Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

निगरानी GPCR-जेड-arrestin1/2 ड्रग डिस्कवरी में तेजी लाने के लिए वास्तविक समय रहने वाले सिस्टम में बातचीत

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/59994
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Graduate School of Medicine, Korea University

Summary

GPCR-जेड-arrestin बातचीत GPCR दवा की खोज में एक उभरते क्षेत्र हैं. सटीक, सटीक और आसान तरीके स्थापित करने के लिए जीवन प्रणाली में इस तरह के बातचीत की निगरानी के लिए आवश्यक हैं. हम वास्तविक समय जीवित कोशिकाओं में GPCR-जेड-arrestin बातचीत की निगरानी करने के लिए एक संरचनात्मक पूरक परख दिखाने के लिए, और यह किसी भी GPCR करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) और जेड-arrestins के बीच बातचीत महान महत्व के शारीरिक प्रभाव के साथ महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं रहे हैं. वर्तमान में, विशेष रूप से GPCR पक्षपाती agonism के अध्ययन के दौरान GPCR दवा की खोज के क्षेत्र में उनके साथ बातचीत की दिशा में उपन्यास दवाओं की विशेषता - arrestins और अन्य साइटोसोलिक प्रोटीन अत्यंत मूल्यवान है. यहाँ, हम एक उपन्यास संरचनात्मक पूरक परख के आवेदन को सही ढंग से वास्तविक समय में रहने वाले सिस्टम में रिसेप्टर-जेड-arrestin बातचीत की निगरानी के लिए दिखा. इस विधि सरल, सटीक है और आसानी से ब्याज की किसी भी GPCR करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और यह भी लाभ है कि यह एक कम अभिव्यक्ति प्रत्येक वेक्टर प्रणाली में मौजूद प्रमोटर की उपस्थिति के कारण विशिष्ट बातचीत पर काबू पा लिया है. यह संरचनात्मक पूरक परख प्रमुख विशेषताएं प्रदान करता है जो रिसेप्टर-जेड-arrestin बातचीत की सटीक और सटीक निगरानी की अनुमति देते हैं, जिससे यह किसी भी जीपीसीआर प्रणाली के पक्षपाती एगोनिज्म के अध्ययन के साथ-साथ जीपीसीआर सी-टर्मिनस 'फॉस्फोरिलेशन' की अनुमति देता है। विभिन्न जीपीसीआर-किनेस (GRKs) और arrestins के बाद अनुवाद संशोधनों द्वारा लिखा गया है जो रिसेप्टर-जेड-arrestin परिसर को स्थिर या अस्थिर करते हैं।

Introduction

जीपीसीआर बाजार में वर्तमान औषधों के लगभग35% के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करती है,2 और उनकी औषध विज्ञान की स्पष्ट समझ उपन्यास चिकित्सीय औषधों3के विकास में महत्वपूर्ण है . GPCR दवा की खोज में प्रमुख पहलुओं में से एक, विशेष रूप से पक्षपाती agonists के विकास के दौरान रिसेप्टर की ओर उपन्यास ligands की विशेषता है-- arrestin बातचीत4 और अन्य cytosolic प्रोटीन के साथ - arrestin बातचीत इस तरह के रूप में clathrin5|

यह प्रलेखित किया गया है कि द्विध्रुवी विकार, प्रमुख अवसाद, और स्किज़ोफ्रेनिया6 जैसे न्यूरोलॉजिकल विकारों में जेड-arrestin निर्भर संकेतन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और कुछ दवाओं जैसे मॉर्फिन7में गंभीर साइड इफेक्ट्स भी हैं।

