Summary
हम एक epifluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर Arabidopsis डबल निषेचन में शुक्राणु परमाणु आकृति विज्ञान के आधार पर सफल या असफल निषेचन निर्धारित करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन.
Abstract
फूल पौधों 'डबल निषेचन' कहा जाता है, जिसमें शुक्राणु कोशिकाओं में से प्रत्येक ठीक एक अंडा सेल या एक केंद्रीय सेल के साथ फ्यूज एक अद्वितीय यौन प्रजनन प्रणाली है। इस प्रकार, दो स्वतंत्र निषेचन की घटनाएं लगभग एक साथ होती हैं। निषेचित अंडा कोशिका और केंद्रीय कोशिका क्रमशः युग्मनज और एंडोस्पर्म में विकसित होती हैं। इसलिए, आगामी बीज विकास के लिए दोहरे निषेचन का सटीक नियंत्रण आवश्यक है। डबल निषेचन मादा युग्मोद्भिज (भ्रूण थैली) में होता है, जो गहराई से छिपा हुआ है और मोटी अंडाशय और अंडाशय के ऊतकों के साथ कवर किया जाता है। इस pistil ऊतक निर्माण अवलोकन और डबल निषेचन का विश्लेषण काफी मुश्किल बना देता है और वर्तमान स्थिति में डबल निषेचन के तंत्र के बारे में कई सवाल अनुत्तरित रह बनाया है. निषेचन नियामक के लिए एक संभावित उम्मीदवार के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए, निषेचन के phenotypic विश्लेषण महत्वपूर्ण है. Arabidopsis thalianaमें निषेचन के पूरा होने का न्याय करने के लिए, फ्लोरोसेंट संकेतों लेबलिंग शुक्राणु नाभिक के आकार संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है। एक शुक्राणु कोशिका जो निषेचित करने में विफल रहती है, मादा युग्मकों के बाहर एक संघनित फ्लोरोसेंट संकेत द्वारा इंगित की जाती है, जबकि एक शुक्राणु कोशिका जो सफलतापूर्वक निषेचित होती है, मादा युग्मक ों के साथ कर्मायोगी के कारण एक विसंधित संकेत द्वारा इंगित की जाती है। यहाँ वर्णित विधि vivo स्थितियों में सफल या विफल निषेचन निर्धारित करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
फूल वाले पौधे दोहरे निषेचन के माध्यम से बीजों का उत्पादन करते हैं, एक प्रक्रिया जो गेमेट प्लाज्मा झिल्ली1,2 पर स्थानीय प्रोटीनों के बीच बातचीत द्वारा सीधे नियंत्रित होतीहै. फूल संयंत्र पुरुष युग्मकों, शुक्राणु कोशिकाओं की एक जोड़ी, पराग में विकसित. परागण के बाद बढ़ता है कि मादा युग्मकों, एक अंडा कोशिका और एक केंद्रीय कोशिका है, जो एक भ्रूण थैली में विकसित करने के लिए शुक्राणु कोशिकाओं की एक जोड़ी बचाता है. पुरुष और महिला युग्मकों से मिलने के बाद, युग्मक सतह पर प्रोटीन डबल निषेचन को पूरा करने के लिए मान्यता, लगाव, और संलयन को बढ़ावा देते हैं। पिछले अध्ययनों में, पुरुष gamete झिल्ली प्रोटीन सामान्य सेल विशिष्ट 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 और GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 युग्मक संलयन में शामिल निषेचन नियामकों के रूप में पहचान की गई और अनुलग्नक, क्रमशः. हमने हाल ही में एक पुरुष युग्मक-विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन की पहचान की है, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), युग्मक बातचीत में शामिल एक निषेचन नियामक के रूप में. हमने पाया कि DMP9 अभिव्यक्ति की कमी के परिणामस्वरूप ए थालियाना6में डबल निषेचन के दौरान अंडे की कोशिका निषेचन में महत्वपूर्ण बाधा आती है.
