Summary
Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.
Abstract
L'imaging a cellule vive è una tecnica di microscopia utilizzata per esaminare la dinamica delle cellule e delle proteine nelle cellule viventi. Questo metodo di imaging non è tossico, generalmente non interferisce con la fisiologia cellulare e richiede una maneggevolezza sperimentale minima. I bassi livelli di interferenza tecnica consentono ai ricercatori di studiare le cellule attraverso più cicli di mitosi e di osservare la meiosi dall'inizio alla fine. Utilizzando tag fluorescenti come Green Fluorescent Protein (GFP) e Red Fluorescent Protein (RFP), i ricercatori possono analizzare diversi fattori le cui funzioni sono importanti per processi come la trascrizione, la replicazione del DNA, la coesione e la segregazione. Accoppiato con l'analisi dei dati utilizzando Fiji (una versione gratuita e ottimizzata ImageJ), l'imaging a celle vive offre vari modi per valutare il movimento delle proteine, la localizzazione, la stabilità e la tempistica, così come le dinamiche nucleari e la segregazione cromosomica. Tuttavia, come nel caso di altri metodi di microscopia, l'imaging a cellule vive è limitato dalle proprietà intrinseche della luce, che mettono un limite alla potenza di risoluzione ad alti ingrandimenti, ed è anche sensibile al fotosbiancamento o alla fototossicità ad alta lunghezza d'onda Frequenze. Tuttavia, con una certa cura, gli investigatori possono aggirare queste limitazioni fisiche scegliendo attentamente le giuste condizioni, ceppi e marcatori fluorescenti per consentire l'adeguata visualizzazione di eventi mitotici e meiotici.
Introduction
La microscopia a cellule vive consente ai ricercatori di esaminare le dinamiche nucleari senza uccidere le cellule di lievito di fissione ed elimina la necessità di fissativi e macchie letali. È possibile osservare la stabilità, il movimento, la localizzazione e la tempistica delle proteine fluorescenti che sono coinvolte in eventi importanti come la replicazione cromosomica, la ricombinazione e la segregazione, oltre alla membrana e al citoscheletro Movimenti. Mantenendo la vitalità cellulare e il rilevamento del segnale non tossico, c'è un'intrusione fisiologica minima. Se eseguito correttamente, questo metodo di microscopia può ridurre gli effetti di confusione che derivano dalla manipolazione tecnica estesa o dalla reattività chimica spuria. Inoltre, durante un esperimento, i ricercatori possono effettuare osservazioni pertinenti degli stati nutrizionali e di stress del lievito di fissione, dell'efficienza proliferare e dello stato apoptotico che indicano parametri di imaging inappropriati o fisiologia cellulare anomala1 ,2,3.
La mitosi e la meiosi sono caratterizzate dalla divisione nucleare e cellulare. Nella meiosi, contrariamente alla mitosi, il contenuto genetico è dimezzato in quanto le cellule dei genitori danno origine alle cellule figlie4. Poiché l'imaging a celle vive fornisce una dimensione temporale oltre alla relazione spaziale, un gran numero di cellule può essere esaminato in tempo reale. La microscopia a cellule vive ha permesso ai ricercatori di esaminare le dinamiche della divisione nucleare utilizzando tag fluorescenti per itoni5, sottounità coesina6, microtubuli7, centrimeri8, kinetochores9, componenti di il corpo del palo del mandrino (SPB)10,e quelli del complesso passeggeri cromosomico (CPC)11. Al di fuori dell'apparato di segregazione cromosomico, l'imaging delle cellule vive ha catturato anche il comportamento delle proteine necessarie, ma non direttamente coinvolto nella segregazione cromosomica. La funzione di queste proteine ha dimostrato di influenzare la replicazione, la ricombinazione cromosomica, il movimento nucleare e l'attaccamento cromosomico ai microtubuli12,13,14. Queste osservazioni hanno contribuito a una migliore comprensione degli eventi cellulari i cui componenti funzionali non erano suscettibili all'esame biochimico o genetico. Con i nuovi progressi nella tecnologia della microscopia, limitazioni come scarsa risoluzione, fotosbiancamento, fototossicità e stabilità di messa a fuoco diminuiranno, facilitando così migliori osservazioni in tempo reale delle dinamiche nucleari mitotiche e meiotiche1, 2,3. La meiosi è particolarmente impegnativa in quanto è un percorso di differenziazione terminale che richiede una stretta attenzione ai tempi.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di presentare un metodo relativamente semplice per esaminare le dinamiche nucleari del lievito di fissione in tempo reale nella mitosi e nella meiosi. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario utilizzare cellule che non sono state esposte allo stress ambientale, preparare pastiglie di agarose in grado di resistere a immagini prolungate e montare le cellule a densità che facilitano la visualizzazione delle dinamiche a singola cellula. Inoltre, questo protocollo si avvale di cellule che trasportano proteine fluorescenti etichettate che fungono da indicatori utili per la cinetica nucleare (Hht1-mRFp o Hht1-GFP), la segregazione cromosomica (Sad1-DsRed), la dinamica del citoscheletro (Atb2-mRFP), l'attivazione in G1/S (Tos4-GFP) e la stabilità della coesione nella meiosi (Rec8-GFP). Questo metodo introduce anche ulteriori marcatori nucleari e citosolici (Tabella I) che possono essere utilizzati in diverse combinazioni per affrontare domande su processi cellulari specifici. Inoltre, strumenti di base Fiji sono presenti per aiutare i ricercatori a elaborare immagini di cellule vive e analizzare diversi tipi di dati. La forza di questo approccio deriva dall'uso di osservazioni in tempo reale di dinamica proteica, tempistica e stabilità per descrivere processi che sono parte integrante per la corretta esecuzione della mitosi e della meiosi.
Protocol
1. Preparazione dei supporti15,16
- Soluzioni stock
- Preparare una soluzione di scorta di sale 50x aggiungendo 52,5 g di MgCl2- 6H20, 0,735 g di CaCl2x 2H20, 50 g di KCl e 2 g di Na2S04 in una bottiglia contenente 1 L di acqua distillata. Mescolare accuratamente la soluzione e sterilizzare per filtrazione. Collocare a 4 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
- Fare una soluzione di 1.000x vitamina mescolando 1 g di acido pantotenico, 10 g di acido nicotinico, 10 g di inositolo, e 10 mg di biotina in una bottiglia contenente 1 L di acqua distillata. Mescolare bene la soluzione e sterilizzare per filtrazione. Mantenere a 4 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
- Preparare una soluzione di 10.000x di brodo minerale aggiungendo 5 g di acido borico, 4 g di MnSO4, 4 g di .nSO4- 7H2O, 2 g di FeCl2- 6H2O, 1 g di KI, 0,4 g di acido molalicedico, 0,4 g di CuSO4- 5H20 , e 10 g di acido citrico in una bottiglia contenente 1 L di acqua distillata. Mescolare accuratamente la soluzione e sterilizzare per filtrazione. Collocare a 4 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
- Realizzare singole soluzioni di riserva di nutrienti aggiungendo 7,5 g di adenina, leucina, istidina o lisina in una bottiglia contenente 1 L di acqua distillata. Utilizzare solo 3,75 g per creare la soluzione uracil. Sterilizzare le soluzioni automatizzando l'autoclaving.
NOT: Nel corso del tempo, l'uraccil precipita fuori soluzione. Per portare di nuovo in soluzione, riscaldare nel forno a microonde al 60% di potenza in incrementi di 10 s o mettere in un bagno d'acqua 55 gradi per 20 min. Swirl la soluzione calda fino a quando tutti i grumi uracil scompaiono.