इन बातचीत पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया वर्तमान तरीकों आमतौर पर अध्ययन में प्रोटीन की वास्तविक अंतर्जात स्तर का प्रतिनिधित्व नहीं करते, कुछ मामलों में वे कमजोर संकेत दिखाने के लिए, photobleaching और GPCR के आधार पर यह तकनीकी रूप से स्थापित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकताहै 8. यह उपन्यास संरचनात्मक पूरक परख अंतर्जात शारीरिक स्तरों की नकल करने के लिए कम अभिव्यक्ति प्रवर्तक सदिशों का उपयोग करता है और वर्तमान विधियों9की तुलना में उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है . इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, यह आसानी से Galanin रिसेप्टर की विशेषता के लिए संभव था-जेड-arrestin1]2 और यह भी [-arrestin2-clathrin बातचीत10. इस पद्धति को व्यापक रूप से विशेष हित के किसी भी GPCR के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां - arrestins एक प्रमुख शारीरिक समारोह खेलते हैं या उनके संकेत कुछ रोगों में प्रासंगिक है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. प्राइमर डिजाइन रणनीति

  1. डिजाइन प्राइमर pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] और pBiT2.1-N [TK/SmBiT] वेक्टर में पेश करने के लिए।
  2. इन तीन साइटों में से कम से कम एक के रूप में इन तीन साइटों में से एक का चयन करें दिशात्मक क्लोनिंग के लिए आवश्यक दो अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइमों में से एक के रूप में एक इन-फ्रेम स्टॉप कोडोन की उपस्थिति के कारण जो बहुक्लोनिंग साइट को विभाजित करता है जैसा कि चित्र 111में दिखाया गया है।
  3. सारणी 211में लाल रंग में दर्शाए गए लिंकर अवशेषों को एन्कोड करने के लिए सारणी 1 में दर्शाए गए निक्षालनों को विक्षोभिक रूप में समाविष्ट करें।
  4. pBiT1.1-C [TK/LgBiT] और pBiT2.1-C [TK/SmBiT] वैक्टर के लिए, सुनिश्चित करें कि 5 प्राइमर में एक ATG codon और एक शक्तिशाली कोज़ाक सहमति अनुक्रम (GCCGCCACC) है।
  5. pBiT1.1-N [TK/LgBiT] और pBiT2.1-N [TK/SmBiT] सदिशों के लिए, यह सुनिश्चित करें कि 3 प्राइमर में स्टॉप कोडोन है।
    नोट: प्रत्येक वेक्टर nonspecific संघ को कम करने और प्रयोगात्मक कलाकृतियों को कम करने के लिए एचएसवी-टीके प्रमोटर शामिल हैं, यह भी प्रत्येक वेक्टर बैक्टीरिया में एम्पसिलिन प्रतिरोध के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट है।

2. पीसीआर

  1. सेट अप और पीसीआर प्रतिक्रियाओं चलाने के लिए चरण 1 से डिजाइन प्राइमर का उपयोग कर ब्याज के जीन के डालें डीएनए बढ़ाना. उत्परिवर्तनों को कम करने के लिए एक उच्च निष्ठा डीएनए पॉलिमरेज का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
  2. पीसीआर प्रतिक्रिया के 50 डिग्री सेल्सियस तैयार करने के लिए बिल्कुल निम्न निम्न क्रम का उपयोग करें। आसुत जल का 35.5 डिग्री सेल्सियस, 10x पॉलिमरेज बफर का 5 डिग्री एल, डीएनटीपी मिश्रण (2.5 एम प्रत्येक), 1 डिग्री सेल्सियस प्लाज़्मिड टेम्पलेट (200 एनजी/एल), आगे और रिवर्स प्राइमर के 1.25 डिग्री एल (10 डिग्री सेल्सियस) और उच्च निष्ठा पॉलिमरेज (5 यू/एल) के 1 डिग्री एल जोड़ें।
  3. thermocycler का उपयोग कर निम्नलिखित डीएनए प्रवर्धन कार्यक्रम की स्थापना की.
    1. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रकृति।
    2. निम्नलिखित थर्मल चक्र को 25 बार दोहराएं: 30 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट प्रति 1 kbp के लिए 72 डिग्री सेल्सियस प्रवर्धित किया जा करने के लिए।
    3. 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार चलाएँ।
    4. नमूने को थर्मोसाइकिलर के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: यह अत्यधिक एक उच्च निष्ठा polymerase का उपयोग करने के क्रम में बिंदु उत्परिवर्तनों विशेष रूप से लंबे दृश्यों के प्रवर्धन के दौरान होने वाली उन को कम करने के लिए सिफारिश की है. के रूप में amplicon अब हो जाता है, डीएनए की प्रतिकृति में सटीकता की डिग्री कम हो जाती है. पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, क्षेत्र के पिघलने के तापमान के आधार पर अनीलन तापमान चुनें जहां ओलिगो सीधे डीएनए टेम्पलेट के साथ संकरित होते हैं और प्राइमर के सभी अनुक्रम के साथ नहीं।
  4. पीसीआर उत्पाद शोधन
    1. वरीयता12के निर्माता से एक किट का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रिया के बाकी हिस्सों से पीसीआर उत्पाद अलग करें। पीसीआर उत्पाद अब प्रतिबंध पाचन के लिए तैयार है।

