Summary
GPCR-β-阻尼相互作用是GPCR药物发现中的一个新兴领域。精确、精确和易于设置的方法对于监控生活系统中的这种相互作用是必要的。我们展示了一种结构补体测定,以监测实时活细胞中的GPCR-β-阻尼蛋白相互作用,并可扩展到任何GPCR。
Abstract
G-蛋白耦合受体(GPCRs)和β-失能素之间的相互作用是具有非常重要生理影响的重要过程。目前,在GPCR药物发现领域,特别是在GPCR偏置症研究期间,新药物的表征与β-逮捕蛋白和其他细胞蛋白的相互作用具有极其宝贵的价值。在这里,我们展示了一种新型结构补体测定的应用,以准确监测实时生命系统中的受体-β-逮捕素相互作用。该方法简单、准确,易于扩展到任何感兴趣的GPCR,而且它的优点是克服了由于每个向量系统中存在低表达启动子而导致的非特定交互。这种结构补加测定提供了关键特性,能够准确、准确地监测受体-β-失素相互作用,使其适用于研究任何GPCR系统的偏置性痛苦以及GPCR c-终点的磷酸化由不同的GPCR-激酶(GRKs)和后翻译修改的arrestins,稳定或稳定受体-β-逮捕复合物的代码。
Introduction
GPCRs代表了市场上近35%的当前药物的目标1、2,而对其药理学的清晰了解对于开发新型治疗药物3至关重要。GPCR药物发现的关键方面之一,特别是在偏置激动剂的发育过程中,是新配体对受体-β-逮捕素相互作用4和β-逮捕蛋白与其他细胞蛋白相互作用的表征,例如作为克拉特林5。
据记载,β-arrestin依赖信号在神经紊乱(如双相情感障碍、严重抑郁症和精神分裂症6)中起关键作用,在一些药物(如吗啡7)中也有严重的副作用。
目前用于监测这些相互作用的方法通常不代表研究中蛋白质的实际内源水平,在某些情况下,它们显示信号弱、光漂白,并且根据GPCR,建立8可能具有技术挑战性。这种新颖的结构补体测定使用低表达促进因子载体来模拟内源性生理水平,与目前的方法9相比,具有较高的灵敏度。使用这种方法,可以容易地描述Galanin受体-β-逮捕1/2和β-逮捕2-克拉林相互作用10。这种方法可以广泛用于任何特别感兴趣的GPCR,其中β-逮捕蛋白发挥关键的生理功能或其信号在某些疾病中相关。
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Protocol
1. 引性设计策略
- 设计引源,将感兴趣的基因引入 pBiT1.1-C [TK/LgBiT]、pBiT2.1-C [TK/SmBiT]、pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 矢量图。
- 选择这三个位点中至少一个作为定向克隆所需的两种唯一限制酶之一,因为存在一个帧内停止通子,该块子将多克隆位点分开,如图11所示。
- 如表1所示,将核苷酸序列纳入引物中,以编码表211中以红色显示的连结剂残留物。
- 对于 pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-C [TK/SmBiT] 矢量,请确保 5 + 底漆包含 ATG 孔和有效的科扎克共识序列 (GCCGCCACC)。
- 对于 pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 矢量,请确保 3 = 底漆包含停止科顿。
注:每个载体都含有HSV-TK启动子,以尽量减少非特异性关联,减少实验伪影,每个载体都有一个表达盒,用于细菌中的阿霉素耐药性。
2. PCR
- 设置并运行 PCR 反应,使用步骤 1 中设计的引物来放大感兴趣的基因的插入 DNA。使用高保真DNA聚合酶以尽量减少突变非常重要。
- 请按以下顺序制备 50 μL 的 PCR 反应。加入35.5 μL蒸馏水、5 μL 10x聚合酶缓冲液、5 μL dNTP混合物(每片2.5 mM)、1 μL质粒模板(200纳克/μL)、1.25 μL正向和反向底漆(10 μM)和1μL高保真聚合酶(5 U/μL)。
- 使用热循环器设置以下DNA扩增程序。
- 在95°C下变性5分钟。
