Summary
Dimostriamo un metodo per determinare la fecondazione riuscita o fallita sulla base della morfologia nucleare dello sperma nell'Arabidopsis doppia fecondazione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
Abstract
Le piante da fiore hanno un sistema di riproduzione sessuale unico chiamato "doppia fecondazione", in cui ciascuno spermatozoi si fonde con precisione con una cellula uovo o una cellula centrale. Così, due eventi di fecondazione indipendenti si svolgono quasi simultaneamente. La cellula uovo fecondata e la cellula centrale si sviluppano rispettivamente in zigote ed endosperma. Pertanto, un controllo preciso della doppia fecondazione è essenziale per lo sviluppo del seme che ne consegue. La doppia fecondazione si verifica nel gametophyte femminile (sacco embrionale), che è profondamente nascosto e coperto da spessi tessuti ovuli e ovarici. Questa costruzione del tessuto piisilo rende abbastanza difficile l'osservazione e l'analisi della doppia fecondazione e ha creato la situazione attuale in cui molte domande riguardanti il meccanismo della doppia fecondazione rimangono senza risposta. Per la valutazione funzionale di un potenziale candidato per l'regolatore di fecondazione, l'analisi fenotipica della fecondazione è importante. Per giudicare il completamento della fecondazione in Arabidopsis thaliana, le forme dei segnali di fluorescenza che etichettano i nuclei dello sperma vengono utilizzate come indicatori. Una cellula sperma che non riesce a fertilizzare è indicata da un segnale di fluorescenza condensata al di fuori dei gameti femminili, mentre una cellula sperma che concime con successo è indicata da un segnale dedensato a causa della karyogamia con il nucleo dei gameti femminili. Il metodo qui descritto fornisce uno strumento per determinare la fecondazione riuscita o non riuscita in condizioni di invivo.
Introduction
Le piante da fiore producono semi attraverso la doppia fecondazione, un processo che è direttamente controllato da interazioni tra proteine localizzate sulla membrana plasmatica gameta1,2. Pianta da Fiore gameti maschili, un paio di spermatozoi, si sviluppano in polline. Un tubo di polline che cresce dopo l'impollinazione fornisce una coppia di spermatozoi ai gameti femminili, una cellula uovo e una cellula centrale, che si sviluppano in un sacco embrionale. Dopo che i gameti maschili e femminili si incontrano, le proteine sulla superficie dei gameti promuovono il riconoscimento, l'attaccamento e la fusione per completare la doppia fecondazione. In studi precedenti, le proteine della membrana dei gameti maschili GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 e GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 sono state identificate come regolatori di fertilizzazione coinvolti nella fusione dei gameti e rispettivamente l'allegato. Recentemente abbiamo identificato una proteina di membrana specifica del gamete maschile, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), come regolatore di fertilizzazione coinvolto nell'interazione dei gameti. Abbiamo scoperto che una diminuzione dell'espressione DMP9 si traduce in un'inibizione significativa della fecondazione delle cellule ovuli durante la doppia fecondazione in A. thaliana6.
Poiché la doppia fecondazione si verifica in un sacco embrionale, che è incorporato in un ovulo che viene ulteriormente avvolto con tessuto ovarico, è difficile osservare e analizzare gli stati dei processi di doppia fecondazione. Per questo motivo, ci sono ancora molti punti poco chiari che ostacolano una comprensione completa dell'intero meccanismo del controllo della doppia fecondazione. L'istituzione di tecniche di osservazione per tracciare il comportamento dei gameti durante la doppia fecondazione in condizioni in vivo è indispensabile per l'analisi funzionale dei potenziali candidati per i regolatori di fecondazione. Recenti studi hanno prodotto linee marker in cui le strutture subcellulari dei gameti sono etichettate con proteine fluorescenti. In questo articolo, dimostriamo un protocollo semplice e veloce per osservare la doppia fecondazione che si è verificato in un sacco embrionale derivato da pistili artificialmente impollinati. Utilizzando la linea di marcatore del nucleo delle cellule spermatrici HTR10-mRFP7, lo stato di fecondazione di ogni gamete femmina può essere discriminato sulla base della morfologia del segnale nucleare dello sperma. Il nostro protocollo incentrato su un tale cambiamento morfologico dei nuclei spermatozoi alla fecondazione può ottenere in modo efficiente una quantità sufficiente di dati per la prova statistica. Una linea DMP9-knockdown con sfondo HTR10-mRFP (DMP9KD/HTR10-mRFP) è stata utilizzata come piante maschili per mostrare un unico modello di fecondazione. Il protocollo è adatto anche per l'analisi funzionale di altri regolatori di fecondazione.