3. डीएनए पाचन

  1. पीसीआर उत्पाद पाचन के लिए इस प्रकार के रूप में पाचन प्रतिक्रिया के 50 डिग्री एल तैयार करते हैं।
    1. 1.5 एमएल ट्यूब का उपयोग करके 12 डिग्री सेल्सियस आसुत जल मिलाइए।
    2. दोनों प्रतिबंध एंजाइमों के साथ सबसे अच्छा संगतता के साथ 10x बफर के 5 डिग्री एल जोड़ें.
    3. चरण 2.4 से पीसीआर उत्पाद के 30 $L जोड़ें
    4. अंत में, प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम के 1.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
    5. रात भर में 37.5 डिग्री सेल्सियस पर भंवर और इनक्यूबेट द्वारा संक्षेप में मिश्रण।
  2. प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड पाचन के लिए पाचन प्रतिक्रिया के 50 डिग्री सेल्सियस को निम्नानुसार तैयार करते हैं:
    1. 1.5 एमएल ट्यूब का उपयोग करके 23 डिग्री सेल्सियस आसुत जल मिलाइए।
    2. दोनों प्रतिबंध एंजाइमों के साथ सबसे अच्छा संगतता के साथ 10x बफर के 5 डिग्री एल जोड़ें.
    3. प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड (200 एनजी/जेडएल) के 15 डिग्री एल जोड़ें।
    4. प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम के 1.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
    5. रात भर में 37.5 डिग्री सेल्सियस पर भंवर और इनक्यूबेट द्वारा संक्षेप में मिश्रण।
      नोट: डीएनए agarose जेल शोधन के बाद पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के क्रम में प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड के 3 डिग्री ग्राम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी उच्च क्लोनिंग दक्षता प्राप्त करने के लिए दोनों एंजाइमों का उपयोग कर रात भर डीएनए पाचन छोड़ने के लिए प्रासंगिक है.

4. डीएनए agarose जेल शुद्धि और क्लोनिंग

  1. पचा डीएनए प्लाज्मिड और आवेषण को चलाने के लिए 1% agarose जेल तैयार करें और इसी बैंड में कटौती करने के लिए आगे बढ़ें। एक बार इसी वेक्टर और डालने बैंड purified12 किया गया है, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर डीएनए एकाग्रता का निर्धारण.
  2. प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड को डालने को फ्यूज करने के लिए डीएनए लिगेशन करें।
  3. कुल डीएनए के लगभग 100 ग की लिगेशन अभिक्रियाओं की तैयारी की, जिसमें 50 एनजी प्लाज़्मिड वेक्टर शामिल हैं।
  4. लगभग 1:3 के प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड-इन्सर्ट अनुपात सेट करें; यह एक वेक्टर डालने कैलकुलेटर13का उपयोग कर गणना की जा सकती है।
  5. समानांतर में नकारात्मक नियंत्रण सेट करें. उदाहरण के लिए, किसी भी डालने के बिना प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड डीएनए का एक लिगेशन इस बारे में जानकारी प्रदान करेगा कि अपाच्य या स्व-लिगाटिंग प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड की कितनी पृष्ठभूमि मौजूद है।