- 在以下热循环中重复 25 次:95 °C 表示 30 秒,60°C 为 1 分钟,72°C 为 2 分钟/1 kbp 进行放大。
- 在 72°C 下运行最终扩展 10 分钟。
- 将样品在4°C的热循环器内保持。
注:强烈建议使用高保真聚合酶,以尽量减少点突变,尤其是长序列扩增过程中发生的突变。随着放大子的延长,DNA复制的准确性降低。对于 PCR 反应,根据寡核苷酸直接与 DNA 模板杂交的区域的熔融温度(而不是引物的所有序列)选择退火温度。
- PCR产品纯化
- 使用来自偏好12的制造商的套件将 PCR 产品与 PCR 反应的其余部分分离。PCR 产品现已准备好进行限制消化。
3. DNA消化
- 对于PCR产品消化准备50μL的消化反应如下。
- 使用 1.5 mL 管,加入 12 μL 蒸馏水。
- 加入5μL的10倍缓冲液,与两种限制性酶的最佳相容性。
- 从步骤 2.4 添加 30 μL PCR 产品
- 最后,加入每个限制性酶的1.5μL。
- 由涡旋短暂混合,在37.5°C孵育过夜。
- 对于受体质粒消化准备50μL的消化反应如下:
- 使用 1.5 mL 管,加入 23 μL 蒸馏水。
- 加入5μL的10倍缓冲液,与两种限制性酶的最佳相容性。
- 加入15 μL的受体质粒(200纳克/μL)。
- 加入每个限制性酶的1.5μL。
- 由涡旋短暂混合,在37.5°C孵育过夜。
注:使用3μg受体质粒,以便在DNA甘草凝胶纯化后获得足够的材料,这一点很重要。使用两种酶一夜之间留下DNA消化,以获得高克隆效率也与此有关。
4. 脱氧核糖核酸糖凝胶纯化和克隆
- 准备1%的甘蔗凝胶,运行消化的DNA质粒和插入,并继续削减相应的带。一旦相应的载体和插入带被纯化12,使用分光光度计确定DNA浓度。
- 执行DNA结扎,将插入物融合到受体质粒中。
- 准备总DNA约100纳克的结扎反应,包括50纳克的质粒载体。
- 设置受体质粒插入比约为1:3;它可以使用矢量插入计算器13计算。
- 并行设置负控件。例如,在没有任何插入的情况下,受体质粒DNA的结扎将提供有关有多少未消化或自解受体质粒的背景的信息。
5. 克隆的转换
- 将一管DH5®适合的细胞从冷冻室置于-80°C,并立即将其转移到冰上20分钟。
- 之后,服用55μL的DH5+能称量细胞,加入4μL的结扎反应,通过轻拂管在冰上储存45分钟进行混合。
- 将管子放在先前在42°C加热的水浴中,正好48秒,并立即将管子放回冰上3分钟。
- 加入600 μL的Luria Broth (LB) 介质,在37.5°C下加热,在200rpm下通过摇动孵育1小时。
- 将 200 μL 转移到含有阿霉素 100 μg/mL 的琼脂板中,然后轻轻铺在表面,液体大部分被吸收。
- 孵化板过夜,看殖民地第二天早上。插入板上的受体质粒应明显多于受体质粒单独板的菌落。
6. 成品质粒的分离
- 挑选3-10个单独的细菌菌落,并转移到含有阿霉素(100微克/mL)的1毫升的LB培养基中,孵育6小时。
- 取200μL的细菌悬浮液,并转移到5 mL的LB介质中,含有与步骤6.1相同的阿霉素浓度,并在37.5°C下孵育过夜,在200rpm下摇动。
- 使用微型制备DNA试剂盒纯化,使用5 mL的LB进行迷你制备DNA纯化,按照制造商说明14进行一夜生长。
- 为了识别成功的结扎,使用步骤 6.3 获得的 DNA 作为模板,在第一个 PCR 期间具有与第 2 节中相同的引物,以与第 2 节中相同的方式设置 PCR 反应。正克隆将产生具有相应大小的PCR产品。
- 在阳性克隆的大规模制备DNA纯化后,使用克隆步骤中使用的酶对500 ng的纯化DNA进行诊断限制消化,并在1%的角胶凝胶上运行消化产物。应该有两个波段:一个是矢量的大小,另一个是新插入的大小。
- 使用以下引种进行测序验证构造序列:前进 5' - aaggtgcggggcgcccac-3' 和反向 5' - gcattttttttttttttttttttt-3'。
注:当使用PCR复制DNA时,即使在使用高保真聚合酶时,在扩增过程中也总是有出错的可能性,因此对最终结构的测序非常重要。
