות לאפשר לחוקרים לחקור את התאים על פני מחזורים מרובים של מיטוזה ו להתבונן מיוזה מתחילתו ועד סופו. באמצעות תגי פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק (GFP) וחלבון פלורסנט אדום (RFP), החוקרים יכולים לנתח גורמים שונים שתפקידם חשוב עבור תהליכים כמו תמלול, שכפול דנ א, לכידות, והפרדה. ביחד עם ניתוח נתונים באמצעות פיג'י (גרסה חופשית, ממוטבת של התמונה), הדמיה של תא חי מציעה דרכים שונות להערכת התנועה חלבון, לוקליזציה, יציבות, תזמון, כמו גם דינמיקה גרעינית והפרדה כרומוזום. עם זאת, כמו במקרה של שיטות מיקרוסקופ אחרות, הדמיה של תא חי מוגבלת על ידי המאפיינים הפנימיים של אור, אשר לשים מגבלה על כוח הרזולוציה בעלי הרמה גבוהה, והוא גם רגיש לפוטוהלבנה או רעילות באורך הגל הגבוה תדרים. עם זאת, בטיפול מסוים, החוקרים יכולים לעקוף את המגבלות הפיזיות הללו על ידי בחירה קפדנית של התנאים הנכונים, זנים, סמנים פלורסנט כדי לאפשר הדמיה מתאימה של אירועים mitotic ו-meiotic.
Introduction
מיקרוסקופ תא חי מאפשר לחוקרים לבחון את הדינמיקה הגרעינית מבלי להרוג תאי שמרים ביקוע ומבטל את הצורך בתיקונים וכתמים קטלניים. ניתן לראות את היציבות, תנועה, לוקליזציה, והעיתוי של חלבונים מתויגים fluorescently כי הם מעורבים באירועים חשובים כגון שכפול כרומוזום, שילוב מחדש, והפרדה, בנוסף קרום והשלד ציטוזה תנועות. על ידי שמירה על הכדאיות התאית וזיהוי אותות שאינם רעילים, ישנה חדירה פיזיולוגית מינימלית. כאשר מבוצע כראוי, שיטה זו מיקרוסקופית יכולה להפחית את ההשפעות ההמייסדות שעולות מהטיפול הטכני המורחב או מפעילות מחודשת כימית מלאכותי. יתר על כן, במהלך הניסוי, החוקרים יכולים לעשות תצפיות מסוימות של מצבי הלחץ והמתח שמרים ביקוע, יעילות ההתרבות, ומצב האפוטוטיק המציינות פרמטרים לא הולמים הדמיה או פיזיולוגיה תא נורמלי1 ,2,3.
מיטוזיס ומיוזיס מאופיינים בחלוקה גרעינית ותאית. ב מיוזיס, בניגוד מיטוזיס, התוכן הגנטי הוא הסתפק בתאי ההורה להצמיח תאים הבת4. מכיוון שדימות תאים חיים מספק ממד זמני בנוסף לקשר המרחבי, ניתן לבחון מספר גדול של תאים בזמן אמת. מיקרוסקופ תא חי איפשר לחוקרים לבחון את הדינמיקה של החטיבה הגרעינית באמצעות תגי פלורסנט עבור יסטוניים5, cohesin חלבוניות6, microtubules7, צנטוממרים8, קינטומטלות9, מרכיבים של הגוף מוט הציר (SPB)10, ואלה של קומפלקס הנוסעים כרומוזום (cpc)11. מחוץ למנגנון ההפרדה של כרומוזום, הדמיה תא חי גם לכדו את ההתנהגות של חלבונים הנחוצים, אבל לא מעורב ישירות בהפרדה כרומוזום. הפונקציה של חלבונים אלה הוכח להשפיע על השכפול, כרומוזום שילוב מחדש, תנועה גרעינית, וכרומוזום מצורף ל microtubules12,13,14. תצפיות אלה תרמו להבנה טובה יותר של אירועים סלולאריים שהרכיבים הפונקציונליים שלהם לא היו מתכלים לבחינה ביוכימית או גנטית. עם ההתקדמות החדשה בטכנולוגיה מיקרוסקופית, מגבלות כגון ברזולוציה ירודה, הלבנת, פוטורעילות, ויציבות מיקוד יהיה להפחית, ובכך להקל על תצפיות בזמן אמת טוב יותר של mitotic ודינמיקה גרעינית מיוטית1, 2,3. Meiosis מאתגרת במיוחד כפי שהוא מסלול בידול מסוף שדורש תשומת לב מקרוב לתזמון.
המטרה של פרוטוקול זה היא להציג שיטה פשוטה יחסית לבחינת הדינמיקה הגרעינית בזמן אמת ביקוע הגרעיני מיטוזיס ו meiosis. כדי להשיג זאת, יש צורך להשתמש בתאים שלא נחשפו למתח סביבתי, להכין רפידות agarose שיכולות לעמוד בהדמיה ממושכת, וכן לטעון תאים בצפיפויות המאפשרים הדמיה של דינמיקה תא בודד. יתר על כן, פרוטוקול זה עושה שימוש בתאים הנושאים חלבונים מתויגים fluorescently המשמשים כסמנים שימושיים עבור קינטיקה גרעינית (Hht1-mRFP או Hht1-GFP), הפרדה כרומוזום (Sad1-DsRed), הדינמיקה של השלד (Atb2-mRFP), ההמרה הפעלה ב-G1/S (Tos4-gfp), ויציבות הלכידות ב-מיוזה (Rec8-gfp). שיטה זו גם מציגה סמנים גרעיניים ו ציטוסולג נוספים (טבלה I) כי ניתן להשתמש בצירופים שונים כדי לטפל בשאלות על תהליכים סלולריים ספציפיים. יתר על כן, כלי פיג'י בסיסיים מוצעים כדי לסייע לחוקרים לעבד תמונות בתאים לחיות ולנתח סוגים שונים של נתונים. כוחה של גישה זו נובע משימוש בתצפיות בזמן אמת של דינמיקת חלבון, עיתוי ויציבות לתיאור תהליכים הנמצאים בלתי-מתאימים לביצוע הראוי של מיטוזיס ומיוזיס.
Protocol
1. הכנת מדיה15,16
- פתרונות מניות
- הכינו פתרון מלאי מלח 50x על-ידי הוספת 52.5 g של MgCl2· 6h20, 0.735 g של cacl2· 2h20, 50 g של kcl, ו 2 גרם של Na2S04 בבקבוק המכיל 1 L של מים מזוקקים. מערבבים את התמיסה ביסודיות ומעקר לפי סינון. הציבו מקום ב-4 ° c לאחסון לטווח ארוך.
- הפוך 1, 000x פתרון מלאי ויטמין על ידי ערבוב של 1 גרם של חומצה פנטטימית, 10 גרם של חומצה ניקולט, 10 גרם של inositol, ו 10 מ ג של ביוטין בבקבוק המכיל 1 L של מים מזוקקים. מערבבים היטב את התמיסה ומעקר לפי סינון. שמרו על 4 ° c לאחסון לטווח ארוך.
- הכינו 10, 000x מינרלים פתרון מניות על ידי הוספת 5 גרם של חומצה חומצת, 4 גרם של mnso4, 4 גרם של השאז4· 7h2o, 2 גרם של השאול2· 6h2o, 1 גרם של קי, 0.4 g של חומצה molybdic, 0.4 g של cuso4· 5h20 , ו-10 גר' חומצת לימון בבקבוק המכיל 1 ל' של מים מזוקקים. מערבבים את התמיסה ביסודיות ומעקר לפי סינון. הציבו מקום ב-4 ° c לאחסון לטווח ארוך.
- הפוך פתרונות מניות מזינים בודדים על ידי הוספת 7.5 g של אדנין, leucine, היסטידין או ליזין לתוך בקבוק המכיל 1 L של מים מזוקקים. השתמש רק 3.75 g כדי להפוך את הפתרון אורציל. לחטא את הפתרונות על ידי אוטוקלינג.
הערה: לאורך הזמן, התמיסה. מגזימה בפתרון כדי להביא שוב את הפתרון, חם במיקרוגל ב 60% כוח בהפרשים של 10 או מקום באמבט מים 55 ° c במשך 20 דקות. מערבולת הפתרון החם עד כל הגושים אורציל נעלמים.