5. क्लोन का परिवर्तन

  1. -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर से DH5 ] सक्षम कोशिकाओं की एक ट्यूब प्लेस और तुरंत 20 मिनट के लिए बर्फ पर स्थानांतरित.
  2. उस समय के बाद, DH5 के 55 डिग्री सेल्सियल ले लो और लिगेशन प्रतिक्रिया के 4 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और ट्यूब flicking द्वारा मिश्रण और 45 मिनट के लिए बर्फ पर स्टोर.
  3. एक पानी के स्नान में ट्यूब प्लेस पहले ठीक 48 s के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म और तुरंत एक और 3 मिनट के लिए बर्फ पर वापस ट्यूब मिलता है.
  4. Luria ब्रोथ (एलबी) मध्यम के 600 डिग्री एल जोड़ें पहले 37.5 डिग्री सेल्सियस पर गर्म और 200 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए मिलाते हुए के साथ इनक्यूबेट।
  5. एक आगर प्लेट में 200 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरित करें जिसमें एम्पसिलिन 100 ग्राम/एमएल होता है और धीरे-धीरे तरल के साथ सतह पर फैल जाता है।
  6. अगली सुबह कालोनियों को देखने के लिए प्लेटों को रात भर इनक्यूबेट करें। डालने की थाली पर प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड अकेले प्लेट की तुलना में काफी अधिक कालोनियों होना चाहिए।

6. समाप्त प्लाज्मिड का अलगाव

  1. 3-10 व्यक्तिगत जीवाणु कालोनियों उठाओ और एलबी मध्यम के 1 एमएल में स्थानांतरित करें जिसमें एम्पिसिलिन (100 ग्राम/एमएल) और 6 एच के लिए इनक्यूबेट शामिल हैं।
  2. जीवाणु निलंबन के 200 डिग्री सेल्सियस ले लो और एलबी माध्यम के 5 एमएल में स्थानांतरण के रूप में चरण 6.1 में एम्पीसिलिन की एक ही एकाग्रता युक्त और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37.5 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट।
  3. एक miniprep डीएनए किट शुद्धि का उपयोग करना, निर्माता के निर्देश14के बाद रात भर हो LB के 5 एमएल का उपयोग कर miniprep डीएनए शुद्धि प्रदर्शन करते हैं.
  4. सफल ligations की पहचान करने के लिए, पीसीआर प्रतिक्रियाओं को उसी तरह सेट करें जैसे अनुभाग 2 में पहले PCR के दौरान अनुभाग 2 में समान प्राइमर के साथ समान प्राइमर के रूप में चरण 6.3 से प्राप्त डीएनए का उपयोग करके. सकारात्मक क्लोन इसी आकार के साथ पीसीआर उत्पादों का उत्पादन होगा।
  5. सकारात्मक क्लोन की बड़ी तैयारी डीएनए शुद्धि के बाद, क्लोनिंग कदम के दौरान इस्तेमाल एंजाइमों के साथ शुद्ध डीएनए के 500 एनजी के एक नैदानिक प्रतिबंध पाचन का संचालन और एक 1% agarose जेल पर पचा उत्पादों को चलाने. दो बैंड होने चाहिए: एक वेक्टर का आकार और एक नए डालने का आकार.
  6. निम्नलिखित प्राइमर का उपयोग करअनुक्रम द्वारा निर्माण अनुक्रम की पुष्टि करें: फॉरवर्ड 5'- aaggtgacgtgtgccgcgaac-3' और रिवर्स 5'-gcattttttcacttctagt-3'।
    नोट: जब डीएनए पीसीआर का उपयोग दोहराया है, वहाँ हमेशा प्रवर्धन के दौरान त्रुटियों की संभावना भी एक उच्च निष्ठा polymerase का उपयोग करते समय है, इसलिए अंतिम constructs अनुक्रम करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.