- Estratto di lievito più integratori (YES)
- In un flacone 2 L, aggiungere 1 L di acqua distillata, 5 g di base estratto di lievito, 30 g di glucosio, e 225 mg ciascuno di adenina, uracil, L-istidino, L-leucina, e L-lysina. Aggiungere 20 g di agar per rendere il mezzo solido.
- Utilizzare una barra di agitazione magnetica per sciogliere completamente gli ingredienti nella soluzione. Agar si scioglierà dopo che il mezzo viene sterilizzato dall'autoclaving.
NOT: Per comodità, è disponibile in commercio anche la polvere YES pronta all'uso.
- Edinburgh minimo medio (EMM) e mezzo glutammato pombe (PMG)
- In un pallone da 2 L, unire 1 L di acqua distillata con 3 g di ftalato di idrogeno di potassio, 2,2 g di Na2HPO4, 5 g di NH4Cl, 20 g di glucosio, 20 mL di soluzione di brodo di sale, 1 mL di soluzione di vitamina stock e 0,1 mL di soluzione di scorte minerali. Sostituire NH4Cl con 2,2 g di sale monosodico dell'acido L-glutamico per preparare la PMG. Per rendere il mezzo solido, aggiungere 20 g di agar.
- Utilizzando una barra di stiring magnetico, sciogliere accuratamente gli ingredienti. Agar si scioglierà dopo che il mezzo viene sterilizzato dall'autoclaving. Prima dell'uso, aggiungere le soluzioni di brodo di nutrienti, se necessario. Per ogni 1 L di media, aggiungere 15 mL ciascuno di adenina, leucina, istidina, e lisina. Utilizzare 30 mL per uracil, dal momento che è meno concentrato rispetto alle altre soluzioni nutritive.
NOT: Per comodità, sono disponibili in commercio anche polveri EMM e PMG pronte all'uso.
- Estratto di malto (ME)
- Utilizzare un pallone da 2 L per mescolare 1 L di acqua distillata con 30 g di estratto di malto e 225 mg ciascuno di adenina, uracil, istidina e leucina. Regolare il pH a 5,5. Includere 20 g di agar per rendere il mezzo solido.
- Sciogliere i componenti nella soluzione utilizzando una barra di agitazione magnetica. Agar si scioglierà dopo che il mezzo viene sterilizzato dall'autoclaving.
- Sporulation agar con integratori (SPAS)
- In un pallone da 2 L aggiungere 1 L di acqua distillata, 10 g di glucosio, 1 g di KH2PO4, 1 mL di vitamina, 45 mg ciascuno di adenina, uracil, istidina, leucina e lisina idrocloruro. Aggiungere 20 g di agar per rendere il mezzo solido.
- Utilizzare una barra di agitazione magnetica per combinare accuratamente gli ingredienti. Agar si scioglierà dopo che il mezzo viene sterilizzato dall'autoclaving.
2. Fissione Lievito Cultura15,16
- Utilizzare SI mezzo solido per svegliare ceppi di lievito di fissione dalla conservazione criogenica. A seconda dei requisiti di temperatura di ogni ceppo, incubare a 25 o 32 gradi centigradi per 3-5 giorni.
- Quando le colonie sono visibili, preparare una coltura liquida di avviamento. Raccogliere le cellule delle singole colonie e inocularle in provette contenenti un mezzo liquido 3 mL YES. Crescere alla temperatura appropriata fino alla fase intermedia o tardiva.
NOT: Per una corretta aerazione, utilizzare tubi o flaconi con volumi almeno 5 volte superiori al volume di coltura liquida previsto. Velocità di agitazione tra 150-220 rpm sono consuetudine per la crescita di routine della cultura. - Distribuisci 250-500 -L di coltura di avviamento in un flacone da 50 mL contenente 9,5-9,75 mL di YES, EMM o PMG più integratori appropriati. Consentire alle cellule di crescere alla densità desiderata e controllare al microscopio la corretta morfologia cellulare e lo stato nutrizionale.
NOT: Per conservare le varietà risvegliate fino a un mese, sigillare le piastre SI con nastro adesivo e posizionare a 4 gradi centigradi.
3. Preparazione del campione2
- Configurazione del vetrino del microscopio
- Aggiungere 2 g di agarose in un becher da 500 mL contenente 100 mL di integratori minimi più (mitosi) o SPAS liquidi (meiosi). Riscaldare la soluzione di agarose in un forno a microonde al 60% di potenza in incrementi di 10 s o mettere in un bagno d'acqua 55 C per 10 min. Swirl la soluzione per garantire una fusione efficiente. Preparare la configurazione della creazione di diapositive agarose (Figura 1A) per garantire la preparazione rapida del pad e impedire che l'agarose fuso si solidifica prematuramente.
- Lasciare raffreddare l'agarose fuso per 1 min a temperatura ambiente e erogare 50-100 macchie su vetrini al microscopio utilizzando punte di pipetta wide-bore. Prima che l'agarose si raffreddi, posizionare un vetrino al microscopio sulla parte superiore per generare un pad di circa 1,5-2 cm di diametro (Figura 1B-C). La larghezza del pad agarose è in genere proporzionale alla lunghezza del tempo di imaging. In altre parole, le pastiglie più spesse rallosupportano periodi di imaging più lunghi.
- Utilizzare una miscela di idrocarburi come sigillante per garantire una corretta copertura dei vetrini con cuscinetti agarose spessi e per evitare che la morte cellulare si esibisca dall'esposizione dei solventi ai bordi degli appigli. Mescolare parti uguali (w/w) di gelatina di petrolio, lanolina e paraffina in un becher da 500 mL. Riscaldare gli ingredienti su un piatto caldo a 120 gradi centigradi per 5 minuti. Quando i componenti si fondono, ruotare con attenzione la soluzione fusa per garantire un'adeguata miscelazione.
- Configurazione di esempio
- Per l'esame di eventi mitotici, far crescere le cellule dalle colture di avviamento in eMM liquido o PMG più integratori a circa metà fase di log (OD595 di 0.4). Centrifuga 1 mL della sospensione cellulare a 1.375 x g per 1 min, rimuovere il supernatante e respendere il pellet cellulare nel mezzo minimo più integratori ad un volume finale di 100 .
- Per immagini di eventi meiotici, far crescere le cellule dalle colture di avviamento nel mezzo minimo più supplementi alla fase di fine log (OD595 di 0.7-1.0). Combinare gli stessi volumi di celle opposte di tipo mate (h- e h)in una sospensione di celle da 1 mL. Centrifuga cellule a 1.375 x g per 1 min e risospendere il pellet in ME liquido. Ripetere questo passaggio tre volte per garantire una rimozione efficiente dei nutrienti.
- Dopo l'ultimo lavaggio ME, risospendere le celle in 1 mL di ME e aggiungerlo a un pallone da 50 mL contenente 9 mL ME. Incubare per 12-16 h a 22-25 gradi centigradi con una velocità di rotazione minima (50-100 giri/min). Abbondante flocculazione cellulare, che si traduce in molti grumi di lievito di fissione rotondi e indica accoppiamento efficiente.
- Prendi 1 mL di campione della coltura dell'accoppiamento e centrifuga a 1.375 x g per 1 min. Elimina il sovrentrato ma lascia 250 l nel tubo per risospendere le cellule. Prima di posizionare le cellule su pastiglie di agarose, vortice vigorosamente per 5 s per interrompere i grumi.
NOT: I restanti 250 ME utilizzati per risospendere le cellule contengono fattori di accoppiamento che aiutano le cellule a entrare nella meiosi. - Posizionare 20 l di una sospensione cellulare mitotica o meiotica su un pad agarose del 2%. Rimuovere qualsiasi mezzo in eccesso invertendo la diapositiva e mettendolo sulla parte superiore di un tovagliolo di carta senza lamino per 2-3 s (Figura 1D). Impostare il pad di scorrimento verso l'alto e posizionare delicatamente un coperchio di vetro, assicurandosi di non generare bolle d'aria (Figura 1F).