- תמצית שמרים פלוס תוספי מזון (כן)
- ב 2 L בקבוקון, להוסיף 1 L של מים מזוקקים, 5 גרם של בסיס תמצית שמרים, 30 גרם של גלוקוז, ו 225 מ"ג כל אדנין, uracil, L-histidine, L-leucine, ו-L-ליזין. להוסיף 20 גרם של אגר כדי להפוך את המדיום מוצק.
- השתמש בחטיף מגנטי כדי לפזר לחלוטין את המרכיבים לתוך הפתרון. אגר יימס לאחר המדיום הוא מעוקר על ידי אוטוקלינג.
הערה: לנוחות, מוכן לשימוש אבקת YES הוא גם מסחרית זמין.
- אדינבורו בינונית מינימלית (EMM) ו מגלוטמט בינונית (PMG)
- ב 2 L בקבוקון, לשלב 1 L של מים מזוקקים עם 3 גרם של אשלגן מימן phthalate, 2.2 גרם של Na2hpo4, 5 גרם של NH4Cl, 20 גרם של גלוקוז, 20 מ ל של פתרון מניות מלח, 1 מ ל של פתרון מניות ויטמין , ו 0.1 mL של פתרון מלאי מינרלים. החלף את NH4Cl עם 2.2 g של L-גלוטמית חומצה מונוסודיום מלח להכין pmg. כדי להפוך את המדיום מוצק, להוסיף 20 גרם של אגר.
- באמצעות בר מגנטי המהומה, לפזר את החומרים ביסודיות. אגר יימס לאחר המדיום הוא מעוקר על ידי אוטוקלינג. לפני השימוש, להוסיף פתרונות מניות התזונתי לפי הצורך. עבור כל 1 L של בינוני, להוסיף 15 מ ל כל אחד adenine, leucine, histidine, ו ליזין. השתמש 30 mL עבור uracil, מאז הוא מרוכז פחות מאשר פתרונות תזונתיים אחרים.
הערה: לנוחות, מוכן לשימוש של EMM ו PMG אבקות הם גם זמינים מסחרית.
- תמצית מאלט (ME)
- השתמש 2 L בקבוקון לערבב 1 L של מים מזוקקים עם 30 גרם של תמצית מאלט ו 225 מ"ג כל אדנין, uracil, histidine, ו leucine. כוונן את ה-pH ל-5.5. כלול 20 גרם של אגר כדי להפוך את המדיום מוצק.
- התמוססות רכיבים לתוך הפתרון באמצעות פס מגנטי. אגר יימס לאחר המדיום הוא מעוקר על ידי אוטוקלינג.
- בעלי מזון (ספא)
- ב 2 L בקבוקון, להוסיף 1 L של מים מזוקקים, 10 גרם של גלוקוז, 1 גרם של KH2PO4, 1 מ ל של ויטמין מלאי, 45 מ"ג כל אדנין, uracil, histidine, leucine, ו ליזין הידרוכלוריד. להוסיף 20 גרם של אגר כדי להפוך את המדיום מוצק.
- השתמש בחטיף מגנטי כדי לשלב ביסודיות מרכיבים. אגר יימס לאחר המדיום הוא מעוקר על ידי אוטוקלינג.
2. ביקוע תרבות שמרים15,16
- השתמש כן מוצק בינוני כדי להתעורר זנים שמרים ביקוע משימור קריוגני. בהתאם לדרישות הטמפרטורה של כל זן, מודטה ב -25 ° צ' או 32 ° c עבור 3-5 ימים.
- כאשר המושבות גלויות, הכינו תרבות נוזלית ראשונית. לבחור תאים ממושבות בודדות לאיחסן אותם לתוך צינורות מבחן המכיל 3 mL כן נוזלי בינוני. הגדל בטמפרטורה המתאימה לשלב האמצע או יומן הרישום המאוחר.
הערה: עבור האנטנה הנכונה, להשתמש בצינורות או צלוחיות עם כרכים לפחות 5x גדול יותר מאשר נפח התרבות הנוזלית מיועד. מהירויות טלטול בין 150-220 סל ד מקובל על צמיחת תרבות שגרתית. - לחלק 250-500 μL של תרבות התחלתית לתוך בקבוקון 50 mL המכיל 9.5-9.75 mL של YES, EMM או PMG בתוספת תוספי מתאים. אפשר לתאים לצמוח לצפיפות הרצויה ולבדוק מתחת למיקרוסקופ עבור מורפולוגיה התא הנכון והמצב התזונתי.
הערה: כדי לאחסן זנים תעורר עד חודש, לאטום צלחות YES עם סרט פרפין ומקום ב 4 ° c.
3. הכנה לדוגמא2
- כיוונון שקופיות של מיקרוסקופ
- להוסיף 2 g agarose בגביע 500 mL המכיל 100 mL של מינימלי בינונית פלוס תוספי מזון (mitosis) או ספא נוזלי (meiosis). חמם את הפתרון האגקם במיקרוגל בתנור ב 60% כוח בהפרשים של 10 או מקום באמבט מים של 55 ° c במשך 10 דקות. מערבולת את הפתרון כדי להבטיח היתוך יעיל. הכינו את הכיוונון להכנת שקופיות (איור 1A) כדי להבטיח הכנה מהירה של המקלדת ולמנוע הכנת מבנה מותך מפני השטח.
- לאפשר agarose מותכת להתקרר עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר ולוותר 50-100 μL כתמים על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות טיפים משעמם בצנרת. לפני שהוא מתקרר, מניחים שקופית מיקרוסקופ על החלק העליון כדי ליצור משטח כפולה של כ 1.5-2 ס מ קוטר (איור 1B-C). רוחב של כרית agarose הוא פרופורציונלי בדרך כלל לאורך זמן ההדמיה. במילים אחרות, רפידות עבות יותר לעמוד בתקופות דימות ארוכות יותר.
- השתמש תערובת פחמימנים כחומר איטום כדי להבטיח כיסוי מתאים של שקופיות עם כריות הצמח עבה כדי למנוע מוות התאים מחשיפה ממס בקצוות coverslip. מערבבים חלקים שווים (w/w) של ג'לי נפט, לנולין, ו פרפין בגביע 500 mL. מרכיבי חום על צלחת חמה ב 120 ° c עבור 5 דקות. כאשר הרכיבים נמסים, מערבולת בזהירות את הפתרון המותכת כדי להבטיח ערבוב מתאים.
- הכיוונון לדוגמה
- לבדיקה של אירועים mitotic, לגדול תאים מתרבויות המתחיל ב-EMM נוזלי או PMG פלוס תוספי מזון בערך באמצע יומן (OD595 של 0.4). צנטריפוגה 1 מ ל של השעיית התא ב 1,375 x g עבור 1 דקות, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה התא בינוני מינימלי פלוס תוספי הנפח הסופי של 100 μl.
- כדי התמונה אירועים meiotic, לגדול תאים מתרבויות המתחיל ב בינוני מינימלי פלוס תוספי לשלב מאוחר יומן (OD595 של 0.7-1.0). שלב אמצעי אחסון שווים של תאים מסוג השני (h- ו-h+) בהשעיה של תא 1 mL. בתאי צנטריפוגה ב 1,375 x g עבור 1 דקות ולהשעות את הגלולה ב-ME נוזלי. חזור על שלב זה שלוש פעמים כדי להבטיח הסרת מזינים יעילה.
- לאחר השטיפה האחרונה ME, השהה את התאים מחדש 1 מ ל ולהוסיף אותו בקבוקון 50 mL המכיל 9 mL ME. מודטה עבור 12-16 h ב 22-25 ° צ' על מהירות סיבוב מינימלי (50-100 RPM). ביקוע תאים שופע, שמביא לגושים עגולים רבים של שמרים ומעיד על הזדווגות יעילה.
- קח 1 מדגם mL של תרבות ההזדווגות וצנטריפוגה ב 1,375 x g עבור 1 דקות. לחסל את supernatant אבל לעזוב 250 μl בצינור כדי להשעות את התאים מחדש. לפני הצבת תאים על רפידות agarose, מערבולת במרץ עבור 5 s לשבש את הגושים.
הערה: הנותרים 250 μL ME השתמשו כדי להשעות את התאים מכיל גורמי ההזדווגות המסייעים לתאים להזין meiosis. - מקום 20 μL של השעיה תא mitotic או meiotic על משטח 2% agarose. הסר מדיום עודפת על-ידי היפוך השקופית והכנסתו בראש מגבת נייר נטולת סיבים עבור 2-3 s (איור 1D). הגדר את משטח השקופית מעלה ובעדינות למקם שמיכות זכוכית, המבטיח לא ליצור בועות אוויר (איור 1F).