7. संक्रमण और प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. एक पहले पाली-L-lysine लेपित सफेद 96 अच्छी तरह से थाली में, सेल बोने 2.5 x 104 कोशिकाओं पर प्रति अच्छी तरह से Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम का उपयोग कर प्रति एक दिन बोने प्रदर्शन 10% भ्रूण बोवाइन सीरम के 10% के साथ पूरक, 100 U/ एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन।
  2. वाष्पीकरण से प्लेट और किनारे प्रभाव भर में थर्मल gradients के लिए क्षमता को कम करने के लिए केवल 60 आंतरिक कुओं का प्रयोग करें. 36 बाहरी कुओं में 200 डिग्री सेल्सियस और कुएं के बीच के स्थानों में 150 डिग्री सेल्सियस और सीओ2के 5% स्थान में रात भर के लिए बाँझ आसुत जल जोड़ें .
  3. अगली सुबह कुल डीएनए (50 एनजी प्रत्येक निर्माण) के 100 एनजी का उपयोग कर transfection प्रदर्शन करते हैं।
  4. चित्र 2bके अनुसार चार अलग-अलग प्लाज्मिड संयोजन (रिसेप्टर: $-arrestin) सेट करें।
  5. प्रत्येक प्लाज्मिड संयोजन के लिए संशोधित ईगल के न्यूनतम आवश्यक मीडिया के 20 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें HEPES के साथ बफर 0.3 $L lipidic ट्रांसेक्शन अभिकर्मक प्रति अच्छी तरह से.
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए lipidic ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक-डीएनए मिश्रण के 20 डिग्री एल जोड़ें और 10 s के लिए हलकों में थाली मिश्रण.
  7. 37.5 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2पर 6 घंटे की ऊष्मायन के बाद नए सिरे से माध्यम बदलें।
  8. प्लेट को 37.5 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2पर 24 ह के लिए इन्क्यूबेट करें।