NOT: Eliminare il mezzo in eccesso con un tovagliolo di carta è più efficiente in termini di tempo rispetto all'assorbimento di gravità, che è particolarmente critico negli esperimenti di meiosi. - Per creare un molayer di cellule, ruotare il coverslip in senso orario con il dito indice per uno (mitosi) o due (meiosi) giri completi (Figura 1F). Assicurarsi che la materia cellulare si disperda attraverso il pad agarose consentendo una migliore separazione delle singole cellule o asci. Con l'aiuto di un piccolo bastone di legno, erogare sigillante fuso lungo i bordi del coperchio per sigillare ogni cuscinetto di agarose (Figura 1G).
- Una volta sigillato il cuscinetto di agarose, posizionarlo sullo stadio del microscopio e lasciarlo equilivitare per 10-15 minuti nelle condizioni di imaging appropriate (ad esempio, temperatura) (Figura 1H) per consentire alle bolle d'aria di dissipare e lasciare che si verifichino eventuali turni di agarose dell'ultimo minuto. Iniziare l'imaging una volta che la diapositiva è equilibrata in modo efficiente e non rimuoverla dallo stage fino al termine della raccolta dei dati.
NOT: Il controllo della temperatura e dell'umidità è determinato dal sistema al microscopio impiegato e dai requisiti sperimentali specifici. Se presente, applicare il controllo della temperatura e dell'umidità a tutti gli esperimenti di imaging. Se assenti, i ricercatori devono escogitare un modo per prevenire le fluttuazioni di temperatura, soprattutto durante gli esperimenti di meiosi.
4. Imaging2 e lavorazione a celle vive
- Utilizzare l'obiettivo 40x per trovare campi di visualizzazione appropriati per l'immagine. Passare all'obiettivo 60x per iniziare l'acquisizione dei dati. A seconda del sistema al microscopio utilizzato, la successiva messa a fuoco e sezionamento sul campione in ogni momento si verificherà manualmente o attraverso un processo automatizzato al microscopio o al software.
NOT: Le immagini presentate in questo protocollo sono state raccolte utilizzando un microscopio di deconvoluzione, fluorescenza dotato di set di filtri Sedat, RFP e GFP, stadio nano-movimento, obiettivo 60x NA 1.4 e telecamera CCD a 12 bit. Le persiane meccaniche integrate e le ruote a filtro motorizzato hanno permesso la ridotta esposizione all'eccitazione e il fotosbiancamento dei campioni. - Utilizzare il software appropriato per acquisire ed elaborare le immagini. Per deconvolve immagini, utilizzare funzioni di trasferimento ottico fornite dal produttore.
NOT: Per informazioni dettagliate sull'attrezzatura al microscopio e sul software utilizzato nel presente protocollo, fare riferimento alla Tabella dei materiali. - Per utilizzare un microscopio a fluorescenza convenzionale per acquisire immagini a cellule vive assicurarsi che il microscopio raccolga i dati digitalmente, ha obiettivi 40x o 60x con aperture numeriche (NA) maggiori di 1.2, ed è in grado di eseguire sezionamento ottico.
NOT: Senza questi requisiti, le immagini mostreranno una risoluzione ridotta, compromettendo la qualità delle misurazioni microscopiche e delle osservazioni qualitative. - Utilizzare programmi plug-in gratuiti (ad esempio, Fiji) per ridurre al minimo gli errori di sfocatura sistematici derivanti dalla perdita di contrasto durante l'acquisizione dell'immagine17,18,19,20 e per garantire una corretta analisi quantitativa dell'intensità della fluorescenza e di altri eventi temporali e dinamici all'interno della cellula.
NOT: Altri programmi di dissoluzione commerciale disponibili sono disponibili nella Tabella dei Materiali. - Scegli i set di filtri al microscopio che meglio corrispondono ai fluorofori sotto osservazione. Assicurarsi che i filtri di eccitazione ed emissione abbiano le passate di banda giuste che consentono il rilevamento specifico delle proteine fluorescenti. Ad esempio, per rilevare il segnale CFP, un passaggio di banda di eccitazione ed emissione di 430/25 e 470/30 è appropriato, ma non per la fluorescenza RFP.
- Utilizzare un approccio alle impostazioni mini-efficaci (MESA) quando si immagina il lievito di fissione in più punti temporali. In altre parole, evitare l'uso prolungato di lunghezze d'onda di eccitazione e impiegare il più basso potere di eccitazione e il tempo di esposizione che generano dati di imaging accettabili, ma quantificabili e riproducibili.
- Per l'imaging prolungato durante la mitosi o la meiosi, limitare l'intervallo tra i punti di tempo di acquisizione a 5-10 min. Anche se il 2% delle pastiglie di agarose può sopportare sessioni di imaging da 12 a 16 h, è probabile che il cambiamento delle cellule a causa dell'evaporazione degli agarose sia probabile. Pertanto, eseguire esperimenti completi di mitosi o meiosi in finestre 4-6 h o 8-10 h, rispettivamente.
- Raccogliere i dati di imaging per 4-8 h composti da almeno 24-48 punti di tempo di acquisizione, rispettivamente, una proteina di fluorescenza, e uno z-stack per punto temporale e canale fluorescente composto da 13 sezioni con spaziatura di 0,5-m utilizzando un obiettivo 60x. Ciò richiede almeno 0,5-1 GB di spazio di archiviazione sul disco rigido. Così, oltre a eliminare il fotosbiancamento e il cambiamento di cella, creare un flusso di lavoro che considera le capacità di calcolo1,2,3.
NOT: Questi parametri di acquisizione sono in genere impostati e modificati nel software che controlla le funzioni del microscopio e che raccoglie ed elabora le immagini. - Per esaminare in dettaglio specifici processi nucleari, eseguire l'acquisizione di immagini ogni 5-10 s, purché l'emissione non diminuisca sostanzialmente dopo frequenti esposizioni. Eseguire un'analisi preliminare dell'intensità della fluorescenza in diversi periodi di tempo per determinare il punto dopo il quale l'accuratezza dei dati raccolti non è più affidabile1,3.
- Nel software di acquisizione ed elaborazione delle immagini, utilizzare la proiezione di intensità massima sulle immagini z-stack per osservare tutte le strutture ad alta densità di fluorescenza su un piano 2D indipendentemente dalla loro posizione verticale1,2, 3. Ciò facilita un rapido esame dei processi nucleari che si verificano in diversi voxel. Raccogliere un'immagine a campo luminoso a medio focale per generare un'immagine di riferimento delle celle sotto osservazione.
5. ImageAnalisi20,21
NOT: L'analisi delle immagini in questo protocollo viene eseguita utilizzando Fiji. Per altri programmi di analisi e plug-in Fiji, vedere Tabella dei materiali.
- Caricare un'immagine deconvolved selezionando la funzione Bio-Formats Importer nel menu Plugin. Nella finestra popup Opzioni di importazione selezionare Hyperstack, Modalità colore predefinitae selezionare Scala automatica prima di premere il pulsante OK.
- Assicurarsi che la finestra visualizzata abbia il numero corretto di canali di fluorescenza e di intervalli di tempo scorrendo lateralmente sulle rispettive barre nella parte inferiore. Salvare come file Tiff, che non comprime i dati e previene la perdita di informazioni.
- Aprire un'immagine contenente una barra della scala generata durante l'elaborazione dei dati dal software del microscopio. Determinare la lunghezza in pixel della barra della scala con lo strumento Linea retta per disegnare una linea parallela di dimensioni simili e selezionare Misura dal menu Analizza. Aggiungete una barra della scala impostando il rapporto pixel-a-m dell'immagine selezionando Imposta scala dal menu Analizza.