הערה: הסרת בינונית עודפת עם מגבת נייר היא יעילה יותר בזמן מספיגת כבידה, שהיא קריטית במיוחד בניסויים מיוזיס. - כדי ליצור מונאולייר תא, סובב את הכיסויים עם האצבע המורה עבור אחד (מיטוזיס) או שניים (meiosis) הפניות מלאות (איור 1F). ודא את החומר התא מפזר על פני משטח agarose המאפשר הפרדה טובה יותר של תאים בודדים או asci. בעזרת מקל עץ קטן, מוותר על איטום מותך לאורך קצות שמיכות כדי לאטום את כל משטח agarose (איור 1G).
- לאחר כרית agarose אטומה, למקם אותו על הבמה המיקרוסקופ ולתת לו להתאים עבור 10-15 דקות בתנאים הדמיה המתאים (למשל, טמפרטורה) (איור 1H) כדי לאפשר בועות אוויר להתפזר ולתת כל הרגע האחרון משמרות להתרחש. התחלת הדמיה לאחר שהשקופית מעורפלת באופן יעיל ואינה מסירה אותה מהבמה עד לסיום איסוף הנתונים.
הערה: השליטה בטמפרטורה ובלחות נקבעת על-ידי מערכת המיקרוסקופ המועסקים ודרישות נסיוניות ספציפיות. אם הווה, החל את הטמפרטורה והלחות על כל ניסויי ההדמיה. אם נעדרים, החוקרים חייבים לתכנן דרך כדי למנוע תנודות בטמפרטורה, במיוחד במהלך ניסויים מיוזה.
4. הדמיה של תא בשידור חי2 ועיבוד
- השתמש במטרת 40x כדי למצוא שדות תצוגה מתאימים לתמונה. עבור אל מטרת 60x כדי להתחיל ברכישת נתונים. בהתאם למערכת המיקרוסקופ בשימוש, בעקבות התמקדות מחדש ומיקוד על המדגם בכל נקודה תתרחש באופן ידני או באמצעות מיקרוסקופ או תוכנה אוטומטי התהליך.
הערה: התמונות המוצגות בפרוטוקול זה נאספו באמצעות פירוק, מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד Sedat, RFP ו-GFP מסנן ערכות, ננו-motion שלב, 60x NA 1.4 המטרה עדשה, ו-12-bit מצלמת CCD. תריסים מכניים מובנים וגלגלי סינון ממונעים מותרים לחשיפה מופחתת והלבנת דגימות. - השתמש בתוכנה מתאימה לרכישה ולעיבוד תמונות. כדי לפרק תמונות, השתמש בפונקציות העברה אופטית שסופקו על-ידי היצרן.
הערה: לפרטים על ציוד המיקרוסקופ והתוכנה המשמשים בפרוטוקול זה, עיין בטבלת החומרים. - כדי להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטית קונבנציונאלי לרכישת תמונות בשידור חי להבטיח כי המיקרוסקופ אוסף נתונים דיגיטלית, יש 40x או 60x מטרות עם פתחים מספריים (NA) גדול יותר מ 1.2, והוא מסוגל לבצע מידע אופטי.
הערה: ללא דרישות אלה, התמונות יראו רזולוציה מופחתת, ותסכן את איכות המדידות המיקרוסקופית והתצפיות האיכותניות. - השתמש בתוכניות plug-in ללא תשלום (לדוגמה, פיג'י) כדי למזער שגיאות טשטוש שיטתית הנובעות מאובדן הניגודיות במהלך רכישת התמונה17,18,19,20 וכלה כדי להבטיח ניתוח כמותי תקין של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ואירועים אחרים הזמני והדינמי בתוך התא.
הערה: ניתן למצוא תוכניות מסחריות אחרות הזמינות בטבלת החומרים. - בחר את ערכות מסנני המיקרוסקופ המתאימים ביותר fluorophores תחת התבוננות. ודא כי העירור ואת מסנני הפליטה יש את הרצועה הנכונה עובר כי לאפשר זיהוי ספציפי של חלבונים פלורסנט. לדוגמה, כדי לזהות את האות של CFP, מעבר של להקה ולהקת פליטה של 430/25 ו-470/30 מתאים, אך לא עבור הקרינה הפלואורסצנטית RFP.
- השתמש בגישה מינימלית להגדרות (MESA) כאשר הדמיה משעלת ביקוע בנקודות זמן מרובות. במילים אחרות, להימנע משימוש ממושך של אורכי גל עירור ולהעסיק את הכוח עירור הנמוך ביותר זמן חשיפה היוצרים מקובל, אך עדיין לכימות נתונים הדמיה.
- להדמיה ממושכת במהלך מיטוזיס או meiosis, להגביל את המרווח בין נקודות זמן הרכישה ל 5-10 דקות. למרות התחבושות 2% agarose יכול לעמוד 12 עד 16 הפעלות הדמיה, תא הסטה בשל אידוי agarose סביר. לכן, לבצע ניסויים מלאים או מיוזה מלאה ב 4-6 h או 8-10 h חלונות, בהתאמה.
- איסוף נתוני הדמיה עבור 4-8 h המורכב של לפחות 24-48 נקודות זמן הרכישה, בהתאמה, חלבון ניאון אחד, ו z-מחסנית לכל נקודת זמן וערוץ פלורסנט מורכב 13 סעיפים עם 0.5-μm מרווח באמצעות מטרה 60x. זה דורש לפחות 0.5-1 ג'יגה-בתים של שטח אחסון בכונן הקשיח. לפיכך, מלבד ביטול photobleaching לבנה והעברת התאים, צור זרימת עבודה שתתייחס ליכולות מיחשוב1,2,3.
הערה: פרמטרי רכישה אלה מוגדרים בדרך כלל ומשתנים בתוכנה השולטת בפונקציות מיקרוסקופ ואשר אוספת ומעבדת תמונות. - כדי לבחון תהליכים גרעיניים ספציפיים בפירוט הקרוב, לבצע רכישת תמונה כל 5-10 s, כל עוד הפליטה אינה ירידה משמעותית לאחר החשיפה התכופה. בצע ניתוח של עוצמת קרינה פלואורסצנטית ראשונית על פרקי זמן שונים כדי לקבוע את הנקודה שאחריה הדיוק של הנתונים שנאספו אינו אמין עוד1,3.
- בתוכנה לרכישת תמונות ועיבוד תמונה, השתמש בהטלה בעוצמה מרבית על התמונה z-ערימות כדי להתבונן בכל המבנים בעלי דחיסות פלואורסצנטית גבוהה במישור דו-ממדי ללא קשר למיקום האנכי שלהם1,2, 3. שלוש. זה מאפשר בדיקה מהירה של תהליכים גרעיניים המתרחשים voxels שונים. לאסוף תמונת השדה באמצע מוקד בהיר כדי ליצור תמונת התייחסות של התאים תחת התבוננות.
5. הדפוס הניתוח20,21
הערה: ניתוח תמונה בפרוטוקול זה מבוצע באמצעות פיג'י. לתוכניות ניתוח אחרות ולתוספים של פיג'י ראו טבלת חומרים.
- העלה תמונה לפירוק על ידי בחירת התכונה ביו-פורמטים היבואן תחת תפריט תוספים . בחלון הנפתח ' אפשרויות ייבוא ', בחרו ' היפר-מחסנית ', מצב צבע המהווה ברירת מחדלובדוק את קנה המידה האוטומטי לפני הלחיצה על ' לחצן אישור '.
- ודא שהחלון המוצג כולל את המספר הנכון של ערוצי הקרינה הפלואורסצנטית ואת מסגרות הזמן על-ידי גלילה הצידה על הסורגים המתאימים בתחתית. שמור כקובץ Tiff, שאינו מדחוס נתונים ומונע אובדן מידע.
- פתחו תמונה המכילה סרגל שינוי קנה מידה שנוצר במהלך עיבוד נתונים על-ידי תוכנת המיקרוסקופ. קבעו את אורך הפיקסל של סרגל הסרגל בעזרת הכלי קו ישר לציור קו מקביל בגודל דומה ובחרו ' מדידה ' מתפריט ' ניתוח '. הוסף סרגל סרגל משנה על-ידי הגדרת יחס התמונה לפיקסל-אל-μm באמצעות בחירה באפשרות ' קבע קנה מידה ' מתפריט ' ניתוח '.