7. 转染和蛋白质表达
- 在以前多L-流膜涂层的白色96孔板中,使用Dulbeco的改性Eagle的介质,辅以10%的胎儿牛血清、100 U/mL青霉素G和100微克/粒,在转染前一天以每孔2.5 x 104个细胞进行细胞播种。mL 链霉素。
- 仅使用 60 内孔,以尽量减少整个板材的热梯度和蒸发产生的边缘效应。将200μL的无菌蒸馏水加入36口外井,在井间空间内加入150μL,在37.5°C和CO2的5%下孵育过夜。
- 第二天早上使用总DNA的100纳克(每个构造50纳克)进行转染。
- 根据图2b设置四种不同的质粒组合(受体:β-逮捕素)。
- 对于每个质粒组合,使用每口井0.3 μL的脂质转染试剂,使用经过修饰的鹰最小基本介质用HEPES缓冲20μL。
- 在每个孔中加入20μL的脂质转染试剂-DNA混合物,将板圈混合10s。
- 在37.5°C和5%CO2孵育6小时后更换新鲜培养基。
- 在37.5°C和5%CO2下孵育板24小时。
8. 监测HEK293细胞中的受体-β-逮捕素1/2相互作用
- 吸气介质,并添加100 μL的改良鹰的最小基本介质缓冲与HEPES到每个井,让板稳定在RT10分钟。
- 通过将 1 卷 100x 基质与 19 卷 LCS 稀释缓冲液(20 倍稀释)11 相结合,制备furimazine 基板,创建 5x 库存,与细胞培养基体混合。
- 在每个井中加入25 μL的5倍毛利马津,然后轻轻混合在圆圈中10s。
- 测量发光 10 分钟,在 RT 处实现信号稳定。
注:通过使用此基线信号使每口井的响应正常化,将有助于减少因每孔镀层细胞数量差异、转染效率差异等而导致的变异性。一旦计算,平均从复制井的标准化反应为给定的药物治疗。 - 在经过修改的 Eagle 最小基本介质中准备 13.5x 配体溶液,该介质用 HEPES 缓冲。
- 对于在室温下进行 10 μL 13.5x 配体添加的实验,使用喷油器或多通道移液器添加化合物,并用手或使用轨道摇床(20 s 在 200 rpm 时)混合板。
- 对于在37.5°C下进行10μL13.5x配体添加的实验,使用喷油器使用仪器轨道摇床分配化合物和混合。如果不使用喷油器,请从灯具中取下板,加入配体,用手或使用轨道摇床(20 s 在 200 rpm 时)混合板。
注:在检测仪器中使用喷油器和摇床,以尽量减少与从灯具中取出板相关的温度波动。标准台式灯具可用于此测定。使用 0.25–2 s 的集成时间。
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Representative Results
使用此处介绍的程序,监测了典型GPCR和两种β-逮捕蛋白异体之间的相互作用。胰高血糖素类似肽受体(GLP-1r)结构是使用含有NheI和EcoRI酶限制性位点的引基体,并克隆到载体pBiT1.1-C[TK/LgBiT]和pBiT2.1-C[TK/SmBiT],而在β-阻尼的情况下,另外两个载体是在β-逮捕2和NheI和XhoI的情况下使用pBiT1-N[TK/LgBiT]和pBiT2.1-N[TK/SmBiT]在β-逮捕1的情况下使用酶抑制位BgIII和EcoRI。HEK293细胞在N-或C端接端使用GLP-1r-LgBiT/SmBiT和50 ng的β-阻尼素转染。筛选了四种不同的质粒组合(图3),选择了一种具有最高发光信号的组合进行进一步的实验(图4)。为了确定每个β-阻尼等形式招募的EC50值,使用GLP-1配体浓度的10μM、1μM、100 nM和1 nM执行剂量反应曲线(图4c)。剂量反应曲线是从动力学研究中每个浓度的最大反应中获得的(图4a,4b)。
图 1.GLP-1r-β-阻尼1/2结构补体测定中使用的载体多克隆位点的核苷酸序列。