- Nella finestra a comparsa Imposta scala, immettere la Distanza calcolata in pixel e Distanza nota in m, impostare Proporzioni pixel su 1,0, inserire micron come Unità di lunghezzae selezionare la casella Globale prima di fare clic sul pulsante pulsante OK.
- Utilizzare l'opzione Imposta misure nel menu Analizza per scegliere diversi parametri da quantificare quando si seleziona Misura. Ai fini del presente protocollo, selezionare le seguenti metriche: Area, Perimetro, Valore grigio medio, Media ,Valore grigio minimo e massimo, Densità integrata, Posizione pilae Visualizzazione etichetta.
- A seconda della precisione dei dati raccolti, immettere più di 1 per l'opzione Posizioni decimali e selezionare la casella Notazione scientifica, se necessario. Dopo aver applicato il comando Misura, una finestra popup Risultati mostrerà i valori per ogni parametro pertinente. Salvare i risultati come file CSV per analisi future in un programma di statistiche.
NOT: Non è necessario separare un'immagine nei suoi canali fluorescenti costituenti per determinare la lunghezza, a meno che non vi sia un'interferenza del segnale tra i diversi colori nel qual caso seguire il passaggio descritto di seguito. - In caso di interferenza del segnale, selezionare Colore e lo strumento Canali dal menu Immagine e analizzare ogni colore separatamente. Per misurare la lunghezza delle strutture non lineari, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Linea e utilizzare l'opzione Linea segmentata o Linea a mano libera per tracciare gli oggetti desiderati.
- Per le strutture lineari o per determinare la distanza tra due punti, utilizzare la funzione Linea retta e selezionare Misura dal menu Analizza. I valori per la lunghezza in zm verranno aggiunti automaticamente ai parametri selezionati in precedenza nell'opzione Imposta misure.
- Per misurare le variazioni delle dimensioni del segnale e dell'intensità della fluorescenza, creare innanzitutto una libreria di regioni di interesse (ROI),che aumenta la precisione della quantificazione e facilita misurazioni veloci in una pila di immagini. Selezionate Colore e strumento canali nel menu Immagine.
- Nella finestra a comparsa Canali, controllare il canale di colore per il quale verrà misurata l'intensità o l'area. Scegliete le funzioni Regola e Soglia nel menu Immagine. Selezionare la casella Sfondo scuro, selezionare il Metodo predefinito (se non diversamente richiesto dai dati raccolti) e selezionare Rosso per sovrapporre i segnali di interesse.
NOT: La misurazione della stabilità, del movimento e della localizzazione delle proteine dipende strettamente dalla soglia di colore utilizzata per la creazione di librerie di ROI. È importante scegliere il metodo di soglia corretto per il tipo di segnale marcatore fluorescente da visualizzare17,18. - Utilizzare lo strumento Bacchetta per evidenziare ogni struttura di interesse e premere la lettera T sulla tastiera per aggiungere il ROI selezionato alla finestra di gestione del ROI a comparsa. Ripetete questo processo per ogni sezione (intervallo di tempo) nella pila di immagini e memorizzate tutte le ROM facendo clic sul pulsante Altro e selezionando Salva.
- Aprire la cartella del ROI compressa per caricare il gestore del ROI e fare clic su ogni identificatore ROI nel pannello a sinistra. Selezionate Misura dal menu Analizza (Measure) dal menu Analizza (Analyze) e ripetete questo comando su ogni identificatore ROI per quantificare gli oggetti di interesse in tutte le sezioni della pila di immagini.
- Se lo spostamento delle celle non è un problema e il piano focale rimane lo stesso per tutte le sezioni della pila, fare clic su Misura multipla nel gestore del ROI. Nella finestra popup, selezionare Misura tutte le sezioni anziché Una riga per sezione per scorrere le misure nello stack di immagini. Salvare i risultati come file CSV e analizzare le misurazioni in un programma di statistiche.
- Per più segnali nucleari che comprendono la struttura di interesse, premere il tasto Maiusc mentre si selezionano gli oggetti con lo strumento Bacchetta per creare un unico ROI. In alternativa, crea un ROI di dimensioni costanti con lo strumento Ovale per includere tutti i segnali di interesse.
NOT: Questo approccio ovale può essere necessario per misurare e descrivere il comportamento del segnale su un'area in cui il segnale di fluorescenza cambia di dimensioni e intensità nel tempo. L'intensità del segnale, in questo caso, è la densità media del segnale su una determinata area. - Determinare qualitativamente la co-localizzazione di due segnali fluorescenti dal cambiamento di colore della regione di sovrapposizione del segnale. Tuttavia, poiché la zona di co-localizzazione si restringe, è più difficile distinguere la sovrapposizione del segnale. In questo caso, seguire i passaggi descritti di seguito.
- Utilizzando lo strumento Canali, come descritto nel passaggio 5.6, tracciate una linea retta su ciascun segnale in questione e selezionate il comando Profilo di stampa (Plot Profile) nel menu Analizza (Analyze).
- Ripetere questo passaggio per tutti i colori in questione utilizzando la stessa linea disegnata.
- Nella finestra popup Di stampa di esempio visualizzata dopo ogni passaggio di profilatura, premere il pulsante Lista per richiamare una finestra Valori di stampa e salvare le misure per ogni segnale come file CSV.
- In un programma di statistiche, creare un grafico che traccia il valore di grigio per ogni segnale rispetto alla posizione corrispondente (in m) lungo la linea disegnata. La mancanza di sovrapposizione tra le trame del profilo del segnale indica generalmente la mancanza di co-localizzazione.
NOT: Utilizzare lo strumento Modulo stampa profilo sulle immagini proiettate per esaminare la co-localizzazione del segnale. Questo è affidabile solo se tale sovrapposizione è osservata anche attraverso l'immagine z-stack.
- Per monitorare il comportamento dinamico delle proteine fluorescenti nel tempo, utilizzare lo strumento Multi Kymograph disponibile nel menu Analizza. L'immagine risultante mostra il movimento del segnale fluorescente attraverso una serie di istantanee condensate in ogni fetta della z-stack, che rappresenta i singoli punti temporali.
- Utilizzare lo strumento Canali come descritto nel passaggio 5.6 per isolare l'oggetto di interesse nel canale corretto. Assicurarsi che l'oggetto o la struttura selezionata non si sposti considerevolmente attraverso lo z-stack. Posizionate una linea retta o un rettangolo sull'oggetto, selezionate lo strumento Kymograph multi-kymograph dal menu Analizza e immettete la larghezza desiderata della linea che si sovrappone all'oggetto.
- Creare pannelli immagine che mostrano dinamiche nucleari in un intervallo di tempo specifico utilizzando lo strumento Canali come descritto nel passaggio 5.6 e selezionando gli strumenti Stack e Crea montaggio dal menu Immagine. Nella finestra popup Crea montaggio, immettere il numero di colonne e righe desiderato, impostare un fattore di scala pari a 1,0, scegliere le sezioni Prima e Ultima (intervalli di tempo) e modificare La larghezza bordo su almeno 5 prima di premere OK. È possibile scegliere quali immagini nella pila mostrare modificando Incrementi in base alla sequenza desiderata.
- Per generare un filmato, caricate l'hyperstack desiderato, selezionate Salva come file avi dal menu File, scegliete nessuno per Compressione (Compressione)e immettete una frequenza fotogrammi di 2-8 fps. Selezionate il comando Crea montaggio mentre selezionate Composito nello strumento Canali per unire o separare tutti i colori che compongono l'immagine.