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Protocol
1. Impollinazione artificiale
NOT: Prima di iniziare il processo, è necessaria una coppia di pinze n. 5.
- Coltivare A. thaliana (Col-0) a 22 gradi sotto un ciclo scuro di luce/8 chili di 16 ore in una camera di crescita.
NOT: Tagliare e rimuovere il primo gambo di fiori sviluppato con forbici per promuovere lo sviluppo di gemme ascellari. Le piante in crescita vigorosa (2-3 settimane dopo il taglio del primo gambo; altezza della pianta circa 25 cm) sono adatte per l'analisi. - Per evitare, rimuovere sepal (Figura 1B), petalo (Figura 1C) e stami (Figura 1D) di boccioli di fiori nella fase 118 (Figura 1A) utilizzando il numero 5 forza. Muoversi con pezzi di petali visto in cima è meglio.
NOT: Utilizzare una linea di marcatore gamete femminile adatto. In questo protocollo, abbiamo usato una pianta di tipo selvatico come genitore femmina. - Quindici-diciotto ore dopo l'emasculazione, prendere lo stame di un fiore DMP9KD/HTR10-mRFP allo stadio 138 pizzicando il filamento con pinze.
- Per impollinare, accarezzare delicatamente lo stigma di un pistilo evirato più volte con un'antere dehiscente.
2. Preparazione dell'ovulo per l'osservazione
NOT: Sono necessari i seguenti elementi: un vetrino a slitta con nastro adesivo a due lati collegato, pinze n. 5, un ago di iniezione da 27 G e un microscopio sezionato.
- da 7 a 8 h dopo l'impollinazione (HAP), raccogliere il pistilo e posizionarlo sul nastro fronte/retro, quindi premere delicatamente con pinze per fissare il pistilo sul nastro (Figura 2A,A').
NOT: La maggior parte degli ovuli in un pistillo ricevono almeno un tubo di polline 10 HAP9. Se entrambi o uno qualsiasi dei spermatozoi dal primo tubo di polline non riescono a fertilizzare, un secondo tubo di polline sarebbe attratto dall'ovulo a causa del sistema di recupero della fecondazione10. Per analizzare la morfologia dei nuclei di sperma dal primo tubo di polline, si consiglia di completare la preparazione dell'ovulo da 10 HAP al più tardi. - Tagliare le estremità superiore e inferiore dell'ovaio utilizzando un ago di iniezione al microscopio dissetante (Figura 2B, B ').
- Sfoliare la parete dell'ovaio lungo entrambi i lati del replum (Figura 2C,C') spostando la punta dell'ago di iniezione.
NOT: Inserire l'ago di iniezione superficialmente per evitare la separazione dell'ovulo dal setto. - Evert la parete dell'ovaio utilizzando l'ago di iniezione (Figura 2D,D').
- Avvicinare la base del setto a cui sono collegate le ovuli e sollevarla con attenzione con le pinze (Figura 2E).
- Trasferire gli ovuli in una goccia d'acqua su un vetrino di scorrimento e coprire delicatamente con un vetro di copertura per l'osservazione al microscopio a fluorescenza (Figura 2E,E').
3. Microscopia
NOT: In questo protocollo, abbiamo utilizzato un microscopio a epifluorescenza dotato di un cubo filtro a fluorescenza (vedi Tabella deimateriali), una fotocamera digitale e il software di accompagnamento.
- Acquisire immagini di ovuli contenenti nuclei di sperma tom etichettati con mRFP utilizzando un obiettivo 20x o 40x e la fotocamera digitale attrezzata.
- Confermare il numero di nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP in un sacco embrionale.