- בחלון הנפתח ' קנה מידה ', הזן את המרחק המחושב בפיקסלים ומרחק ידוע ב-יקרומטר, קבע יחס גובה-רוחב של פיקסל ל-1.0, העבר את מיקרון כיחידת האורך ובדוק את התיבה הכללית לפני שתלחץ על ה אישור כפתור.
- השתמשו באפשרות ' קבע מדידות ' בתפריט ' ניתוח ' לבחירת פרמטרים שונים למדידה בשעת בחירת מדידה. למטרות פרוטוקול זה, בחר את המדדים הבאים: שטח, היקפי, ערך אפור ממוצע, חציון, ערך מזערי & max, דחיסות משולבת, מיקום מחסנית ותצוגה תווית.
- בהתאם לדיוק של הנתונים שנאספו, הזן יותר מ -1 עבור האפשרות מקומות עשרוניים ובדוק את תיבת הסימון המדעית במידת הצורך. לאחר החלת הפקודה מדידה , חלון מוקפץ של תוצאות יציג את הערכים עבור כל פרמטר רלוונטי. שמור את התוצאות כקובץ. csv לניתוח עתידי בתוכנית סטטיסטיקה.
הערה: אין צורך להפריד תמונה לתוך ערוצי הפלורסנט המרכיבים אותו לקביעת האורך, אלא אם כן יש הפרעה באותות בין הצבעים השונים, ובמקרה זה בצע את השלב המפורט להלן. - במקרה של הפרעה לאותות, בחרו ' כלי צבע וערוצים ' מתפריט ' תמונה ' ולאחר מכן לנתח כל צבע בנפרד. למדידת אורך המבנים שאינם ליניאריים, לחצו לחיצה ימנית על כלי הקו והשתמשו באפשרות ' קו מקוטע ' או ' קו חופשי ' כדי לעקוב אחר העצמים הרצויים.
- למבנים ליניאריים או לקביעת המרחק בין שתי נקודות, השתמשו בתכונה ' קו ישר ' ובחרו ' מדידה ' מהתפריט ' ניתוח '. ערכים עבור אורך ב-יקרומטר יתווספו באופן אוטומטי לפרמטרים שנבחרו בעבר תחת האפשרות ' קבע מדידות '.
- למדידת שינויים בגודל האות ובעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית, צור תחילה אזור מעניין (ROI) של ספריית הריבית, המגביר את דיוק הקוונפיקציה ומאפשר מדידות מהירה על-פני מחסנית תמונה. בחרו בכלי צבע וערוצים בתפריט ' תמונה '.
- בחלון המוקפץ של הערוצים, בדוק את ערוץ הצבעים שעבורו העוצמה או האזור יימדדו. בחרו בתכונות ' התאם ' ו'סף ' בתפריט ' תמונה '. בדוק את תיבת הרקע הכהה, בחר את שיטת ברירת המחדל (אלא אם כן נדרשת אחרת על-ידי הנתונים שנאספו), ובחר באפשרות אדום כדי להוסיף את אותות הריבית.
הערה: המדידה של יציבות החלבון, התנועה והלוקליזציה תלויים באופן הדוק בסף הצבע המשמש ליצירת ספריות ROI. חשוב לבחור את השיטה הנכונה סף עבור סוג האות סמן פלורסנט להיות דמיינו17,18. - השתמש בכלי שרביט כדי להדגיש כל מבנה של עניין ולחץ על האות T בלוח המקשים כדי להוסיף את ההחזר הנבחר לחלון המוקפץ של roi מנהל . חזור על תהליך זה עבור כל פרוסה (מסגרת זמן) במחסנית התמונות ואחסן את כל ה-ROIs על-ידי לחיצה על לחצן עוד ובחירה באפשרות שמור.
- פתח את תיקיית הroi המכווצת כדי לטעון את מנהל הroi ולחץ על כל מזהה ROI בלוח השמאלי. בחרו ' מדידה ' מתפריט ' ניתוח ' וחזרו על פקודה זו בכל מזהה ROI כדי לכמת את אובייקטי העניין בכל הפרוסות של מחסנית התמונה.
- אם העברת התאים אינה מהווה בעיה והמישור המוקד נשאר זהה עבור כל הפרוסות של המחסנית, לחץ על ריבוי מידות ב- ROI manager. בחלון המוקפץ, בחרו ' מדידה את כל הפרוסות במקום שורה אחת לפרוסה כדי לחזר מדידות במחסנית התמונה. שמור תוצאות כקובץ csv ונתח מדידות בתוכנית סטטיסטיקה.
- לקבלת מספר רב של אותות גרעיניים המרכיבים את מבנה העניין, הקש Shift תוך כדי בחירת אובייקטים באמצעות הכלי שרביט כדי ליצור ROI יחיד. לחילופין, צרו תשואה של גודל קבוע עם הכלי הסגלגל כדי להקיף את כל האותות המעניינים.
הערה: גישה אליפטית זו עשויה להיות נחוצה כדי למדוד ולתאר את התנהגות האות על פני אזור שבו האות הזריחה שינוי גודל ואינטנסיביות לאורך זמן. עוצמת האות, במקרה זה, היא צפיפות האותות הממוצע מעל אזור נתון. - קביעת איכות לוקליזציה של שני אותות פלורסנט לפי השינוי בצבע האזור החופף של האות. עם זאת, כאשר אזור ההתאמה לשפות שכונתיות מצמצם, קשה יותר להבחין בין חפיפת אותות. במקרה זה, בצע את השלבים המפורטים להלן.
- באמצעות הכלי ' ערוצים ', כמתואר בשלב 5.6, ציירו קו ישר מעל כל אות שמדובר, ובחרו בפקודה ' התווה פרופיל ' מתחת לתפריט ' ניתוח '.
- חזור על שלב זה עבור כל הצבעים הנמצאים בחשבון באמצעות אותה שורה מצוירת.
- בחלקה של חלון מוקפץ לדוגמה המופיע לאחר כל שלב של יצירת פרופיל, לחץ על לחצן הרשימה כדי לקרוא לחלון ' ערכי התוויה ', ושמור את המידות עבור כל אות כקובץ csv.
- בתוכנית סטטיסטיקה, צור גרף המבצע מתווה את הערך האפור עבור כל אות כנגד המיקום המתאים (ב-μm) לאורך הקו המצויר. חוסר חפיפה בין מגרשים של פרופיל אותות מעיד בדרך כלל על חוסר לוקליזציה משותפת.
הערה: השתמש בכלי פרופיל התוויה בתמונות מתוכננות כדי לבחון לוקליזציה של אותות. זה אמין רק אם חפיפה כגון זה נצפה גם דרך מחסנית z תמונה.
- כדי לפקח על התנהגות דינמית של חלבונים פלורסנט לאורך זמן להשתמש בכלי ריבוי Kymograph נמצא תחת תפריט ניתוח. התמונה המתקבלת מציגה את תנועת האותות הפלורסצנט באמצעות סדרה של תמונות מעובה בכל פרוסה של מחסנית z, המייצגת נקודות זמן בודדות.
- השתמש בכלי הערוצים כמתואר בשלב 5.6 כדי לבודד את אובייקט העניין בערוץ הנכון. ודא שהאובייקט או המבנה שנבחרו אינם מחליפים במידה ניכרת דרך מחסנית z. הצב קו ישר או מלבן מעל העצם, בחר בכלי מרובה הכלים Kymograph מהתפריט ' ניתוח ', והזן את הרוחב הרצוי של השורה על-ידי הנחת האובייקט.
- צרו לוחות תמונה המראה דינמיקה גרעינית על חלון זמן מסוים באמצעות הכלי ' ערוצים ', כפי שמתואר בשלב 5.6, ובחירה בכלי ' אוספים והפוך מונטאז ' מתפריט ' תמונה '. בחלון הנפתח ' הפוך מונטאז ', הזינו את מספר הטורים והשורות הרצויים, קבעו פקטור שינוי גודל של 1.0, בחרו בפרוסות ' ראשון ' ו'אחרון ' (מסגרות זמן) ושנה את רוחב הגבול ללפחות 5 לפני ההקשה על אישור. ניתן לבחור אילו תמונות במחסנית יופיעו על-ידי שינוי ההפרשים המתאימים לרצף הרצוי.
- כדי ליצור סרט, להעלות את hyperstack הרצוי , בחר שמור כקובץ Avi מתפריט קובץ , בחר ללא עבור דחיסה, והזן קצב מסגרת של 2-8 fps. בחרו בפקודה ' בצע מונטאז ' בשעת איסוף משולבת בכלי הערוצים כדי למזג או להפריד בין כל הצבעים המרכיבים את התמונה.