NOT: In questo protocollo vengono forniti due file avi (Filmato 1-2). Usali in Fiji per provare diverse funzionalità evidenziate durante il passaggio 5. - Per visualizzare una singola cella rappresentativa, utilizzare Trasforma e Ruota dal menu Immagine e immettere i gradi di rotazione. I numeri negativi ruotano gli oggetti verso sinistra, mentre i valori positivi ruotano gli oggetti verso destra. Una volta che la cella è nell'orientamento corretto, disegnare un rettangolo che comprenda l'intera cella attraverso la z-stack o durante gli intervalli di tempo di interesse e selezionare Ritaglia dal menu Immagine. Procedere come indicato nei passaggi 5.16 e 5.16.1 per generare un pannello immagini o un filmato.
- Per generare un filmato, caricate l'hyperstack desiderato, selezionate Salva come file avi dal menu File, scegliete nessuno per Compressione (Compressione)e immettete una frequenza fotogrammi di 2-8 fps. Selezionate il comando Crea montaggio mentre selezionate Composito nello strumento Canali per unire o separare tutti i colori che compongono l'immagine.
- Aggiungere una barra di scala al pannello immagini o al filmato selezionando Strumenti e barra di scala dal menu Analizza. Nella finestra popup Barra della scala immettere 5-15 per Larghezza in micron per celle singole o 100-250 per interi campi di visualizzazione, scegliere bianco o nero per Colore e selezionare una posizione appropriata per posizionare la barra della scala.
- Per i film, è utile mostrare la progressione del tempo durante gli eventi nucleari. Per visualizzare il cambiamento di tempo tra i fotogrammi, selezionare Immagine, fare clic su Stack, utilizzare lo strumento Time Stamper , indicare il fotogramma iniziale nella serie temporale e selezionare una posizione appropriata per la visualizzazione dell'ora.
Representative Results
Se l'imaging a cellule vive viene utilizzato per la mitosi o la meiosi, è fondamentale impiegare cellule di lievito di fissione sane prima di effettuare qualsiasi tipo di osservazione. La qualità dei dati risultanti si basa fortemente sul materiale di partenza. Se le cellule muoiono di fame a causa di limitazione dei nutrienti o di crescita eccessiva, mostreranno vacuoli in eccesso e diminuzione delle dimensioni delle cellule (Starvation, Figura 2A). Per gli esperimenti sulla mitosi, è meglio evitare l'uso di cellule che mostrano stress cellulare (Starvation, Figura 2A). In caso contrario, i risultati sperimentali saranno incoerenti e irriproducibili. Per aggirare questa limitazione, scegli i giusti controlli del tipo selvaggio e familiarizza con i vari fenotipi dei mutanti di interesse. Ad esempio, le cellule mitotiche affamate per 12 h cessano di replicare attivamente il DNA. Poiché l'espressione Tos4-GFP è associata all'attività G1/S-phase22,23, le cellule logaritmiche che trasportano questo marcatore e una per la divisione nucleare (Sad1-DsRed10) mostrano l'espressione pannucleare Tos4-GFP, i foci Sad1-DsRed separazione e settazione in corso (suggerendo la replicazione attiva del DNA e la divisione cellulare) (Log, Figura 2A), mentre le cellule affamate non mostrano tale attività (Starvation, Figura 2A). Questo risultato è coerente con gli effetti della limitazione dei nutrienti nel lievito di fissione, che diminuisce la trascrizione in G1, attiva il checkpoint del ciclo cellulare G1/S e promuove l'ingresso G05. Per gli esperimenti di meiosi, le cellule devono crescere ad alta densità, ma senza raggiungere la fase stazionaria. Successivamente, le cellule di entrambi i tipi di accoppiamento vengono mescolate e incubate insieme in supporti a basso azoto. Il mancato accoppiamento, come nel caso in cui le cellule non sono sufficientemente affamate di azoto, impedirà loro di entrare nella meiosi (Inefficiente, Figura 2B). La robusta flocculazione della sospensione delle celle di accoppiamento aumenta l'interazione tra cellule e cellule e quindi indica un accoppiamento riuscito e un'efficiente induzione meiotica (Efficiente, Figura 2B).
Le pastiglie di gel di Agarose e l'interruzione fisica dei grumi cellulari garantiscono una corretta visualizzazione delle singole cellule o dell'asci (Log, Figura 2A; Efficiente, Figura 2B). Le pastiglie devono fornire una piattaforma rigida, ma umida, sulla quale le cellule sono contemporaneamente fissate sul posto e protette dalla disidratazione. Inoltre, i cuscinetti devono essere abbastanza spessi da resistere alle modifiche dovute all'evaporazione e fornire una superficie livellata che consente una corretta messa a fuoco durante l'acquisizione dell'immagine (Figura 1C). La rotazione coverslip è necessaria per separare e diffondere le cellule all'interno di aggregati di accoppiamento (Figura1F; Efficiente, Figura 2B). Senza questo passaggio, poche cellule aploidi asci ma numerose si osservano perché gli asci rimangono intrappolati in strati inaccessibili di grumi di accoppiamento, mentre le cellule aploidi sono libere di popolare tutti i punti monostrato disponibili (Figura 2B). Anche per gli esperimenti mitotici, in cui l'agglomeramento delle cellule è meno problematico, la rotazione dello scissione sposta le celle intorno al pad per creare uno strato a cella singola con spazio sufficiente tra le celle per ridurre gli effetti di affollamento e consentire la duplicazione delle cellule (Log, Figura 2A ).
L'Atb2 è un componente di tubulina di z coinvolto nella segregazione cromosomica nella mitosi del lievito di fissione e nella meiosi7,14. Quando è fluorescente, questo componente citoscheletro consente l'esame delle fasi che caratterizzano la separazione nucleare nella mitosi. Durante la profase (0'-20', Figura 3A), la nucleazione del mandrino mitotico si verifica nel lato nucleare dei corpi del palo del mandrino (SPB), come rivelato dalle fibre Atb2-mRFP impostate su uno sfondo pannucleare Htt1-GFP5. Durante la transizione metafase-anafase (20'-40', Figura 3A) il mandrino mitotico si estende verso l'esterno e il nucleo si divide in due. Quando la cella entra in telofase (60'-80', Figura 3A),Atb2-mRFP si espande in modo bidirezionale fino a quando i cromosomi non sono completamente separati. Dopo questo punto, le fibre Atb2-mRFP si raggruppano e si diffondono sulla superficie cellulare per riconquistare la loro forma interfase in ciascuna delle cellule figlie risultanti. La citocinesi (>120',Figura 3A) si verifica solo dopo la forma di un setto e divide la cella per fissione. A seguito dei cambiamenti nell'intensità Hht1-GFP su un ciclo mitotico rivelano tre passaggi importanti nella dinamica nucleare: metafase-anaphase (intensità media, compattazione del DNA: 20'-40',Figura 3A-B), telofase (bassa intensità, separazione del DNA: 60'-80'), Figura 3A-B) e G1 (aumento dell'intensità, duplicazione del DNA: 100'-120',figura 3A-B). Allo stesso modo, ma usando cellule che trasportano solo Hht1-mRFP e che impiegano lo strumento multi-kymograph (vedi passo 5.15) nelle Figi, è possibile osservare la divisione mitotica dalla metafase alla telofase e valutare i movimenti nucleari coinvolti durante la corretta segregazione (Normale, Figura 3C). I kymografi mis-segregation mostrano l'attività del segnale tra i due principali percorsi nucleari, indicando una possibile separazione errata a causa della frammentazione cromosomica o della separazione cromatide inappropriata (Lagging, Figura 3C).