为了开发GLP-1r-β-阻滞1/2系统的结构补充测定,有必要在C端用LgBiT和SmBiT标记GLP-1r和SmBiT,使用pBiT1.1-C[TK/LgBiT]和pBiT2.1-C[TK/SmBiT]的酶限制NheI和EcoRI向量。在β-逮捕1/2的情况下,他们还在C-和N-终端使用酶限制BglII/EcoRI对β-逮捕2和NheI/XhoI在四个载体上β-逮捕1标记LgBiT和SmBiT。所有载体均使用HSV-TK启动子,以尽量减少非特异性关联,减少实验伪影,每个载体都含有一个表达盒,用于细菌中的阿霉素耐药性。图像改编自参考文献 11。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.GPCR 的原理表示:β-阻尼1/2结构补体测定。
(a) GPCR:β-阻尼1/2结构补体测定在配体存在的情况下如何工作。(b) GPCR和带LgBiT或SmBiT标记的β-阻尼等异种的不同质粒组合的结构表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.GLP-1r/β-阻印剂定向筛查。
为了获得最高灵敏度,在转染后的24小时内,4种不同的质粒组合被表达。在几乎所有不同的质粒组合(a-c) 中检测到发光信号,只有一个 GLP-1r:β-阻尼定向 (d)。结果以重复进行的两个实验的均值 = S.E.M. 表示;在计算 S.E.M. 之前,每个副本都得到平均。箭头指示在10μM最终浓度下用GLP-1处理细胞的时间。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.GLP-1r-β-阻尼1/2相互作用是剂量依赖方式。
β-逮捕2(a)和β-逮捕1招募的剂量依赖性配体关系(b)。剂量反应曲线显示 GLP-1r (c ) 在 β-逮捕素1 和β-逮捕2之间不同的招募结果以重复进行的两个实验的均值 = S.E.M. 表示;在计算 S.E.M. 之前,每个副本都得到平均。箭头指示以相应浓度(10 μM、1 μM、100 nM、10 nM 和 1 nM,最终浓度)使用 GLP-1 处理细胞的时间。请点击此处查看此图的较大版本。
| 向量 | 使用酶限制 | 引种序列 |
| pBiT1.1-C [TK/LgbiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | 萨奇 | 5 = -XXXXXXXGAGCTCC(修订版 SI)-3 = |
| EcoRI | 5 = -XXXXXXXXGAATTCCC(修订版 SI)-3 = | |
| 肖伊 | 5 = -XXXXXXXXCCGAGCC(修订 SI)-3 = | |
| pBiT1.1-N [TK/LgbiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | 肖 | 5 = -XXXXXXXXCCGAGCGGT (SI)-3 = |
| 萨奇 | 5 = XXXXXXXXXGAGCTC股份公司(SI)-3 = | |
| EcoRI | 5 = -XXXXXXXXGAATTCA(SI)-3 = |
表 1.pBiT1.1和pBiT2.1载体链接器编码序列中不同限制性酶位点的引种序列。
SI = 兴趣序列;修订 SI = 兴趣序列的反向补充。根据参考资料11改编的表格。
| 向量 | 链接器序列 | 使用酶限制 | ||
| pBiT1.1-C [TK/LgbiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | SI-GlyAlaglnGlyAsnSerserserlyglyGlyGlyGlyGlyGlyLySerserserslyssersly-(LgbiT/SmbiT) | 萨奇 | ||
| SI-GlyAsnserlyserslyglyglyglyglyglyGlyGlyGlySlySersersly-(LgbiT/SmbiT) | EcoRI | |||
| Si-GlySerserlyglyglyglyglyglyglyGlyGlyGlyLyLySerserserlyserserslyslyserslyslyslyslyslyslysly-(LgbiT/SmbiT) | 肖伊 | |||