הערה: שני קבצי avi (סרט 1-2) מסופקים בפרוטוקול זה. השתמש בהם בפיג כדי לנסות תכונות שונות מודגשות בכל שלב 5. - כדי להציג תא מייצג יחיד, השתמש בהמרה וסובב מתפריט תמונה והזן את מדרגות הסיבוב. מספרים שליליים מסובבים אובייקטים שמאלה, בעוד שערכים חיוביים מסובבים אובייקטים ימינה. לאחר שהתא נמצא בכיוון הנכון, צייר מלבן המקיף את התא כולו דרך מחסנית z או במהלך מסגרות הזמן של הריבית ובחר חיתוך מתפריט תמונה . המשך כפי שהוזכר בשלב 5.16 ו 5.16.1 כדי ליצור פאנל תמונה או סרט.
- כדי ליצור סרט, להעלות את hyperstack הרצוי , בחר שמור כקובץ Avi מתפריט קובץ , בחר ללא עבור דחיסה, והזן קצב מסגרת של 2-8 fps. בחרו בפקודה ' בצע מונטאז ' בשעת איסוף משולבת בכלי הערוצים כדי למזג או להפריד בין כל הצבעים המרכיבים את התמונה.
- הוסיפו סרגל קנה מידה לחלונית התמונות או לסרט באמצעות בחירת סרגל ' כלים ' ו'קנה מידה ' מתפריט ' ניתוח '. בחלון הנפתח סרגל קנה מידה, הזן 5-15 עבור רוחב ב-מיקרון עבור תאים בודדים או 100-250 עבור שדות שלמים של תצוגה, בחר בלבן או בשחור עבור צבע ובחר מיקום מתאים כדי למקם את סרגל הסרגל.
- עבור סרטים, זה שימושי להראות התקדמות זמן במהלך אירועים גרעיניים. כדי להציג שינוי זמן בין מסגרות, בחר תמונה, לחץ על ערימות, השתמש בכלי הזמן מפר , ציין את מסגרת ההתחלה בסידרת הזמן, ובחר מיקום מתאים לתצוגת הזמן.
Representative Results
אם הדמיה של תא חי משמש עבור מיטוזה או meiosis, זה חיוני להעסיק תאים בריאים שמרים ביקוע לפני ביצוע כל סוג של התבוננות. איכות הנתונים הנובעים מתבססת במידה רבה על חומר ההתחלה. אם התאים גוועים ברעב עקב הגבלה מזינים או צמיחת יתר, הם יראו לוחללים עודפים וגודל תא ירד (רעב, איור 2A). לניסויים מיטוזיס, מומלץ להימנע משימוש בתאים הראו מתח הסלולר (רעב, איור 2A). אחרת, התוצאות הנסיוניות לא יהיו עקביות ומיושוות. כדי לעקוף מגבלה זו, בחר בקרות מסוג פראי ולהכיר את פנוטיפים השונים של המוטציות המעניינים. לדוגמה, תאים mitotic מורעבים ל -12 שעות לחדול באופן פעיל לשכפל DNA. מאז Tos4-gfp הביטוי משויך ל-G1/S-שלב פעילות22,23, תאים לוגרימיים הנושאים סמן זה ואחד עבור החטיבה הגרעינית (Sad1-dsred10) להראות הפאן-גרעיני Tos4-gfp ביטוי, Sad1-dsred וקדי הפרדה, ומתמשך המחיצה (מציע שכפול DNA פעיל חלוקת תאים) (יומן, איור 2A), בעוד תאים מורעבים לא להראות פעילות כזאת (רעב, איור 2a). תוצאה זו עקבית עם ההשפעות של הגבלת ההזנה בתוך שמרים ביקוע, אשר מפחיתה את תמלול ב-G1, מפעיל את המחסום G1/S מחזור התא, ומקדם G0 entry5. עבור ניסויים מיוזה, תאים חייבים לצמוח לצפיפות גבוהה, אבל בלי להגיע לשלב נייח. לאחר מכן, תאים של שני סוגי הזוג הם מעורבים, מודבטים יחד במדיה חנקן נמוך. כישלון להזדווג, כפי שקורה כאשר התאים אינם מורעבים במידה מספקת של חנקן, תמנע מהם להזין מיוזה (לא יעיל, איור 2b). מגביר את הפעילות של השעיית תא ההזדווגות מגבירה את האינטראקציה של תא אל התא ובכך מצביע על הזדווגות מוצלחת והשראה meiotic יעיל (יעיל, איור 2B).
כריות agarose ג'ל ושיבוש פיזי של גושי תאים להבטיח הדמיה נכונה של תאים בודדים או asci (יומן, איור 2a; יעיל, איור 2B). על הרפידות לספק פלטפורמה נוקשה, אך לחה על התאים הקבועים בו ומוגנים מפני התייבשות. בנוסף, הרפידות חייבות להיות עבות מספיק כדי לעמוד בשינויים עקב אידוי ולספק משטח מפולס המאפשר מיקוד מתאים לאורך כל רכישת תמונה (איור 1C). סיבוב כיסוי נדרש כדי להפריד ולפזר תאים בתוך אגרגטים ההזדווגות (איור 1F; יעיל, איור 2B). ללא צעד זה, כמה asci אבל תאים רבים פלואידי הם נצפו כי asci לכודים בתוך שכבות נגיש של הזדווגות, בעוד תאים פלואידי הם חופשיים לאכלס את כל הנקודות הזמינות מונאולייר (איור 2b). גם עבור ניסויים mitotic, כאשר התא החלקה הוא פחות בעייתי, סיבוב כיסוי מעביר תאים סביב הלוח כדי ליצור שכבת תא אחת עם מרווח מספיק בין התאים כדי להפחית את אפקטי הצפיפות ולאפשר שכפול תאים (יומן, איור 2A ).
Atb2 הוא רכיב α-טובולין מעורב בהפרדה כרומוזום ביקוע שמרים מיטוזיס ו מיוזה7,14. כאשר מתויג בעקשנות, רכיב זה שלד ציטוזה מאפשר לחקור את השלבים המאפיינות הפרדה גרעינית מיטוזיס. במהלך prophase (0 '-20 ', איור 3A), התגררות של ציר הmitotic מתרחשת בצד הגרעיני של הגופים מוט הציר (spbs), כפי שנחשף על ידי סיבים Atb2-mrfp להגדיר נגד HTT1-gfp5 פאן-הרקע הגרעיני. במהלך מעבר המטא-אנאפיום (20 '-40 ', איור 3A) הציר הmitotic משתרע החוצה והגרעין מתפצל לשניים. כאשר התא נכנס telophase (60 '-80 ', איור 3A), Atb2-mrfp מרחיב באופן מבחינה מבצעית עד הכרומוזומים מופרדים לחלוטין. לאחר נקודה זו, סיבים Atb2-mRFP לקבץ ולהתפשט על פני משטח התא כדי להחזיר את הטופס שלהם interphase בכל אחד מתאי הבת והתוצאה. ציטוקינזה (> 120 ', איור 3A) מתרחש רק לאחר טפסים ממחיצת המחיצה ומחלק את התא ביקוע. בעקבות שינויים בעוצמה Hht1-GFP מעל מחזור mitotic חושף שלושה שלבים חשובים בדינמיקה גרעינית: מטא-שלב-אנאפיום (בעוצמה בינונית, compaction: 20 '-40 ', איור 3A-B), telophase (עוצמה נמוכה, הפרדת דנ א: 60 '-80 ', איור 3A-B) ו-G1 (הגדלת עוצמה, שכפול DNA: 100 '-120 ', איור 3A-b). באופן דומה, אבל באמצעות תאים כי רק לשאת Hht1-mRFP והעסקת כלי רב-kymograph (ראה שלב 5.15) בפיג, אפשר לצפות mitotic החטיבה מתוך מטאמשלב כדי telophase ולהעריך את התנועות הגרעיניות המעורבים במהלך האחות כרומאטיד הנכון סגרגציה (רגילה, איור 3C). Mis-סגרגציה kymographs להראות פעילות האות בין שני הנתיבים הגרעיניים העיקריים, המציין בלתי הפרדה אפשרית עקב פיצול כרומוזום או הפרדה כרומואטיברה לא הולמת (בפיגור, איור 3C).