NOT: Gli ovuli contenenti due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP possono essere inclusi nella dimensione della popolazione per l'analisi statistica. - Confermare la forma e la posizione di ogni nucleo sperma con etichetta mRFP in un sacco embrionale.
NOT: Immediatamente dopo essere stato rilasciato da un tubo di polline, un paio di nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP con densaviene vengono localizzati tra l'uovo e la cellula centrale. Un nucleo di spermam con etichetta mRFP dedensato rilevato a lato dell'estremità chalazal indica, ad esempio, la fecondazione cellulare centrale. Utilizzando una linea di marcatore di membrana gamet femminile adatta, come mostrato nella Figura supplementare 1, se la cellula sperma è sottoposta o meno alla plasmogamia (dopo la fusione della membrana ma prima della karyogamia) può essere monitorata chiaramente.
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Representative Results
Gli ovuli di un pistilio impollinato con DMP9KD/HTR10-mRFP sono stati raccolti a 7-8 HAP e osservati.
La maggior parte degli ovuli conteneva due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP con etichetta mRFP con etichetta e mOFST con etichetta durante la prima pagina (lato micropila) e le posizioni del nucleo delle cellule centrali (lato finale di Charazal), rispettivamente (Figura 3A), che indica la doppia fecondazione riuscita. Inoltre, sono stati osservati ovuli contenenti un nucleo spermatozoi con etichettamm ingenuo al nucleo cellulare centrale, oltre a un nucleo di sperma con etichetta mRFP con etichetta mRFP con etichetta al di fuori della cellula uovo (Figura 3B), indicando la singola fecondazione. In caso di doppia fecondazione non riuscita, due nuclei di spermatozoi con etichettam condensati sono stati osservati al confine della cellula uovo e della cellula centrale (Figura 3C), come in gcs1 cellule mutanti spermatozoi (Figura 3D)3,4 .
Nell'analisi utilizzando il polline DMP9KD/HTR10-mRFP, gli ovuli contenenti un singolo nucleo di spermacono con etichetta mRFP con etichetta mRFP con credenziali (Figura 4A) o tre o più nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP (Figura 4B) sono stati raramente osservati.
Figura 1: Boccioli di fiori adatti per l'emasculazione. (A) Un bocciolo di fiori allo stadio 11, che mostra pezzi dei petali in alto. (B-D) Un bocciolo di fiori in cui è stato rimosso i sepali (B) e petali (C) e che è stato poi evirato completamente (D). L'antera dehiscence non è ancora avvenuta. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Flusso di preparazione del campione di ovulazione. Le procedure sono indicate da illustrazioni (A-E) e fotografie (A'-E'). (A, A') Un pistilo è posto su nastro a due lati attaccato a un vetro scorrevole, e le sue estremità superiori e inferiori sono tagliate con un ago di iniezione. (B, B') La parete ovarica è incisa lungo entrambi i lati del replum. (C, C') Entrambi i lati delle pareti dell'ovaio vengono aperti, invertiti e pressati sul nastro per il fissaggio. (D, D') Il setto in cui gli ovuli sono collegati negli array è esposto. (E, E') Un'estremità del setto viene pizzicata e sollevata con pinze. Il setto con ovuli di collegamento viene trasferito a una goccia d'acqua su un bicchiere di scorrimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fenotipi di fecondazione giudicati dalla morfologia del segnale nucleare dello sperma in ovulo. (A) Doppia fecondazione di successo indicata da due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP decondensati (punte di freccia). (B) Singola fecondazione da parte di spermatozoi DMP9KD/HTR10-mRFP indicata da un nucleo di spermam con etichetta mRFP degradato (freccia) e un nucleo di spermam con etichetta mRFP con etichetta mRFP con credenziali con credenziali (freccia). (C) Doppia fecondazione doppie da parte di spermatozoi con etichetta mRFP con condensato da due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP con condensazione (frecce). (D) Un esempio di doppia fecondazione fallita da parte di spermatozoi gcs1HTR10-mRFP. Una linea marcatore in