8. HEK293 कोशिकाओं में निगरानी रिसेप्टर-जेड-arrestin1]2 बातचीत

  1. Aspirate मध्यम और संशोधित ईगल के न्यूनतम आवश्यक मीडिया के 100 $L जोड़ने के प्रत्येक अच्छी तरह से HEPES के साथ बफर और प्लेट 10 मिनट के लिए आरटी पर स्थिर.
  2. सेल संस्कृति माध्यम के साथ मिश्रण करने के लिए एक 5x शेयर बनाने, LCS Dilution बफर (एक 20 गुना कमजोर पड़ने)11के 19 संस्करणों के साथ 100x सब्सट्रेट के 1 मात्रा के संयोजन के द्वारा furimazine सब्सट्रेट तैयार करें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से 5x furimazine के 25 डिग्री एल जोड़ें और धीरे 10 s के लिए हलकों में मिश्रण.
  4. आरटी में संकेत स्थिरीकरण के लिए 10 मिनट के लिए luminscence उपाय.
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से यह अच्छी तरह से प्रति चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या में अंतर की वजह से परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद मिलेगी की प्रतिक्रिया को सामान्य करने के लिए इस आधार रेखा संकेत का उपयोग करके, भी transfection दक्षता में मतभेद, आदि. एक बार गणना, एक दिया दवा उपचार के लिए दोहराने कुओं से सामान्यीकृत प्रतिक्रिया औसत.
  5. संशोधित ईगल के न्यूनतम आवश्यक मीडिया HEPES के साथ बफर में 13.5x ligand समाधान तैयार करें।
  6. 13.5x लिगन्ड इसके अतिरिक्त 10 डिग्री सेल्सियस के साथ कमरे के तापमान पर प्रयोगों के लिए, इंजेक्टर या मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके यौगिकों को जोड़ें और प्लेट को हाथ से मिलाएं या कक्षीय शेकर (20 s 200 आरपीएम पर)।
  7. 13.5x लिगन्ड योग के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ 37.5 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगों के लिए, उपकरण कक्षीय शेकर का उपयोग करके यौगिकों को वितरित करने और मिश्रण करने के लिए इंजेक्टर का उपयोग करें। इंजेक्टर का उपयोग नहीं करने के मामले में, luminometer से प्लेट को हटा दें, ligands जोड़ने और हाथ से थाली मिश्रण या एक कक्षीय शेकर का उपयोग कर (20 s 200 rpm पर).
    नोट: luminometer से प्लेट को हटाने के साथ जुड़े तापमान में उतार चढ़ाव को कम करने के लिए पता लगाने के साधन के भीतर इंजेक्टर और एक शेकर का प्रयोग करें। मानक benchtop luminometers इस परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 0ण्25-2 s के एकीकरण समय का उपयोग करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना, एक protypical GPCR और दो के बीच बातचीत - arrestin isoforms नजर रखी गई. पेप्टाइड रिसेप्टर (जीएलपी-1r) की तरह ग्लूकागन निर्माण NheI और EcoRI एंजाइम प्रतिबंध साइटों युक्त प्राइमर का उपयोग कर बनाया गया था और vectors pBiT1.1-C [TK/LgBiT] और pBiT2.1-C [TK/SmBiT] जबकि जेड-arrestins के मामले में, दो अतिरिक्त वेक्टर थे इस्तेमाल किया pBiT1.1-N [TK/LgBiT] और pBiT2.1-N [TK/SmBiT] एंजाइम प्रतिबंध साइटों BgIII और EcoRI का उपयोग कर के मामले में $-arrestin2 और NheI और XhoI के मामले में $-arrestin1. HEK293 कोशिकाओं GLP-1r-LgBiT/SmBiT के 50 एनजी और N- या सी-टर्मिनल पर LgBiT या SmBiT के साथ टैग की गई $-arrestin के 50 एनजी का उपयोग करtransfected थे। चार अलग-अलग प्लाज्मिड संयोजनों की जांच की गई (चित्र 3) और उच्चतम ज्योतिर्न संकेत वाला एक व्यक्ति आगे के प्रयोगों के लिए चुना गया (चित्र 4) . प्रत्येक $-arrestin आइसोफॉर्म भर्ती के लिए EC50 मान निर्धारित करने के लिए, खुराक प्रतिक्रिया घटता 10 डिग्री एम, 1 $M, 100 एनएम, 10 एनएम और GLP-1 लिगन्ड सांद्रता के 1 एनएम का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया (चित्र 4c)। दोज अनुक्रिया वक्र गतिज अध्ययनसे प्रत्येक सांद्रता की अधिकतम अनुक्रिया से प्राप्त किए गए थे (चित्र4ं, 4ठ)।