כפי שהוזכר קודם לכן, ב הנצה ו ביקוע שמרים, Tos4 מועתק ב-G1 ופונקציות במהלך שכפול ה-DNA ב שלב22,23. זה יכול להיות נצפתה על kymograph שבו Tos4-gfp הביטוי עולה בגרעין אחרי Sad1-dsred10 וקדי לעבור לכיוונים הפוכים (המציין חלוקה גרעינית), אבל לפני הטפסים המחיצה, אשר לפני ציטוקינזה (39 ', איור 3d ; 36 ', איור 3e). שלב Tos4-gfp גבוהה הפעילות מתחיל בסוף מעבר M-G1/S (45 ', איור 3e) ומסתיים ב G2 (> 60', איור 3e), מיד לאחר חלוקת התא. בעוד מאוד מתפזרת במהלך G1, Tos4-gfp עוצמת האות מגדילה את הפוסט אנאפא וברחבי S-שלב ושיתוף עם הפרדה Sad1-dsred וקדי (45 '-60 ', איור 3e). תוצאה זו מגלה את תקופת העליה של שמרים ביקוע כאשר שכפול הגנום החלה בתאי הבת (G1/S), אבל ציטוקינזה עדיין לא התרחשה.
Hht1 הוא היסטון H3 ב שמרים ביקוע והוא שונה בדרך כלל עם תגי פלורסנט להמחיש DNA גרעיני5,14. ב mitosis, כמו תאים מעבר ממטא שלב כדי telophase (20 '-120 ', איור 3A), שני שינויים להבדיל למסה גרעינית הם נצפו. השינוי הראשון כרוך כיווץ של גודל גרעיני במטא-פאזה (20 ', איור 3a), בעוד השני מראה פיצול גרעין במהלך אנאפיום (40 ', איור 3a). מלבד שיתוף שינויים אלה עם mitotic תאים, תאים meiotic מוצג תנודה גרעינית (כלומר, לעקוב אחר סוסים) (-100 ' to-50 ', איור 4A-B) במהלך שילוב הומוולוגי והפחתה נוספת של גודל הגרעין בסוף אנאפיום II (70 '-90 ', איור 4A). Hht1-mRFP משמש כדי לבחון הפנוטיפים שאינם הפרדה בהפרדה כגון בפיגור או כרומוזומים מפוצלים (בפיגור, איור 3C). הוא מועסק גם להתבונן ולתאר את הדינמיקה הגרעינית בכל אחד משלבי האיוזיס (איור 4A-B). מסה גרעינית היא גדולה ואינה נעה בגודל במהלך הרבה של המעקב אחר סוסים (HT:-100 ' to-50 ', איור 4A-B)). כאשר התאים נכנסים למטא-שלב (MT:-40 ' עד 0 ', איור 4A-B), גודל גרעיני וירידה בתנודות, בהתאם לפעילות העיבוי מוגברת בשלב זה. התחלתה של שני אנאפיום I (MI: 10 '-60 ', איור 4a-b) ו-II (mii: 70 '-90 ', איור 4a-b) משויך הפחתה גרעינית נוספת וחוסר תנועה גרעינית, אשר מתואם גם עם שתי חטיבות גרעיניות המאפיינות מיוזה I ו-II (MI & mii). כך, מיוזה קשורה תנודות בגודל הגרעיני כאשר כרומוזומים הומוולוגי ליישר ולשלב עם הפחתת גודל גרעיני בעקבות שני סיבובים של הפרדת כרומוזום. Alleles כי לשנות את הדינמיקה הגרעינית הם ככל הנראה קשורה לוויסות יציבות הגנום ב-מיוזה12,13.
Rec8 הוא α-לייזר ביחידת המשנה של cohesin meiotic ב שמרים ביקוע. הוא נטען על כרומטין לאחר שכפול ה-DNA (מיי-S) ושומר כרומאטידים האחות קשור זה לזה עד אנא"א II. לאחר מטאמשלב I, Rec8 מוסר מזרועות כרומוזום על ידי הופרדים והוא מוגן במרכז הריכוז על ידי Sgo1-PP2A. בתום ההפרדה הגזעית, Rec8 מסולקת גם במרכז הריכוז, ובכך מאפשר הפרדת האחות כרומאטיד (איור 5a)6,24. Rec8-GFP יחד עם סמנים של הפרדה של כרומוזום כגון Sad1-DsRed או Hht1-mRFP לאפשר ויזואליזציה של דינמיקה לכידות במהלך meiosis. Rec8-GFP האות הוא פאן גרעינית במהלך מיי-S (< <-90 ' , איור 5A-b), prophase i (-90 ' ל-50 ', איור 5a-b), ומטשלב i (-40 ' ל -0 ', איור 5a-b). התבוננות זו מגלה את ההתאגדות של Rec8-GFP לאורך צירי כרומוזומים העוקב אחר כפילות DNA. כאשר התאים להזין אנאפיום אני (10 ', איור 5A-B), עוצמה Rec8-gfp פוחתת ברחבי הגרעין אבל נשאר חזק ב צנטרומר, שם הוא יוצר מוקד כל מסה גרעינית (20 '-70 ', איור 5a-B). תוצאה זו היא עקבית עם Rec8-GFP השפלה לאורך הזרועות כרומוזום אבל לא במרכז הריכוז, כי מ, כי מ, כי מלאחר בידוד בהפרדה. לפני אנאפיום II, המוקד Rec8 נעלם, לשחרר את האחות כרומאטידים להפרדה mii (70 '-80', איור 5a-B). סמן Rec8-GFP הוא, ובכך, שימושי כדי לבחון את התנאים לשבש את הקמתה, הסרת, ואת היציבות הכוללת של הלכידות המיוטית. לזווג עם סמן של חטיבה גרעינית כגון Hht1-mrfp5,13, Rec8-gfp יכול להיות מועסק כדי לטפל בשאלות של איך הלכידות התזמון והיציבות לפני ובמהלך מיוזה להשפיע על הפרדה נאותה כרומוזום12 ,13. פרוטוקול זה אינו מטפל בחלבונים שהדינמיקה שלהם מתרחשת בעיקר בציטוזול. עם זאת, שולחן אני מראה כמה חלבונים ציטוסולונים המשמשים בדרך כלל כדי לבחון את השלד הציטומי ואת תהליכי הממברנה הנחוצים לאנדוקציטוזה, לאקסוציטוזה ולציטוקינזה בין תהליכים אחרים.