cui il nucleo delle cellule dell'uovo (EN) è etichettato con RFP. Due nuclei di spermatozoi condensati con etichettamm (frecce) vengono arrestati senza fecondazione a 18 HAP. (E) Illustrazione schematica di un ovulo. EC : cellula uovo, CELLA centrale, SC , cellule sinergiche, ES , sac embrionale, MP , micropirle, CH , chalazal end. Barre della scala: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Altro potenziale fenotipi di fecondazione. Gli ovuli di un pistilio impollinato con DMP9KD/HTR10-mRFP raramente contengono un singolo nucleo di spermatozoi con etichetta mRFP condensato (A), o tre o più nuclei di spermatozoi con etichettam con token mRFP con token mRFP (B) (frecce). Barre della scala: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare Figura 1: Nuclei di spermatozoi condensati a plasmogamia durante la fecondazione, giudicati per combinazione con una linea di marcatori della membrana plasmatica femminile. pFWA::GFP-PIP in cui viene visualizzata la membrana plasmatica cellulare centrale è stata utilizzata come genitore femmina (GFP). GFP-PIP etichetta anche le membrane endo12. L'ovulo contiene due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP condensati (frecce; RFP). Il segnale RFP sul lato finale del charazal (freccia) è mostrato nella cella centrale (Merge), indicando che il nucleo dello sperma è in plasmogamia (dopo la fusione della membrana gameta, ma prima del karyogamy). Il pannello a destra è un ingrandimento dell'area circondata da linee tratteggiate nell'immagine unita. Un'area vuota contrassegnata da un asterisco corrisponde alla posizione del nucleo della cella centrale. La linea tratteggiata indica il contorno della cella centrale rivolta verso la cellula uovo. Barra della scala: 20 m. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Etichette HTR10-mRFP cromatina paterna (cioè, visualizza i nuclei delle cellule spermatiche), e la dinamica nella doppia fecondazione sono state segnalate7. Immediatamente dopo il rilascio da un tubo di polline, i nuclei di spermatozoi etichettati con etichetta HTR10-mRFP sono ancora condensati. Tuttavia, ciascuno dei nuclei di sperma viene decondenato dopo la fusione con un nucleo gameti femminile fecondato a karyogamy tre o quattro ore dopo la fusione della membrana gamete7. Gli spermatozoi non fecondati rimangono condensati, come mostrato in un sacco embrionale in cui gli spermatozoi gcs1 vengono arrestati senza fecondazione (Figura 3D). Di solito, quando il fertile HTR10-mRFP viene utilizzato come genitore polline, 57,9% - 17,8% (media s.d.; n - 16 pistil) di ovuli in un pistilo a 7-8 HAP contengono due nuclei di spermam con etichettam, e quasi tutti i segnali (97,2%) sono decondensati, che riflettono la doppia fecondazione riuscita (un modello di segnale simile è mostrato nella Figura 3A). Nel caso di DMP9KD/HTR10-mRFP, sono stati osservati ovuli contenenti due nuclei di sperm con etichetta mRFP ad una frequenza simile a quella di HTR10-mRFP, ma il 17,6% di essi ha mostrato la fecondazione singola6. Abbiamo adottato la dinamica HTR10-mRFP per l'osservazione di un gran numero di ovuli in condizioni di invivo utilizzando un microscopio a epifluorescenza. Il protocollo è semplice e veloce, che consente la raccolta di dati sufficienti per la prova statistica. Utilizzando questo protocollo come prima istanza, il significato della fecondazione singola della cellula centrale da parte di spermatozoi DMP9KD/HTR10-mRFP è stato dimostrato6.
Sulla base delle differenze morfologiche dei nuclei di spermatozoi etichettati con HTR10-mRFP derivati da un tubo di polline, i modelli di fecondazione sono classificati in tre fenotipi: (1) fecondazione doppia di successo, che è caratterizzata da due decondensati Nuclei spermatozoi etichettati con HTR10-mRFP (Figura3A); (2) fecondazione singola, che presenta un nucleo con etichetta con condensato con etichetta HTR10 con etichetta MRFP e un nucleo di spermatozoi con etichetta HTR10-mRFP degradato (Figura3B); e (3) fallita doppia fecondazione, che ha due nuclei con etichetta HTR10 con etichetta MRFP con credenziali (Figura 3C).