| pBiT1.1-N [TK/LgbiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | (LgbiT/Smbit)-格列瑟·格利格格利格格利格利格利格列·谢格利-SI | 肖伊 | ||
| (LgbiT/Smbit)-格列瑟·格利格格利格格利格列·格列格列·格列·格列·格列·格拉尔-格林-SI | 萨奇 | |||
| (LgbiT/Smbit)-格列瑟·格利格格利格格利格列·格列格列格列·阿勒格列·阿勒格列·阿森瑟-西 | EcoRI | |||
表2.在 pBiT1.1 和 pBiT2.1 矢量中与 SacI、EcoRI 或 XhoI 限制位点相关的链接器氨基酸序列。
红色残留物必须由 PCR 引物编码。根据参考资料11改编的表格。
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Discussion
使用此处介绍的方法,使用此 GPCR-β-逮捕蛋白结构补充测定,可在实时生命系统中监控任何 GPCR 和 β-阻尼1/2之间的相互作用。在这方面,我们能够观察到GLP-1r(一种典型的B类GPCR)的两种β-逮捕素异种的招募,我们还观察到受体-β-逮捕复合物在达到最大值后几分钟内分离发光信号。
为了在结构补性测定系统中具有最佳灵敏度,在受体和每个β-阻尼素异构体之间对它进行了四种不同的空间方向筛选,并且使用具有最高发光信号的一种用于后研究,如剂量反应刺激曲线 (图4)。使用这种方法,在糖尿病15等内分泌疾病中使用具有高治疗价值的GPCR来描述受体-β-逮捕素相互作用。以同样的方式,这种策略可以很容易地适应任何GPCR,通过简单地标记与LgBiT或SmBiT在C终端感兴趣的GPCR,并使用此处描述的β-arrestin1/2结构,它成为一个强大的替代当前方法,没有一个复杂的设置的必要性,其中捐助者和接受者之间重叠可能是一个障碍,如在布雷特和FRET的一些情况下。另一个显著的优点是,该系统中使用的向量包含低表达启动子,试图模仿内源性表达水平。通过此功能,我们可以排除由于受体和/或β-阻尼蛋白的高表达水平而出现非特定关联的可能性。在图3和图4中,β-逮捕素1与β-逮捕2之间的受体-β-逮捕复合物有明显差异,对β-逮捕1的疗效和强度也高于β-逮捕2。提出了四种不同方向的筛选,以提高测定的灵敏度,使系统即使在内源表达水平上也高度敏感。
这种方法非常直接。也许该协议中最关键的步骤是扩充感兴趣的受体的引体设计。用户必须非常小心地根据图1选择使用何种限制性酶,并在此基础上向引体中添加相应的核苷酸(表1),以编码红色突出显示的氨基酸(表2)。
这种方法的一个局限性是,在生理pH值或接近生理pH值或接近生理pH值的水溶液中,毛茸茸会降解,导致发光强度的逐渐降低,而与GPCR-β-阻尼相互作用的任何变化无关。为了克服这一限制,在持续监测长时间发光时,用户应始终包括规范化控制(车辆处理的样品)。在测定过程中使用低水平的胎儿牛血清也很重要,因为它的存在可能会增加毛马辛降解16的速度。在测定过程中可能出现的一个问题是,对于已知GPCR-β-阻尼相互作用的发光值,与所有四种不同质粒组合的基准线值相比,不能显著增加。这可能是由于HSV-TK启动子17的低表达。在这种情况下,一种选择是使用CMV启动子将编码LgBiT和SmBiT融合蛋白的开放读取帧分克隆到表达载体中。当更改为更强的启动子时,应优化转染DNA的数量,以获得最佳的检测反应。
利用这种结构补性测定,我们能够非常准确地观察到原型B类GPCR的β-阻尼1/2招募相互作用。使用这种方法,可以从药理学上描述针对GPCRs的特有疗效的新药。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项工作得到了韩国国家研究基金会(NRF)(NRF-2015M3A9E7029172)的资助,该研究由科学、ICT和未来规划部资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
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