Figure 1
चित्र 1. GLP-1r-जेड-arrestin1-2 संरचनात्मक पूरक परख के डिजाइन में इस्तेमाल किया सदिशों के multicloning साइटों के न्यूक्लिओटाइड दृश्यों।
जीएलपी-1r-जेड-arrestin1/2 प्रणाली के लिए संरचनात्मक पूरक परख विकसित करने के लिए, यह सी-टर्मिनल GLP-1r LgBiT और SmBiT के साथ टैग करने के लिए आवश्यक था एंजाइम प्रतिबंध NHEI और EcoRI का उपयोग कर pBiT1.1-C [TK/LgBiT] और pBiT2.1-C [TK] SBiMBIt वेक्टर. जेड-arrestin1/2 के मामले में उन्हें सी- और एन-टर्मिनल पर LgBiT और SmBiT के साथ टैग भी किया गया था, जिसमें एंजाइम प्रतिबंधों का उपयोग करते हुए BglII/EcoRI को $-arrestin2 और NHEI/XhoI के लिए चार वेक्टरों पर $-arrestin1 के लिए टैग किया गया था। सभी वैक्टर गैर-विशिष्ट संघ को कम करने और प्रयोगात्मक कलाकृतियों को कम करने के लिए एचएसवी-टीके प्रमोटर का उपयोग करते हैं और प्रत्येक वेक्टर में बैक्टीरिया में एम्पसिलिन प्रतिरोध के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट होता है। संदर्भ 11 से अनुकूलित छवि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. जीपीसीआर का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: $-arrestin1]2 संरचनात्मक पूरक परख।
(अ) जीपीसीआर कैसे: जेड-arrestin1/2 संरचनात्मक पूरक परख लिगन्ड की उपस्थिति में काम करता है। (ख) जीपीसीआर के लिए विभिन्न प्लाज्मिड संयोजनों का संरचनात्मक प्रतिनिधित्व और LgBiT या SmBiT के साथ टैग किए गए $-arrestin आइसोफॉर्म्स। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. GLP-1r/जेड-arrestins अभिविन्यास स्क्रीनिंग.
उच्चतम संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए 4 विभिन्न प्लाज्मिड संयोजन ट्रांसफेक्शन के बाद 24 एच के दौरान व्यक्त किए गए थे। केवल एक GLP-1r को छोड़कर लगभग सभी अलग-अलग प्लाज्मिड संयोजनों (ए -सी) में चमकदार संकेतों का पता लगाया गया था: $-arrestin अभिविन्यास (घ)। परिणामों को अर्थ के रूप में व्यक्त किया जाता है - डुप्लिकेट में किए गए दो प्रयोगों के S.E.M.; प्रत्येक डुप्लिकेट S.E.M की गणना करने से पहले औसत था. तीर उस समय का संकेत देते हैं जिस पर कोशिकाओं को 10 डिग्री एम अंतिम सांद्रता में GLP-1 के साथ इलाज किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. GLP-1r-जेड-arrestin1]2 बातचीत खुराक निर्भर तरीके से कर रहे हैं.
दोज परनिर्भर लिगन्ड संबंध ]-arrestin2 (a) and $-arrestin1 recruitment (b) खुराक प्रतिक्रिया घटता GLP-1r द्वारा $-arrestin1 और $-arrestin2 के बीच अंतर भर्ती दिखा रहा है (ग)। परिणामों को अर्थ के रूप में व्यक्त किया जाता है - डुप्लिकेट में किए गए दो प्रयोगों के S.E.M.; प्रत्येक डुप्लिकेट S.E.M की गणना करने से पहले औसत था. तीर उस समय को इंगित करते हैं जिस पर कोशिकाओं को संगत सांद्रता (10 डिग्री एम, 1 $M, 100 nM, 10 nM, अंतिम सांद्रता) पर GLP-1 के साथ उपचार किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वेक्टर एंजाइम प्रतिबंध का इस्तेमाल किया प्राइमर अनुक्रम
pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] सैक 5-XXXXXXXXGAGCTCC(रेव एसआई)-3 ]
इकोआरआई 5-XXXXXXXXGAATTCCC(रेव एसआई)-3 ]
XhoI 5-XXXXXXXXCTCGAGCC(रेव एसआई)-3 ]
pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Xho 5-XXXXXXXXCTCGAGCGGT (एसआई)-3 ]
सैक 5-XXXXXXXXGAGCTCएजी(एसआई)-3 ]
इकोआरआई 5-XXXXXXXXGAATTCA(एसआई)-3 ]

तालिका 1. pBiT1.1 और pBiT2.1 सदिश के लिए linker की कोडिंग अनुक्रम में विभिन्न प्रतिबंध एंजाइम साइटों के लिए प्राइमर के अनुक्रम.
एसआई ] ब्याज की अनुक्रम; रेव SI - ब्याज के अनुक्रम के रिवर्स पूरक. तालिका संदर्भ 11 से अनुकूलित.

वेक्टर लिंकर अनुक्रम एंजाइम प्रतिबंध का इस्तेमाल किया
pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] एसआई-GlyAlaGlnGlyAsnSerGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGlySerGly- (LgBiT/ सैक
एसआई-GlyAsnSerGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSerGly- (LgBiT/ इकोआरआई
एसआई-GlySerSerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlySerGly- (LgBiT/ XhoI
pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSerGly-SI XhoI
(LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyAGllyAlaGln-SI सैक
(LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyAlaGlnGlyAsnSer-SI इकोआरआई