Devono essere prese in considerazione altre possibili cause di fenotipi (2) e (3). È stato riferito che gli spermatozoi iniziano rispettivamente la plasmogamia con una cellula uovo ocentrale alcuni minuti dopo essere stati rilasciati in un sacco embrionale in condizioni di coltura vitro semi-in-in-in,11 . Inoltre, esiste un lasso di tempo di pochi minuti tra la prima e la seconda fecondazione, anche se non vi è alcuna preferenza per l'ordine di fecondazione della cellula uovo e della cellula centrale11. Pertanto, una coppia di nuclei di spermatozoi condensati e decondenati nel fenotipo (2) potrebbe indicare un ritardo temporale tra le fecondazioni invece di una singola fecondazione. Per confermare l'insorgenza di una singola fecondazione a una frequenza significativa nel fenotipo (2), è necessario esaminare un numero sufficiente di campioni sufficienti per l'analisi statistica. Fenotipo (3), che ha due nuclei di spermaconi condensati (Figura 3C), potrebbe riflettere un periodo di immobilità delle cellule spermatozoi prima della fusione della membrana plasmatica12 o il periodo tra la plasmogamia e il karyogamy. Pertanto, due nuclei di sperma condensati a 7-8 HAP non riflettono pienamente il "fallimento" della doppia fecondazione ed è necessario osservare gli ovuli in un secondo momento dopo l'impollinazione per valutare il successo o il fallimento della doppia fecondazione. A questo proposito, si raccomanda l'osservazione degli ovuli al 16-18 haP, poiché la maggior parte degli ovuli avrebbe completato la doppia fecondazione con gli spermatozoi consegnati dal primo tubo di polline, e i segnali HTR10-mRFP di nuclei di spermatozoi non fecondati giorno dell'impollinazione, come mostrato nella Figura 3D.
Raramente è stato rilevato un modello di nucleo di sperma con etichetta l'HTR10-mRFP (Figura 4A), che era probabilmente dovuto alla rapida scomparsa di un altro segnale paterno di HTR10-mRFP nel gamete femminile fecondato a seguito di una singola fecondazione. In questa analisi, tre o più nuclei di spermatozoi con etichetta HTR10-mRFP sono stati rilevati anche come un caso raro (Figura 4B), a causa dell'accettazione del secondo tubo di polline da parte del sistema di recupero della fecondazione10. In questo protocollo, questi casi sono stati esclusi dai dati, perché tracciare i comportamenti di due spermatozoi derivati da un tubo di polline è fondamentale per una valutazione accurata.
Poiché la polarità per le posizioni dei gameti femminili in un sacco embrionale è ben regolata (cioè, la cellula uovo e la cellula centrale si differenziano rispettivamente sul lato micropiglar e sul lato chalazal), che la femmina gamete sta fecondando può essere giudicata dal relativo posizioni dei nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP. Tuttavia, c'è una limitazione nel distinguere tra stati non fecondati e plasmogamy, perché entrambi gli stati sono indicati dal segnale dei nuclei di sperma condensati. Per valutare con precisione se la plasmogamia dopo la fusione della membrana del gamete si è verificata o meno quando i nuclei dello sperma sono condensati, è necessario utilizzare linee di pennarele femminili di gamete, come riportato da Takahashi et al. (2018)6. Ad esempio, quando una pianta pFWA::GFP-PIP 12 in cui è stata visualizzata la membrana plasmatica della cellula centrale è stata utilizzata come genitore femminile, è chiaro che una cellula sperma fusa con la cella centrale era in plasmogamia (supplementari Figura 1 ).
In sintesi, il nostro protocollo qui descritto può essere utilizzato per la valutazione statistica del successo o del fallimento della fecondazione in ogni gamete femmina. Anche se l'impiego del marcatore della membrana plasmatica femminile è necessario per giudicare la plasmogamia, il nostro metodo è utile per l'analisi funzionale del regolatore di fecondazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (DA JP17H05832 a T. I.) e dal finanziamento del Programma di Promozione della Ricerca sulle Scienze Molecolari delle Piante Petrolchimiche dell'Università di Chiba (Giappone).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
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