איור 1: הכנת רפידות הצמח לדימות תאים חיים. (א) הערכת הכנת שקופיות הורכבה באמצעות מחזיק תשר, קלטת מעבדה ומגלשות מיקרוסקופ. הצבת שקופיות בניצב זו לזו יוצרת כיס שבו מדפדפת הטפסים. תוספת של קטעי קלטת מעבדה בצדדים מתאימה את רוחב הלוח האגקם למפרט הנדרש. (ב) מותכת agarose הוא מאפשר להתקרר לפני הגדרתו על שקופיות מיקרוסקופ כדי ליצור רפידות. בשלב זה, יש צורך לוותר על אמצעי האחסון האגקם לאט כדי להימנע מיצירת בועות אוויר. (ג) השקופית העליונה מונחת על הנקודה מחודש ליצור משטח עגול עם משטח ישר, אפילו קצוות, ואין סדקים מתגלים לעין. (ד) לאחר הצבת מדגם של השעיית תא על כרית agarose, היפוך שקופית ומקום על גבי מגבת נייר ללא מוך כדי להסיר בינוני נוזלי נוסף. (E) המקום בזהירות coverslip על כרית agarose, וודא לא ללכוד כל בועות אוויר ובדיקה כי מטוס המוקד הוא שטוח כדי למנוע הסטה התאים ובעיות התמקדות. (ו) לאט ובזהירות, לסובב coverslip כיוון השעון כדי לשבש את הגושים התאים וליצור דופלקס תא המאפשר התרחבות התא והדמיית תא טוב יותר. (ז,ח) השתמש תערובת פחמימנים מחוממת כדי לאטום רפידות agarose ולאפשר להם להיות שולי לטמפרטורה הרצויה לפני הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בחירת התאים הנכונים. (A) לוחות העליון להראות תאים שמרים ביקוע שמאל להרעיב ב EMM פלוס תוספי עבור 72 h והפאנל התחתון מראה תאים העוברים צמיחה לוגריתמית. בתאים שנותרו לרעוב, תא קטן מורפולוגיות יכול להיות מוערך. החץ הפתוח האדום מראה גרגרי וולאר האופייניים לרעב. בתרבויות לוגריתמית, תאים המציגים מורפולוגיות מאורכים וספטטה (חץ אדום) בשפע, המצביעים על הדינמיקה הפעילה של אופניים. לוחות צד ימין להראות תאים המבטאים Tos4-GFP ו-Sad1-DsRed בזמן רעב והתפשטות. פאן-גרעיני Tos4-GFP ביטוי ו Sad1-DsRed אותות המשודרים לקטבים התא הנגדי נראים במהלך התפשטות פעילה, אבל לא ברעב. (ב) הלוח העליון מראה תאים של אותו סוג (h +) לא להזדווג ביעילות. החץ הפתוח האדום מראה זוג תאים מוחללים העוברים בקריומיה. זה לא יוצא דופן בתרבויות של h + תאים, שבו 10% של תאים יכולים להחליף סוג-mate ל h-. הפאנל התחתון מראה asci כתוצאה ההזדווגות יעילה. הזיפטיים asci לקחת טפסים מרובים כולל זיג זג (החץ האדום) ואת הצורות תא בננה (אדום פתוח חץ). סרגל בקנה מידה = 5 יקרומטר אורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: Mitotic הדינמיקה הגרעינית. (א) histone H3 (Hht1-gfp) ו מיקרוכדורית (Atb2-mrfp) חלבונים הופעלו במהלך מחזור אחד מיטוזה (120 דקות). אותות בודדים עבור Hht1-GFP ו-Atb2-mRFP מוצגים לוחות שחור ולבן, בעוד מיזוג BF מראה להם את הצבעים שלהם בהתאמה. (ב) כימות העוצמה Hht1-mGFP מעל מחזור mitotic. השינוי ברמות Hht1 מעיד על חלוקה גרעינית במהלך השכפול מיטוזיס ו-DNA ב-G1. (ג) kymographs מראה הפרדה נורמלית או חריגים ב מיטוזה שבו הנתיבים הגרעיניים שהתקבל או bifurcate ולשמור על תקינות ה-DNA או לסטות ולקדם את הפיצול כרומוזום או הפרדה מוקדמת כרומטידה, בהתאמה. (ד,ה) Kymograph ופאנלים מיקרוגרפים המציגים את משך M-to-G1/S שנחשף על ידי ההפרדה של Sad1-DsRed והמראה של אותות גרעיניים Tos4-GFP. הערה לוחות הביניים ב- E אשר נוצרו באמצעות אש Lut בפיג כדי ליצור מפה תרמית עוצמה בוגרת המאפשרת זיהוי של נקודות עם ביטוי TOS4-gfp גבוהה; במקרה זה, מקומי לגרעין וחופפים Sad1-DsRed אותות, כצפוי. סרגל בקנה מידה = 5 יקרומטר אורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דינמיקה גרעינית מיוטית. (א) סדרת הפאנל המציגה תנועה, דחיסה וחלוקת הגרעין (Hht1-mrfp) במהלך מיוזיס. לעקוב אחר סוסים (HT) מראה מקיף תנודות גרעיניות מצד לצד על ידי מטאמפאזה (MT), שם התנועה הצדדית הגרעינית יורדת לחלוטין נעצר ממש לפני אנאפיום I. ב מיוזה אני (MI), המסה הגרעינית העיקרי מתפצל לשניים, ואילו ב מיוזה II (mii) ארבעה גרעינים מופקים במהלך תהליך של הפרדת האחות כרומטידה. (ב) כימות של שינוי באזור הגרעיני (Hht1-mrfp) ב prophase, מטא-שלב, MI & mii. האזור הגרעיני הוא דינמי במהלך תנודות HT, הופך צפוף MT, ועוד פוחתת בגודל במהלך במהלך MI & MII, שם התנועה הגרעינית הקטנה נצפתה (הציר הגרעיני ארוך). מדידת הציר הגרעיני הארוך ביותר (ציר גרעיני ארוך) מבוססת על הרעיון כי כמעגל נמתח, זה מפסיק יש קוטר קבוע ויוצר לפחות שני צירים עיקריים: ארוך וקצר. כך, כאשר ניטור שינויים בגרעין, שינויים בציר ארוך או קצר לספק סימנים של תנועה גרעינית. סרגל בקנה מידה = 5 יקרומטר אורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: cohesin דינמיקה מיוטית. (A) סדרת פאנל מראה כיצד שינוי אות REC8-gfp תואם עם דינמיקה גרעינית מיוטית. במהלך HT ו MT, האות Rec8-GFP הוא התנועה הגרעינית הפאן והעוקב אחר התנועות הגרעיניות (Hht1-mFRP). ב-MI, Rec8-GFP מתמוסס מתוך הגרעין, משאיר רק זוג foci, אשר עקבית עם Rec8 ההסרה מזרועות כרומוזום והקמתה של Sgo1-PP2A הגנה על הצנטרומר. כמו התא גישות mii, Rec8-gfp וקדי להתחיל להיעלם ואינם נראים עוד לפני אנאפיום II. (ב) קוונפיקציה של עוצמה REC8-gfp מ-HT ל-mii. בדומה למה שנראה ב , האות gfp הוא גבוה באמצעות HT ו MT, פוחתת משמעותית במהלך MI ו לחלוטין להיעלם ב mii. דפוס זה מאשר את cohesin dynamics בזרועות כרומוזום ואת צנטרומר, שם הוא שומר כרומאטידים האחות קשורה עד מוכן להיות מופרדים MII. סרגל בקנה מידה = 5 יקרומטר אורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| חלבון | פונקציה | ערות | תג | פניות | ||
| Hht1 | היסטון H3 מעורב באריזת דנ א | משמש לבדיקת דינמיקת כרומוזום | Hht1-mRFP | 5, 14 | ||
| Tos4 | Tos4 פונקציה מתרחשת במהלך שלב G1 | מועסקים כדי ללמוד G1 עיתוי | Tos4-GFP | 22, 23 | ||
| Rad21/ Rec8 | Cohesin יחידות משנה לשמירת האחות כרומטידים ביחד בעקבות השכפול | משמש לניתוח יציבות לכידות במהלך mitotic (Rad21) והפרדה מיוטית (Rec8) | Rad21-GFP/Rec8-GFP | 5, 24 | ||
| Rad11 | פעילות RPA מתרחשת במהלך תיקון ה-DNA mitotic, שילוב מחדש, ומסתיים במטא-פאזה | מועסק כדי ללמוד תיקון DNA ב מיטוזה ו שילוב מחדש דינמיקה מיוזיס | Rad11-YFP | 5, 13 | ||
| Rad52 | Rad52 acivity מתרחש במהלך mitotic תיקון DNA ו meiotic שילוב מחדש | מועסק כדי ללמוד תיקון DNA ב מיטוזה ו שילוב מחדש דינמיקה מיוזיס | Rad52-CFP | 5, 13 | ||
| Cnp1 | Histone H3 CENP-A מושמעות במיוחד ב צנטרומר | משמש כדי לעקוב אחר הדינמיקה ההפרדה בכרומוזום מיטוזיס ו מיוזה | Cnp1-מדובדבן | 13 | ||
| Swi6 | חלבון HP1 הומולוג מעורב במערך הטרוכרומטין | המועסקים לחקור הטרוכרומטין הגיוס במרכז הריכוז והטלמרים | Swi6-GFP | 13 | ||
| Sad1 | Sad1 מעורב באיתור גוף הציר מהמעטפת הגרעינית | מועסק כדי לנתח הפרדה בכרומוזום מיטוזיס ו מיוזה | Sad1-מדובדבן | 10 | ||
| ציטוזול & ממברנה | ||||||
| Atb2 | טובולין אלפא 2 מעורב בארגון שלד מיקרוציטוני | משמש לבדיקת הפרדה של כרומוזום במיוזיס ומיוזיס | Atb2-mRFP | 7, 14 | ||
| Ync13 | מווסת אקסוציטוזה ואנדוקציטוזה המעורבים בהעברת שלפוחית-בתיווך | מועסק ללמוד שלמות הקיר התא במהלך ציטוקינזה | Ync13-מאיפרין | 25 | ||
| Rlc1 | יחידת המשנה רירן II מעורב בהתכווצות הטבעת הקונאקטולה | משמש לחקור את הדינמיקה של ההבשלה והתכווצות המחיצה | RIc1-מדובדבן | 25 | ||
| Ccr1 | NADPH-ציטוכרום p450 רדוקטאז כי הוא חלק הקרום החיצוני, פלזמה, ו מיטורונו הממברנה החיצונית | מועסק כדי לבחון דינמיקה הקשורה לממברנה, כגון אנדוקציטוזה, אקסוציטוזה וציטוקינזה | Ccr1N-GFP | מיכל 5 | ||
| Gef1 | Rho guanyl-החלפת גורם מעורב בהקמת ואחזקה של קוטביות התא | משמש לבדיקת דינמיקת התאים העולמיים התלויים במיקרו-כדורית | Gef1-מדובדבן-GBP | 26 | ||
| Fus1 | Formin מעורב היתוך אקטין מיקוד הרכבה במהלך ציטומיה | משמש לחקר דינמיקת היתוך הקשורים ההזדווגות שמרים ביקוע | Fus1-sfGFP | 27 | ||
| Mnn9 | מmannolsyltransferase מעורב בגליקוציה מקושרת חלבון במערכת גולג'י | מועסק ללמוד התבגרות מטענים Golgi כפי שהיא מתקדמת מ- cis-golgi כדי טרנס-golgi | Mnn9-מדובדבן | 28 | ||
| Num1 | הרכב מעורב במעקב אחר סוסים | משמש כדי לבחון המיטוסטיים התלויים לעיגון במהלך תנודה גרעינית בפרופטיק prophase I | Num1-yEGFP | 29 | ||
טבלה 1: סמנים של דינמיקה גרעינית ו ציטוסולידי.