Come accennato in precedenza, nel lievito di germoglie lunamento e fissione, Tos4 è trascritto in G1 e funziona durante la replicazione del DNA nella fase S22,23. Ciò può essere osservato in una kymograph in cui l'espressione Tos4-GFP aumenta nel nucleo dopo che Sad1-DsRed10 foci si muovono in direzioni opposte (indicando la divisione nucleare), ma prima che il setto si presenti, che precede la citocinesi (39', Figura 3D ; 36', Figura 3E). La fase di elevata attività Tos4-GFP inizia alla fine della transizione M-G1/S (45', Figura 3E) e termina in G2 (>60', Figura 3E), subito dopo la divisione cellulare. Sebbene molto diffusa durante la G1, l'intensità del segnale Tos4-GFP aumenta dopo l'anafase e durante la fase S e co-localizza con focolai Sad1-DsRed segregati (45'-60', Figura 3E). Questo risultato rivela il periodo di settificazione nel lievito di fissione quando la duplicazione del genoma è iniziata nelle cellule figlie (G1/S), ma la citocinesi non si è ancora verificata.
Hht1 è istone H3 in lievito di fissione ed è comunemente modificato con tag fluorescenti per visualizzare il DNA nucleare5,14. Nella mitosi, poiché le cellule passano dalla metafase alla telofase (20'-120', Figura 3A), si osservano due cambiamenti distinguibili alla massa nucleare. La prima modifica comporta una contrazione delle dimensioni nucleari nella metafase (20',Figura 3A), mentre la seconda mostra la divisione del nucleo durante l'anafase (40', Figura 3A). Oltre a condividere questi cambiamenti con le cellule mitotiche, le cellule meiotiche presentano oscillazione nucleare (cioè, cavallo-coda) (da -100' a -50', Figura 4A-B) durante la ricombinazione omologa e l'ulteriore riduzione delle dimensioni del nucleo alla fine dell'anafase II (70'-90', Figura 4A). Hht1-mRFP viene utilizzato per esaminare i fenotipi di mis-segregazione come i cromosomi in ritardo o frammentati (Lagging, Figura 3C). È anche impiegato per osservare e descrivere le dinamiche nucleari in ciascuna delle fasi della meiosi (Figura4A-B). La massa nucleare è grande e varia a dimensioni durante gran parte della coda di cavalli (HT: da -100' a -50', Figura 4A-B)). Quando le cellule entrano nella metafase (MT: da -40' a 0', Figura 4A-B), le dimensioni nucleari e la diminuzione dell'oscillazione, in linea con l'aumento dell'attività di condensa in questa fase. L'insorgenza di un'ulteriore riduzione nucleare e di un movimento nucleare, correlando bene le due divisioni nucleari che caratterizzano meiosi I e II (MI e MII). Pertanto, la meiosi è associata a fluttuazioni di dimensioni nucleari quando i cromosomi omologhi si allineano e si ricombinano e con riduzioni delle dimensioni nucleari a seguito di due cicli di separazione cromosomica. Gli alleli che modificano queste dinamiche nucleari sono probabilmente associati alla regolazione della stabilità del genoma nella meiosi12,13.
Rec8 è la sottounità di coesina meiotica nel lievito di fissione. Viene caricato sulla cromatina dopo la replicazione del DNA (mei-S) e mantiene la sorella cromatidi legati l'uno all'altro fino ad anaphase II. Dopo la metafase I, Rec8 viene rimosso dai bracci cromosomici separatamente ed è protetto al centromero da Sgo1-PP2A. Alla fine della segregazione degli omologi, Rec8 viene eliminato anche al centromero, consentendo così la separazione delle cromatide sagge (Figura 5A)6,24. Rec8-GFP insieme a marcatori di segregazione cromosomica come Sad1-DsRed o Hht1-mRFP consentono la visualizzazione delle dinamiche di coesione durante la meiosi. Il segnale Rec8-GFP è pannucleare durante mei-S (<<-90', Figura 5A-B),profase I (da -90' a -50', Figura 5A-B) e metafase I (-40' a 0', Figura 5A-B). Questa osservazione rivela l'associazione di Rec8-GFP lungo gli assi cromosomi che segue la duplicazione del DNA. Quando le cellule entrano nell'anafase I (10', Figura 5A-B), l'intensità Di Rec8-GFP diminuisce in tutto il nucleo, ma rimane forte al centromero, dove forma un focus in ogni massa nucleare (20'-70', Figura 5A-B). Questo risultato è coerente con la degradazione Rec8-GFP lungo le braccia cromosomiche, ma non al centromero, che ne consegue dopo la segregazione dell'omologa. Prima di anaphase II, il focus Rec8 scompare, liberando i cromatidi sorelle per la separazione in MII (70'-80', Figura 5A-B). Il marcatore Rec8-GFP è quindi utile per esaminare le condizioni che interrompono l'istituzione, la rimozione e la stabilità complessiva della coesione meiotica. Accoppiato con un marcatore di divisione nucleare come Hht1-mRFP5,13, Rec8-GFP può essere impiegato per affrontare questioni di come la tempistica di coesione e la stabilità prima e durante la meiosi influenzano la corretta segregazione cromosomica12 ,13. Questo protocollo non affronta le proteine le cui dinamiche si verificano principalmente nel citosol. Tuttavia, Tabella I mostra alcune proteine citosoliche che sono comunemente utilizzate per esaminare i processi di citoscheletro e membrana necessari per l'endocitosi, l'esocitosi e la citocinesi tra gli altri processi.
Figura 1: Preparazione dei cuscinetti agarose per l'imaging delle cellule vive. (A) Preparazione delle tubazioni assemblate con un supporto per le punta pipette, un nastro da laboratorio e vetrini al microscopio. Posizionando i vetrini perpendicolari l'uno all'altro si crea una tasca in cui si forma il pad agarose. L'aggiunta di pezzi di nastro da laboratorio ai lati regola la larghezza del pad agarose alle specifiche richieste. (B) L'agarose afusosi viene lasciato raffreddare prima di impostarlo sui vetrini del microscopio per creare le pastiglie. In questa fase, è necessario erogare lentamente il volume dell'agarose per evitare di creare bolle d'aria. (C) Lo scivolo superiore è posto sul punto dell'agarose erogato per formare un pad circolare con una superficie dritta, bordi pari e nessuna fessura agarose visibile. (D) Dopo aver messo un campione di sospensione cellulare sul pad agarose, invertire lo scivolo e posizionare in cima a un tovagliolo di carta senza lamino per rimuovere il mezzo liquido supplementare. (E) Posizionare con attenzione un coperchio sul cuscinetto dell'agarose, assicurandosi di non intrappolare eventuali bolle d'aria e controllando che il piano di messa a fuoco sia piatto per evitare problemi di spostamento cellulare e di messa a fuoco. (F) Lentamente e con cautela, ruotare coverslip in senso orario per interrompere i grumi di cellule e per generare un mostrato cellulare che consente l'espansione delle cellule e una migliore visualizzazione delle cellule. (G,H) Utilizzare una miscela di idrocarburi riscaldata per sigillare le pastiglie di agarose e consentire loro di eclarizzare alla temperatura desiderata prima dell'imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Selezione delle celle corrette. (A) I pannelli superiori mostrano cellule di lievito di fissione lasciate morire di fame in EMM più integratori per 72 h e pannello inferiore mostra le cellule sottoposte a crescita logaritmica. Nelle cellule lasciate morire di fame, possono essere apprezzate piccole morfologie cellulari. La freccia rossa aperta mostra granuli vacuolari che sono caratteristici della fame. Nelle colture logaritmiche, le cellule che mostrano morfologie allungate e setti (freccia rossa) abbondano, indicando dinamiche di ciclismo attive. I pannelli di destra mostrano le celle che esprimono i segnali Tos4-GFP e Sad1-DsRed durante la fame e la proliferazione. L'espressione pannucleare Tos4-GFP e i segnali Sad1-DsRed che si localizzare ai poli cellulari opposti sono visti durante la proliferazione attiva, ma non in caso di fame. (B) Il pannello superiore mostra le celle dello stesso tipo di accoppiamento (h) che non si sono accoppiate in modo efficiente. La