के रूप में डबल निषेचन एक भ्रूण थैली में होता है, जो एक अंडाणु है कि आगे अंडाशय ऊतक के साथ लपेटा जाता है में एम्बेडेड है, यह निरीक्षण और डबल निषेचन प्रक्रियाओं की स्थिति का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है. इस कारण से, वहाँ अभी भी कई अस्पष्ट अंक है कि डबल निषेचन नियंत्रण के पूरे तंत्र की एक पूरी समझ में बाधा हैं. विवो परिस्थितियों में डबल निषेचन के दौरान युग्मकों के व्यवहार का पता लगाने के लिए अवलोकन तकनीकों की स्थापना निषेचन नियामकों के लिए संभावित उम्मीदवारों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अपरिहार्य है। हाल के अध्ययनों से मार्कर लाइनों जहां gamete subcellular संरचनाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल रहे हैं मिले हैं. इस लेख में, हम डबल निषेचन कि कृत्रिम रूप से परागण pistils से व्युत्पन्न एक भ्रूण थैली में हुई है अवलोकन के लिए एक सरल और त्वरित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. शुक्राणु कोशिका नाभिक मार्कर लाइन HTR10-mRFP7का उपयोग करना, प्रत्येक महिला युग्मक के निषेचन राज्य शुक्राणु परमाणु संकेत आकृति विज्ञान के आधार पर भेदभाव किया जा सकता है. निषेचन में शुक्राणु नाभिक के ऐसे रूपात्मक परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित करने वाले हमारा प्रोटोकॉल सांख्यिकीय प्रमाण के लिए पर्याप्त मात्रा में डेटा प्राप्त कर सकता है। HTR10-mRFP पृष्ठभूमि के साथ एक DMP9-knockdownलाइन (DMP9KD/HTR10-mRFP) पुरुष पौधों के रूप में इस्तेमाल किया गया था एक एकल निषेचन पैटर्न दिखाने के लिए. प्रोटोकॉल अन्य निषेचन नियामकों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए भी उपयुक्त है।
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Protocol
1. कृत्रिम परागण
नोट: प्रक्रिया शुरू करने से पहले, नंबर 5 बल की एक जोड़ी की आवश्यकता है।
- विकास कक्ष में 16-h प्रकाश/8-h अंधेरे चक्र के अंतर्गत 22 डिग्री सेल्सियस पर ए थालियाना (कोल-0) ग्रो करें।
नोट: कक्षीय कलियों के विकास को बढ़ावा देने के लिए कैंची से पहले विकसित फूल डंठल को काटें और निकालें। जोरदार रूप से उगने वाले पौधे (पहले डंठल काटने के 2-3 सप्ताह बाद; पौधों की ऊँचाई लगभग 25 सेमी) विश्लेषण के लिए उपयुक्त होती है। - सेक्युल (चित्र 1ख) को हटा दें , (चित्र1ग) और चरण 118 (चित्र 1क) में फूलों की कलियों की संख्या 5 बलका उपयोग करके (चित्र 1D) को हटा दें। शीर्ष पर देखा पंखुड़ियों के टुकड़े के साथ बड सबसे अच्छा है.
नोट: एक उपयुक्त महिला gamete मार्कर लाइन का प्रयोग करें. इस प्रोटोकॉल में, हम महिला माता पिता के रूप में एक जंगली प्रकार के पौधे का इस्तेमाल किया. - emasculation के बाद पंद्रह से अठारह घंटे, एक DMP9KD/HTR10-mRFP फूल के stamen ले चरण 138 बल के साथ फिलामेंट pinching द्वारा.
- परागण करने के लिए, धीरे एक emsculated pistil के कलंक एक dehiscent anther के साथ कई बार पैट.
2. अवलोकन के लिए Ovule की तैयारी
नोट: निम्नलिखित मदों की आवश्यकता है: डबल पक्षीय टेप संलग्न के साथ एक स्लाइड ग्लास, नंबर 5 forceps, एक 27 जी इंजेक्शन सुई, और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप.