סרט 1: M-to-G1/S מעבר המראה גוף הציר (SPB; Sad1-DsRed) הפרדת המחיצה הקודמת וההצטברות של האות הגרעינית Tos4-GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
סרט 2: השלמת המחזור הmitotic המציג את השלוחה המיקרוטודורית (Atb2-mRFP) הקשורה לחטיבה גרעינית (Hht1-gfp). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Discussion
הדמיה של תא חי במהלך מיטוזיס ו מיוזה מציעה את ההזדמנות לבחון את הדינמיקה הגרעינית מבלי לשבש באופן משמעותי את הפיזיולוגיה שמרים במהלך רכישת נתונים. עם זאת, יש לתרגל זהירות כדי להבטיח שהתאים יגדלו לצפיפויות הרצויות ללא מתחים סביבתיים; ועבור meiosis, כי התאים הם התמונה במהלך הזמן של בידול מסוף ולא מוקדם מדי או מאוחר. עודף הצפיפות התאית, הרעב וטמפרטורות הגדילה הבלתי הולמות הן גורמים נפוצים התורמים לתצפיות מיותרות. בנוסף, במהלך בניית הזנים, חשוב לבדוק כי תגי פלורסנט לא להפריע פונקציות של גנים היעד או השפעה כללית תא כללי. כישלון לבדוק באופן מקרוב את פנוטיפים של זנים הנושאים סמנים פלורסנט עלול לגרום לתוצאות לא עקבית ושאין שונים על פני גנוסוגים דומים.
למרות שרפידות מיקרוסקופ פשוטות להרכבה, הם יכולים גם להציב משוכה בהשגת נתונים הדמיה יקרי ערך. יצירת רפידות מעלה היא פשוטה כמו הצבת שלושה שקופיות מיקרוסקופ במקביל זה לזה, לחלק את הצמח מותכת בשקופית האמצעית, ולשים שקופית כי העברת החלק העליון של השקופיות האחרות. זה שימושי, עם זאת, כדי להרכיב מנגנון יצרנית שקופיות המאפשר שינויים ברוחב כדי לייצר משטחים עמידים, ספציפי למצב הצמח. מכין שקופיות פשוט שנותן גמישות רוחב pad מורכב מפלטפורמה (מחזיק טיפים או ספסל), שתי שקופיות מיקרוסקופ, קלטת מעבדה מתנהג כמו מנגנון התאמת רוחב כרית (איור 1A). עובי מקלדת מדויקת יהיה תלוי בדרישות זמן הדמיה, agarose המותג, טמפרטורה, איטום כיסוי, שיעור אידוי, וכו '. לכן, חשוב לכייל את מערכת ההדמיה לפני רכישת נתונים כדי להגביר את המידע הטכני ולשפר את האיכות של הדמיית התאים החיים1,2,3. משטח המשטח, קשיחות, וקומפוזיציה חיוניים במהלך רכישת תמונה ממושכת. Agarose יש זריחה ברקע נמוך, ניתן ליצוק בקלות, ועל הריכוז המתאים, עם עומד דפורמציה מבנית עקב אידוי. יתר על כן, שילוב מדיה שמרים ביקוע עם agarose אינו מתפשר על איכות התמונה ומאפשר התבוננות מורחבת של מעגלים מרובים ומחזורי מיוזה. כמו כן, חשוב להימנע כל בועות אוויר עבור מיקרוסקופ זמן לשגות. בתוך ובתוך המדגם, כיסי אוויר להתרחב לאורך זמן, גורם העברת תאים ושיבוש מטוסי מוקד. התאים בתנאי מפוזרים ביעילות בנפרד על ידי סיבוב coverslip, החוקרים יכולים לעקוב אחר תהליכים mitotic על פני מספר דורות ואירועים meiotic מן היתוך גרעיני לספורציות. ביצוע ובחירת הלוח הנכון עבור ניסויים הדמיה לוקח זמן מאסטר, אבל פעם השיגה, יכול לתרום לתצפיות מיקרוסקופ אינפורמטיבי מאוד.
כמו המקרה עם שיטות אחרות, מיקרוסקופ תא חי אינו חופשי של מגבלות טכניות. השימוש בחלבונים מתויגים fluorescently מציג גבולות לניסויים המגבילים את היקף מה ניתן ללמוד. צילום-הלבנת ורעילות לתמונות הן בעיות האופייניות לרכישת תמונה ממושכת. ניתן לפעול מנגד על-ידי חוסר חשיפת תאים לאורכי גל קצרים במשך זמן ארוך מדי או לעתים תכופות מדי. עבור ניסויים מעורבים GFP, CFP, YFP, mRFP, ו-DsRed, חלבונים הניאון אופייני המשמשים שמרים ביקוע לחיות הדמיה, זה נפוץ להעסיק 5-15% עירור אור ו 100-500 ms זמן חשיפה עבור ניסויים שגרתיים. פרמטרים אלה משתנים, לעומת זאת, בהתאם לדרישות הניסוי הספציפיות של החוקר. בנוסף, z-ערימות מורכב של 9-13 סעיפים עם 0.5 יקרומטר מרווח באמצעות מטרה 60x הוא מספיק כדי לפתור את העובי של תא שמרים ביקוע. יתר על כן, חשוב לאשר כי סמנים פלורסנט לא לשבש תקנה נכונה או תפקוד של חלבונים היעד או ליצור פנוטיפים מזויף. לכן, מומלץ לבנות זנים המכילים פלורסנט שונים ותגי אהדה עבור אותו גן יעד כדי לאמת את התצפיות באמצעים שונים. יתר על כן, היא האחריות של החוקרים כדי להבטיח כי פרמטרים ניסיוניים ניתן לשכפל על פני ניסויים וכי הנתונים שנאספו מתאימים ניתוח במטה1,3. טכנולוגיה לא יכול להחליף את התרגול נבדק בזמן של אימות בקפדנות מערכות ניסיוני על ידי התבוננות זהירה ובדיקה קפדנית של יניאריות בזיהוי אותות פלורסנט.
לבסוף, חשוב לנתח נתונים מיקרוסקופית בפורמטים שאינם משנים תמונות raw. פיג'י מספק כלי תיעוד מצוינים למעקב אחר מדידות נתונים גולמיים ומאפשר לחוקרים לבחון פרמטרים שונים של תאים בהפעלה אחת. תכונות אלה, כמו גם העושר שלה של הדרכות מקוונות וכיסוי ספרות נרחבת, להפוך את פיג'י כלי חשוב למדידת, ניתוח, והצגת הדמיה של תא חי נתונים המתארים את הדינמיקה הגרעינית של שמרים ביקוע ב מיטוזיס ו meiosis.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות נטליה לה פורקייד ו-Mon LaFerte להכנת כתב יד זה מהנה יותר מאמץ. תודות לחברי מעבדת פורסבורג שתרמו להשלמת העבודה עם התובנה שלהם, התנסות ברעיונות ותמיכה מוסרית. פרויקט זה נתמך על ידי כR35 GM118109 ל-SLF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
- Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).
- Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
- Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
- Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
- Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
- Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
- Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
- Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
- Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
- Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
- Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
- Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).
- Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
- Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
- Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).
- Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
- Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
- Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).