freccia rossa aperta mostra un paio di cellule vacuolare sottoposte a karyogamy. Questo non è insolito nelle colture di cellule h, dove il 10% delle cellule può passare da mate-type a h-. Il pannello inferiore mostra l'asci risultante dall'accoppiamento efficiente. L'asci zontico assume molteplici forme, tra cui le forme a zig-zag (freccia rossa) e le cellule di banana (freccia aperta rossa). Barra della scala: lunghezza 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dinamiche nucleari mitotiche. (A) Le proteine Histone H3 (Hht1-GFP) e dei microtubuli (Atb2-mRFP) sono state seguite durante un ciclo di mitosi (120 min). I singoli segnali per Hht1-GFP e Atb2-mRFP sono mostrati in pannelli in bianco e nero, mentre l'unione BF li mostra nei rispettivi colori. (B) Quantificazione dell'intensità Hht1-mGFP su un ciclo mitotico. Il cambiamento nei livelli di Hht1 è indicativo della divisione nucleare durante la mitosi e la duplicazione del DNA in G1. (C) Kymografi che mostrano una segregazione normale o anomala nella mitosi in cui i percorsi nucleari risultanti biforcano e mantengono l'integrità del DNA o deviano e promuovono la frammentazione cromosomica o la separazione cromata prematura, rispettivamente. (D,E) Pannelli di Kymograph e micrografi che mostrano la durata di M-to-G1/S rivelata dalla segregazione di Sad1-DsRed e dall'apparizione di segnali nucleari Tos4-GFP. Si notino i pannelli centrali in E che sono stati generati utilizzando il FIRE LUT in Fiji per creare una mappa termica graduata in intensità che facilita l'identificazione di macchie con alta espressione Tos4-GFP; in questo caso, localizzato nel nucleo e sovrapposti segnali Sad1-DsRed, come previsto. Barra della scala: lunghezza 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dinamiche nucleari meiotiche. (A) Serie di pannelli che mostrano movimento, compattazione e divisione del nucleo (Hht1-mRFP) durante la meiosi. La coda dei cavalli (HT) mostra ampie oscillazioni nucleari laterali seguite da Metaphase (MT), dove il movimento laterale nucleare diminuisce e si arresta completamente prima dell'anafase I. Nella meiosi I (MI), la massa nucleare principale si divide in due, mentre nella meiosi II (MII) vengono generati quattro nuclei durante il processo di separazione delle cromatidi della sorella. (B) Quantificazione del cambiamento dell'area nucleare (Hht1-mRF) in profase, metafase, MI e MII. L'area nucleare è dinamica durante le oscillazioni HT, diventa condensata in MT e diminuisce ulteriormente le dimensioni durante l'MI e il MII, dove si osserva poco movimento nucleare (Long Nuclear Axis). La misurazione dell'asse nucleare più lungo (Long Nuclear Axis) si basa sull'idea che, quando un cerchio si estende, cessa di avere un diametro costante e genera almeno due assi principali: long e short. Pertanto, quando si monitorano i cambiamenti nel nucleo, i cambiamenti nell'asse lungo o corto forniscono indicazioni di movimento nucleare. Barra della scala: lunghezza 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Dinamica della coesina meiotica. (A) Serie di pannelli che mostrano come il cambiamento del segnale Rec8-GFP sia correlato alle dinamiche nucleari meiotiche. Durante l'HT e la MT, il segnale Rec8-GFP è pannucleare e segue il movimento nucleare (Hht1-mFRP). In MI, Rec8-GFP si dissipana dal nucleo, lasciando solo un paio di foci, il che è coerente con la rimozione di Rec8 dalle braccia cromosomiche e l'istituzione della protezione Sgo1-PP2A al centromero. Mentre la cellula si avvicina all'MII, i foci Rec8-GFP iniziano a scomparire e non si vedono più prima dell'anafase II. (B) Quantificazione dell'intensità Rec8-GFP da HT a MII. Simile a quello che si vede in A, segnale GFP è alto attraverso HT e MT, diminuisce sostanzialmente durante MI e completamente scompaiono in MII. Questo modello conferma la dinamica coesina ai bracci cromosomici e al centromero, dove mantiene le cromatidi sorelle legate fino a quando non sono pronte per essere separate nel MII. Barra della scala: lunghezza 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| proteina | funzione | Commenti | etichetta | Riferimenti | ||
| Hht1 | Histone H3 coinvolto nell'imballaggio del DNA | Utilizzato per esaminare le dinamiche cromosomiche | Hht1-mRFP | 5,14 anni | ||
| Tos4 | La funzione Tos4 si verifica durante la fase G1 | Impiegato per studiare la tempistica G1 | Tos4-GFP | 22,23 | ||
| Rad21/ Rec8 | Sottounità Cohesin coinvolte nel tenere insieme le cromatidi sorelle dopo la replica | Utilizzato per analizzare la stabilità di coesione durante la segregazione mitotica (Rad21) e meiotica (Rec8) | Rad21-GFP/Rec8-GFP | 6,24 (24) | ||
| Rad11 | L'attività di RPA si verifica durante la riparazione del DNA mitotico, la ricombinazione meiotica e termina in metafase | Impiegato per studiare la riparazione del DNA in mitosi e dinamica di ricombinazione nella meiosi | Rad11-YFP | 5,13 | ||
| Rad52 | L'avivity Rad52 avviene durante la riparazione del DNA mitotico e la ricombinazione meiotica | Impiegato per studiare la riparazione del DNA in mitosi e dinamica di ricombinazione nella meiosi | Rad52-CFP | 5,13 | ||
| Cnp1 (informazioni in stato in3) | Histone H3 CENP-A localizza specificamente al centromero | Usato per seguire le dinamiche di segregazione cromosomica nella mitosi e nella meiosi | Cnp1-mCherry | 13 del sistema | ||
| Swi6 | Proteina omolologo HP1 coinvolta nella formazione di eterocromatina | Impiegato per studiare la mobilitazione dell'eteocromatina al centromero e ai telomeri | Swi6-GFP | 13 del sistema | ||
| Sad1 | Sad1 è coinvolto nella localizzazione del corpo del palo del mandrino all'involucro nucleare | Impiegato per analizzare la segregazione cromosomica nella mitosi e nella meiosi | Sad1-mCherry | 10 del sistema | ||
| CYTOSOL & MEMBRANE | ||||||
| Atb2 | Tubulina alfa 2 coinvolto nell'organizzazione del citoscheletro dei microtubuli | Utilizzato per esaminare la segregazione cromosomica nella mitosi e nella meiosi | Atb2-mRFP | 7,14 | ||
| Ync13 | Regolatore di esocitosi ed endocitosi coinvolto nel trasporto mediato con vescicoli | Impiegato per studiare l'integrità delle pareti cellulari durante la citochina | Ync13-mECitrine | 25 mi lato | ||
| Rlc1 | Sottounità Myosin II coinvolta nella contrazione dell'anello contrattile | Utilizzato per esplorare le dinamiche della maturazione e della contrazione del setto | RIc1-mCherry | 25 mi lato | ||
| Ccr1 | NADPH-cytochrome p450 reductase che fa parte del ER, plasma e membrana esterna mitocrondriale | Impiegato per esaminare dinamiche associate alla membrana come endocitosi, esocitosi e citocinesi | Ccr1N-GFP | 5 Del numero 3( | ||
| Gef1 | Fattore di scambio Rho guanyl-nucleotide coinvolto nella creazione e nel mantenimento della polarità cellulare | Utilizzato per esaminare la dinamica globale della polarità cellulare dipendente dai microtubuli | Gef1-mCherry-GBP | 26 del sistema di | ||
| Fus1 | Formin coinvolto nell'assemblaggio di fuoco di fusione actin durante la citogamia | Utilizzato per studiare le dinamiche di fusione associate all'accoppiamento del lievito di fissione | Fus1-sfGFP | 27 mi lapiùdel | ||
| Mnn9 | Sottounità Mannolsyltransferase coinvolta nella glicosilazione proteica N nell'apparato Golgi | Impiegato per studiare la maturazione del carico nel Golgi mentre progredisce da cis-Golgi a trans-Golgi | Mnn9-mCherry | 28 mi la più del 24 | ||
| Num1 | Fattore di ancoraggio corticale per la dineina coinvolta nella coda dei cavalli | Utilizzato per esaminare l'ancoraggio della dineina dipendente dai mitocondri durante l'oscillazione nucleare nella profase meiotica I | Num1-yEGFP | 29 del 22 221 | ||
Tabella 1: Indicatori delle dinamiche nucleari e citosoliche.