- 7 से 8 ज परागण (HAP) के बाद, पिस्तील इकट्ठा करने और इसे दो तरफा टेप पर रखें, फिर टेप पर पिस्टिल को ठीक करने के लिए बल के साथ धीरे से दबाएं (चित्र 2A, A')।
नोट: पिस्टिल में अधिकांश अंडाणुकमक में कम से कम एक पराग नलिका 10 एच ए पी 9 प्राप्त करतीहै. यदि पहली पराग नली से शुक्राणु कोशिकाओं में से कोई एक निषेचन करने में असफल हो जाती है, तो निषेचन वसूली प्रणाली10के कारण अंडाणु द्वारा एक दूसरी पराग नलिका आकर्षित होगी। पहले पराग ट्यूब से शुक्राणु नाभिक आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए, नवीनतम पर 10 एचएपी द्वारा अंडाणु तैयारी को पूरा करने की सिफारिश की जाती है। - अंडाशय के ऊपरी और निचले सिरों को विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के नीचे एक इंजेक्शन सुई का उपयोग करके काट दिया जाता है (चित्र 2 ख,ख))।
- इंजेक्शन सुई की नोक को ले जाकर रिप्लम के दोनों ओर अंडाशय की दीवार को काट दें (चित्र 2 ब्,सी)।
नोट: पट से अंडाशय जुदाई को रोकने के लिए इंजेक्शन सुई को उथले रूप में डालें। - इंजेक्शन सुई का उपयोग करके अंडाशय की दीवार का उपयोग करते हुए एवरट (चित्र 2डी,डी')।
- पट के आधार को चुटकी लें जिससे अंडाशय जुड़े हुए हैं, और इसे बलप्स के साथ सावधानी से ऊपर उठाएं (चित्र 2ई)।
- एक स्लाइड ग्लास पर पानी की एक बूंद में ovules स्थानांतरण, और धीरे एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए एक कवर गिलास के साथ कवर (चित्र 2E, ई).।
3. माइक्रोस्कोपी
नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम एक फ्लोरोसेंट फिल्टर घन से लैस एक epifluorscence माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया (सामग्री की मेजदेखें), एक डिजिटल कैमरा, और साथ सॉफ्टवेयर.
- एक 20x या 40x उद्देश्य लेंस और सुसज्जित डिजिटल कैमरे का उपयोग कर mRFP के साथ लेबल शुक्राणु नाभिक युक्त ovules की छवियों का अधिग्रहण.
- एक भ्रूण थैली में mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक की संख्या की पुष्टि करें.
नोट: दो mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक युक्त Ovules सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए जनसंख्या के आकार में शामिल किया जा सकता है. - एक भ्रूण थैली में प्रत्येक mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक के आकार और स्थिति की पुष्टि करें.
नोट: पराग नली से निकलने के तुरंत बाद, अंडे और केंद्रीय कोशिका के बीच संघनित एमआरएफपी-लेबल शुक्राणु नाभिकों की एक जोड़ी स्थानीयकृत होती है। एक विसंघनmRFP लेबल शुक्राणु नाभिक chalazal अंत के पक्ष में पाया केंद्रीय कोशिका निषेचन इंगित करता है, उदाहरण के लिए. एक उपयुक्त महिला gamete झिल्ली मार्कर लाइन का उपयोग करके, के रूप में पूरक चित्र 1में दिखाया गया है, चाहे या नहीं शुक्राणु कोशिका प्लाज्मोगैमी के दौर से गुजर रहा है (मेम्ब्रेन संलयन के बाद लेकिन karyogamy से पहले) स्पष्ट रूप से नजर रखी जा सकती है.
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Representative Results
DMP9KD/HTR10-mRFP के साथ एक pistil परागण से Ovules 7-8 HAP पर एकत्र किए गए और मनाया गया.
अधिकांश अंगुलियों में अंडे की कोशिका (माइक्रोपाइलर साइड) में दो विसंधित एमआरएफपी-लेबल शुक्राणु नाभिक तथा केंद्रीय कोशिका (चराजल अंत पक्ष) नाभिक स्थिति क्रमशः (चित्र3क)होती है जो सफल द्वि निषेचन का संकेत देती है। इसके अतिरिक्त, केंद्रीय कोशिका नाभिक पर एक विसंधित एमआरएफपी-लेबल शुक्राणु नाभिक युक्त अंडा कोशिका के बाहर एक संघनित एमआरएफपी-लेबल शुक्राणु नाभिक (चित्र 3 ख) देखा गया, जो एकल निषेचन का संकेत देता है। असफल डबल निषेचन के मामले में, दो संघनित एमआरएफपी लेबल शुक्राणु नाभिक अंडे की कोशिका की सीमा पर और केंद्रीय कोशिका (चित्र 3 C) के रूप में देखा गया , के रूप में gcs1 उत्परिवर्ती शुक्राणु कोशिकाओं (चित्र 3 डी)3,4 .
DMP9KD/HTR10-mRFP पराग का उपयोग करते हुए विश्लेषण में, एक संघनित MRFP लेबल शुक्राणु नाभिक युक्त ovules (चित्र 4A) या तीन या अधिक MRFP लेबल शुक्राणु नाभिक (चित्र 4B) शायद ही कभी देखा गया.
चित्रा 1: फूल कलियों emasculation के लिए उपयुक्त. (ए) चरण 11 में एक फूल की कली, शीर्ष पर पंखुड़ियों के टुकड़े दर्शाती है। (बी-डी) एक फूल की कली जिसमें सेपल (बी) और पंखुड़ियों (सी) को हटा दिया गया था और उसके बाद उसे पूरी तरह से (डी) निकाला गया था . अभी तक कोई निष्कर्ष नहीं आया है। स्केल बार - 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: अंडाशय नमूना तैयारी का प्रवाह। प्रक्रियाओं चित्र (ए-ई) और तस्वीरों (ए '- ई ' द्वारा दिखाए जाते हैं ) . (एक, ए') एक पिस्टिल एक स्लाइड ग्लास से जुड़ी दो तरफा टेप पर रखा गया है, और इसके ऊपरी और निचले सिरों को इंजेक्शन सुई के साथ काट दिया जाता है। (बी, बी ') अंडाशय की दीवार रिप्लम के दोनों ओर incised है। (सी, सी ') अंडाशय की दीवारों के दोनों ओर खुले, उत्क्रमित, और फिक्सिंग के लिए टेप पर दबाया जाता है। (डी, डी ') पट जहां ओड्यूल सरणियों में जुड़े होते हैं, उजागर होते हैं। (ई, ई') पट का एक सिरा चुटकी ले रहा है और संदंश के साथ उठा लिया जाता है। अंडाशय को जोड़ने वाला पट स्लाइड काँच पर पानी की एक बूंद में स्थानांतरित हो जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र3: शुक्राणु परमाणु संकेत आकारिकी द्वारा निर्णय लिया निषेचन phenotypes अंडाणु में। (ए) सफल द्वि निषेचन दो विसंवहित एमआरएफपी-लेबल शुक्राणु नाभिक (एरोहेड) द्वारा इंगित किया गया है। (B) DMP9KD/HTR10-mRFP शुक्राणु कोशिकाओं द्वारा एकल निषेचन एक विसंग्रत MRFP-लेबल शुक्राणु नाभिक (एरोहेड) और एक संघनित MRFP लेबल शुक्राणु नाभिक (तीर) द्वारा इंगित किया गया है। (ग) दो संघनित एमआरएफपी-लेबल शुक्राणु नाभिक (एरो) द्वारा इंगित DMP9KD/HTR10-mRFP शुक्राणु कोशिकाओं द्वारा असफल डबल निषेचन। (घ) जीसीएस1एचटीआर10-एमआरएफपी शुक्राणु कोशिकाओं द्वारा असफल डबल निषेचन का एक उदाहरण। एक मार्कर लाइन जहां अंडा कोशिका नाभिक (एन) को आरएफपी के साथ लेबल किया जाता है। दो संघनित MRFP लेबल शुक्राणु नाभिक (तीर) 18 एचएपी पर निषेचन के बिना गिरफ्तार कर रहे हैं. (ई) एक अंडाणु का योजनाबद्ध चित्रण। ईसी - अंडा सेल, सीसी - केंद्रीय सेल, अनुसूचित जाति - synergid कोशिकाओं, ES - भ्रूण थैली, सांसद - micropyle, CH] chalazal अंत. स्केल बार $ 20 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: अन्य संभावित निषेचन phenotypes. DMP9KD/HTR10-mRFP के साथ परागण एक pistil से Ovules शायद ही कभी एक संघनित MRFP लेबल शुक्राणु नाभिक (ए ), या तीन या अधिक संघनित MRFP लेबल शुक्राणु नाभिक (बी ) (तीर) होते हैं। स्केल बार $ 20 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक चित्र 1: निषेचन के दौरान प्लाज्मोगामी में संघनित शुक्राणु नाभिक, एक महिला प्लाज्मा झिल्ली मार्कर लाइन के साथ संयोजन द्वारा न्याय. pFWA::GFP-PIP जहां केंद्रीय सेल प्लाज्मा झिल्ली कल्पना की है महिला माता पिता के रूप में इस्तेमाल किया गया था (GFP). GFP-PIP भी एंडो झिल्ली12लेबल . अंडाणु में दो संघनित एमआरएफपी-लेबल शुक्राणु नाभिक (तीर) होते हैं; आरएफपी)। charazal अंत पक्ष (तीर) पर