Film 1: transizione Da M a G1/S che mostra il corpo del palo del mandrino (SPB; Sad1-DsRed) separazione prima della setticazione e dell'accumulo del segnale nucleare Tos4-GFP. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Filmato 2: Completamento del ciclo mitotico che mostra la divisione di estensione dei microtubuli (Atb2-mRFP) con divisione nucleare (Hht1-GFP). Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Discussion
L'imaging a cellule vive durante la mitosi e la meiosi offre l'opportunità di esaminare le dinamiche nucleari senza interrompere sostanzialmente la fisiologia del lievito di fissione durante l'acquisizione dei dati. Tuttavia, occorre prestare attenzione per garantire che le cellule crescano fino alle densità desiderate senza stress ambientali; e per la meiosi, che le cellule sono immagine durante il tempo di differenziazione terminale e non troppo presto o tardi. L'eccesso di affollamento cellulare, la fame e le temperature di crescita inappropriate sono fattori comuni che contribuiscono alle osservazioni irriproducibili. Inoltre, durante la costruzione del ceppo, è fondamentale verificare che i tag fluorescenti non interferiscano con le funzioni dei geni bersaglio né influiscano sulla forma fisica complessiva delle cellule. Il mancato ispezione approfondita dei fenotipi di ceppi che trasportano marcatori fluorescenti può portare a risultati incoerenti e incomparabili in genotipi simili.
Anche se le pastiglie di agarose al microscopio sono semplici da montare, possono anche rappresentare un ostacolo nell'ottenere dati di imaging preziosi. Creare cuscinetti agarose è semplice come posizionare tre vetrini del microscopio paralleli l'uno all'altro, erogare agarose fuso sul vetrino centrale e mettere una diapositiva che trasversa la parte superiore degli altri vetrini. È utile, tuttavia, assemblare un apparato slide-maker che consente modifiche di larghezza per produrre pastiglie agarose resistenti, specifiche della situazione. Un semplice slide-maker che dà flessibilità di larghezza pad è costituito da una piattaforma (porta punte pipette o la panca), due vetrini al microscopio, e nastro lab che agisce come il meccanismo di regolazione della larghezza pad (Figura 1A). Lo spessore esatto del pad dipenderà dai requisiti di tempo di imaging, dalla marca di agarose, dalla temperatura, dal sigillante coverslip, dal tasso di evaporazione, ecc. Pertanto, è importante calibrare il sistema di imaging prima dell'acquisizione dei dati per aumentare la riproducibilità tecnica e migliorare la qualità dell'imaging live-cell1,2,3. La superficie del pad, la rigidità e la composizione sono essenziali durante l'acquisizione prolungata dell'immagine. Agarose ha bassa fluorescenza di fondo, può essere facilmente modellato, e alla concentrazione appropriata, resiste alla deformazione strutturale a causa dell'evaporazione. Inoltre, la combinazione di supporti di lievito di fissione con agarose non compromette la qualità dell'immagine e consente un'osservazione estesa di mitosi multipli e cicli di meiosi. Inoltre, è importante evitare eventuali bolle d'aria per la microscopia time-lapse. All'interno dei cuscinetti agarose e all'interno del campione, le sacche d'aria si espandono nel tempo, causando lo spostamento delle cellule e l'interruzione dei piani focali. A condizione che le cellule siano diseguate in modo efficiente dalla rotazione dei coverslip, i ricercatori possono seguire i processi mitotici di diverse generazioni e gli eventi meiotici dalla fusione nucleare alla sporulation. Fare e scegliere il pad giusto per gli esperimenti di imaging richiede tempo per padroneggiare, ma una volta raggiunto, può contribuire a osservazioni al microscopio altamente informative.
Come per altri metodi, la microscopia a cellule vive non è priva di limitazioni tecniche. L'uso di proteine fluorescenti introduce confini agli esperimenti che limitano la portata di ciò che può essere studiato. Il fotosbiancamento e la foto-tossicità sono problemi tipici dell'acquisizione prolungata delle immagini. Possono essere contrastati non esponendo le cellule a lunghezze d'onda corte per troppo tempo o troppo frequentemente. Per gli esperimenti che coinvolgono GFP, CFP, YFP, mRFP e DsRed, proteine fluorescenti tipiche utilizzate nell'imaging a celle vive del lievito di fissione, è comune impiegare una luce di eccitazione del 5-15% e un tempo di esposizione di 100-500 ms per gli esperimenti di routine. Questi parametri cambiano, tuttavia, in base alle specifiche esigenze dell'esperimento del ricercatore. Inoltre, gli z-stack sono composti da 9-13 sezioni con spaziatura di 0,5 m utilizzando un obiettivo 60x è sufficiente per risolvere lo spessore di una cella di lievito di fissione. Inoltre, è importante confermare che i marcatori fluorescenti non interrompono la corretta regolazione o funzione delle proteine bersaglio o generano fenotipi spuri. Pertanto, è consigliabile costruire ceppi contenenti diversi tag fluorescenti e di affinità per lo stesso gene bersaglio per corroborare le osservazioni con mezzi diversi. Inoltre, è responsabilità dei ricercatori garantire che i parametri sperimentali possano essere riprodotti attraverso gli esperimenti e che i dati raccolti siano adatti all'analisi a valle1,3. Nessuna tecnologia può sostituire la pratica collaudata nel tempo di validazione meticolosa dei sistemi sperimentali mediante un'attenta osservazione e un rigoroso esame della linearità nel rilevamento dei segnali fluorescenti.
Infine, è fondamentale analizzare i dati di microscopia in formati che non modificano le immagini raw. Fiji fornisce eccellenti strumenti di documentazione per tenere traccia delle misurazioni dei dati grezzi e consente ai ricercatori di esaminare diversi parametri cellulari in una singola sessione. Queste caratteristiche, così come la sua ricchezza di tutorial online e ampia copertura letteraria, rendono Fiji uno strumento importante per misurare, analizzare e presentare dati di imaging di cellule vive che descrivono la dinamica nucleare del lievito di fissione in mitosi e meiosi.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Natalia La Fourcade e Mon LaFerte per aver reso la preparazione di questo manoscritto uno sforzo più piacevole. Grazie ai membri del Forsburg Lab che hanno contribuito al completamento di questo lavoro con la loro comprensione, idee di sperimentazione e sostegno morale. Questo progetto è stato sostenuto da NIGMS R35 GM118109 a SLF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
- Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).
- Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
- Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
- Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
- Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
- Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
- Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
- Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
- Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
- Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
- Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
- Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).
- Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
- Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
- Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).
- Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
- Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
- Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).