आरएफपी संकेत केंद्रीय सेल (मर्ज) में दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि शुक्राणु नाभिक प्लाज्मोगैमी में है (गेमेट झिल्ली संलयन के बाद, लेकिन karyogamy से पहले). दाईं ओर पैनल विलयित छवि में डैश्ड लाइनों से घिरे क्षेत्र का आवर्धन है। तारांकन द्वारा चिह्नित एक रिक्त क्षेत्र केंद्रीय कोशिका नाभिक की स्थिति से मेल खाता है। डैश्ड रेखा अंडे की कोशिका का सामना कर रहे केंद्रीय कोशिका की रूपरेखा को इंगित करती है। स्केल बार $ 20 डिग्री मी. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
HTR10-mRFP लेबल पैतृक क्रोमैटिन (यानी, शुक्राणु कोशिका नाभिक कल्पना), और डबल निषेचन में गतिशीलता7सूचित किया गया है. एक पराग ट्यूब से रिहाई के तुरंत बाद, HTR10-mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक अभी भी संघनित कर रहे हैं. तथापि, प्रत्येक शुक्राणु नाभिक को युग्मक झिल्ली संलयन7के बाद तीन से चार घंटे के बाद करयोगामी में निषेचित मादा युग्मक नाभिक के साथ विलय करने पर विसंग्त किया जाता है। अनिषेचित शुक्राणु कोशिकाएं संघनित रहती हैं, जैसा कि भ्रूण की थैली में दिखाया गया है जिसमें बीज1 शुक्राणु कोशिकाओं को निषेचन के बिना गिरफ्तार किया जाता है (चित्र 3डी) । आमतौर पर, जब उपजाऊ HTR10-mRFP पराग माता पिता के रूप में प्रयोग किया जाता है, 57.9% - 17.8% (मतलब ] s.d.; n ] 16 pistils) एक pistil में ovules के 7-8 HAP दो mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक संकेत होते हैं, और लगभग सभी संकेतों (97.2%) विसंवहित हैं, सफल द्वि निषेचन को दर्शाती है (एक समान संकेत पैटर्न चित्र 3कमें दिखाया गया है)। DMP9KD/HTR10-mRFPके मामले में, दो mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक युक्त ovules HTR10-mRFPकी एक समान आवृत्ति पर मनाया गया, लेकिन उनमें से 17.6% एकल निषेचन दिखाया6. हमने एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विवो स्थितियों में बड़ी संख्या में ओव्युलरों के प्रेक्षण के लिए एचटीआर10-एमआरएफपी गतिशीलता को अपनाया। प्रोटोकॉल सरल और त्वरित है, जो सांख्यिकीय सबूत के लिए पर्याप्त डेटा के संग्रह में सक्षम बनाता है. पहली उदाहरण के रूप में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, DMP9KD/HTR10-mRFP शुक्राणु कोशिकाओं द्वारा केंद्रीय सेल के एकल निषेचन का महत्व6साबित हुआ था.
एक पराग ट्यूब से व्युत्पन्न HTR10-mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक के रूपात्मक अंतर के आधार पर, निषेचन पैटर्न तीन phenotypes में वर्गीकृत कर रहे हैं: (1) सफल डबल निषेचन, जो दो decondensed द्वारा विशेषता है HTR10-mRFP-लेबल शुक्राणु नाभिक (चित्र 3A); (2) एकल निषेचन, जो एक संघनित HTR10-mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक और एक decondensed HTR10-mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक सुविधाएँ (चित्र 3B); और (3) असफल डबल निषेचन, जो दो संघनित HTR10-mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक है (चित्र 3C) है.
फीनोटाइप के अन्य संभावित कारणों (2) और (3) पर विचार किया जाना चाहिए। यह सूचित किया गया है कि शुक्राणु कोशिकाएं क्रमशः एक अंडा कोशिका या केंद्रीय कोशिका के साथ अर्ध-इन इन विट्रो संस्कृति की स्थिति11के तहत भ्रूण की थैली में छोड़े जाने के कई मिनट बाद प्लाज्मोगामी शुरू करती हैं। इसके अलावा, पहले और दूसरे निषेचन के बीच कुछ मिनट का समय अंतराल मौजूद है, हालांकि अंडा सेल और केंद्रीय सेल11के निषेचन के क्रम के लिए कोई प्राथमिकता नहीं है। अतः फीनोटाइप (2) में संघनित और विसंघीकृत शुक्राणु नाभिकों की एक जोड़ी एकल निषेचन के स्थान पर निषेचन के बीच एक समय अंतराल का संकेत दे सकती है। फीनोटाइप (2) में एक महत्वपूर्ण आवृत्ति पर एकल निषेचन की घटना की पुष्टि करने के लिए, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूनों की संख्या की जांच की जानी चाहिए। Phenotype (3), जिसमें दो संघनित शुक्राणु नाभिक है (चित्र 3C),प्लाज्मा झिल्ली संलयन12 या प्लाज्मोगोमी और कर्मागति के बीच की अवधि से पहले शुक्राणु कोशिकाओं की गतिहीनता की अवधि को प्रतिबिंबित कर सकता है. इसलिए, 7-8 HAP पर दो संघनित शुक्राणु नाभिक पूरी तरह से डबल निषेचन की विफलता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, और डबल निषेचन की सफलता या विफलता का आकलन करने के लिए परागण के बाद बाद के समय में अंडाणुओं का निरीक्षण करना आवश्यक है। इस संबंध में, 16-18 HAP पर ovule अवलोकन की सिफारिश की है, क्योंकि अंडाणुके के अधिकांश पहले पराग ट्यूब द्वारा दिया शुक्राणु कोशिकाओं के साथ डबल निषेचन पूरा हो जाएगा, और HTR10-mRFP unfertilized शुक्राणु नाभिक के संकेत अगले तक रहेगा परागण के दिन, के रूप में चित्र 3 डीमें दिखाया गया है|
एकल संघनित HTR10-mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक का एक पैटर्न (चित्र 4A) शायद ही कभी पता चला था, जो एक निषेचन का एक परिणाम के रूप में निषेचित महिला gamete में एक और पैतृक HTR10-mRFP संकेत के त्वरित गायब होने के कारण होने की संभावना थी. इस विश्लेषण में, निषेचन वसूली प्रणाली10द्वारा दूसरे पराग ट्यूब स्वीकृति के कारण तीन या अधिक HTR10-mRFP-लेबल शुक्राणु नाभिक का भी एक दुर्लभ केस (चित्र 4B) के रूप में पाया गया. इस प्रोटोकॉल में, इन मामलों को डेटा से बाहर रखा गया था, क्योंकि एक पराग नली से व्युत्पन्न दो शुक्राणु कोशिकाओं के व्यवहार अनुरेखण सटीक आकलन के लिए महत्वपूर्ण है.
चूंकि एक भ्रूण थैली में मादा युग्मकों की स्थिति के लिए ध्रुवता अच्छी तरह से विनियमित है (यानी, अंडा कोशिका और केंद्रीय कोशिका क्रमशः माइक्रोपाइलर और चालाज़ल पक्ष में अंतर करती है), जो मादा युग्मक निषेचन है, संबंधित द्वारा न्याय किया जा सकता है एमआरएफपी लेबल शुक्राणु नाभिक की स्थिति. हालांकि, unfertilized और प्लाज्मोग्मोगी राज्यों के बीच भेद करने में एक सीमा है, क्योंकि दोनों राज्यों संघनित शुक्राणु नाभिक संकेत द्वारा संकेत कर रहे हैं. ठीक मूल्यांकन करने के लिए कि क्या gamete झिल्ली संलयन के बाद प्लाज्मोगैमी हुआ है या नहीं जब शुक्राणु नाभिक संघनित कर रहे हैं, यह महिला gamete झिल्ली मार्कर लाइनों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, के रूप में Takahashi एट अल द्वारा रिपोर्ट (2018)6. उदाहरण के लिए, जब एक pFWA::GFP-PIP संयंत्र12 जिसमें केंद्रीय कोशिका प्लाज्मा झिल्ली कल्पना की गई थी एक महिला माता पिता के रूप में इस्तेमाल किया गया था, यह स्पष्ट है कि एक शुक्राणु कोशिका केंद्रीय सेल के साथ जुड़े प्लाज्मोगामी में था (पूरक चित्रा 1 ).
संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित सफलता या प्रत्येक महिला gamete में निषेचन की विफलता के सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि महिला प्लाज्मा झिल्ली मार्कर के रोजगार के लिए प्लाज्मोगामी न्यायाधीश की आवश्यकता है, हमारी विधि निषेचन नियामक के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम को जापान सोसायटी द्वारा विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया था KAKENHI अनुदान (JP17H05832 से टी.आई.) और Phytochemical संयंत्र आणविक विज्ञान पर सामरिक प्राथमिकता अनुसंधान संवर्धन कार्यक्रम से वित्त पोषण द्वारा, चिबा विश्वविद्यालय (जापान).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
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