तालिका 2. Linker एमिनो एसिड दृश्यों SacI, EcoRI या XhoI प्रतिबंध साइटों के साथ pBiT1.1 और pBiT2.1 वेक्टर्स में से संबंधित.
लाल अवशेषों को पीसीआर प्राइमर द्वारा इनकोडिंग किया जाना चाहिए। तालिका संदर्भ 11 से अनुकूलित.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत विधि का उपयोग करना, किसी भी GPCR और जेड-arrestin1]2 के बीच बातचीत वास्तविक समय में रहने वाले सिस्टम में नजर रखी जा सकती है इस GPCR-जेड-arrestin संरचनात्मक पूरक परख का उपयोग कर. इस संबंध में, हम GLP-1r (एक protypical कक्षा बी GPCR) द्वारा दो -arrestin isoforms के बीच अंतर - arrestin भर्ती का निरीक्षण करने में सक्षम थे, हम भी रिसेप्टर के एक वियोजन मनाया-जेड-arrestin जटिल अधिकतम तक पहुँचने के कुछ मिनट के बाद संदीपसंकेत.

संरचनात्मक पूरक परख प्रणाली में सबसे अच्छा संवेदनशीलता है करने के लिए, यह रिसेप्टर और प्रत्येक के बीच चार अलग स्थानिक अभिविन्यास के साथ जांच की गई थी - arrestin आइसोफॉर्म और उच्चतम luminescent संकेत के साथ एक पीछे के लिए इस्तेमाल किया गया था अध्ययन जैसे खुराक प्रतिक्रिया उत्तेजना वक्र (चित्र 4) . इस पद्धति का उपयोग करके यह संभव था कि मधुमेह मेलिटस15जैसे एंडोक्राइनोटिक रोगों में उच्च चिकित्सीय मूल्य के जीपीसीआर का उपयोग करके रिसेप्टर-जेड-arrestin बातचीत की विशेषता हो । उसी तरह इस रणनीति को आसानी से किसी भी GPCR के लिए अनुकूलित किया जा सकता है सरल टैगिंग LgBiT या SmBiT के साथ ब्याज की GPCR सी-टर्मिनल पर और का उपयोग कर के द्वारा [-arrestin1]2 निर्माण यहाँ वर्णित है और यह बिना वर्तमान के तरीके के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप में उभरता है एक जटिल की आवश्यकता की स्थापना की जहां दाता और स्वीकारकर्ता के बीच ओवरलैपिंग एक बाधा हो सकती है जैसा कि BRET और FRET के कुछ मामलों में हो सकता है। एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इस प्रणाली में प्रयुक्त वैक्टरों में अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर की नकल करने के प्रयास में कम अभिव्यक्ति प्रमोटर होते हैं। इस सुविधा के साथ, हम रिसेप्टर के उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के कारण गैर-विशिष्ट संघों की संभावना से इनकार कर सकते हैं और / चित्र 3 और चित्र 4में, रिसेप्टर-जेड-arrestin परिसर में एक स्पष्ट अंतर है $-arrestin1 बनाम $-arrestin2 और भी एक उच्च प्रभावकारिता और तीव्रता की ओर $-arrestin1 पर $-arrestin2. चार अलग अलग अभिविन्यास में स्क्रीनिंग अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर पर भी प्रणाली अत्यधिक संवेदनशील बनाने परख की संवेदनशीलता को बढ़ाने का प्रस्ताव किया गया था.

इस पद्धति को बहुत सीधे आगे प्रदर्शन करने के लिए है. शायद इस प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम ब्याज की रिसेप्टर बढ़ाना प्राइमर डिजाइन है. उपयोगकर्ता को चित्र 1 के अनुसार उपयोग करने के लिए किस प्रतिबंध एंजाइम का चयन करने में बहुत सावधान रहना चाहिए और इसके आधार पर संबंधित न्यूक्लिओटाइड को प्राइमर्स में जोड़ने के लिए (तालिका 1) लाल हाइलाइट किए गए एमिनो अम्लों ( सारणी2) को एन्कोड करने के लिए ।

इस पद्धति की एक सीमा यह हो सकती है कि फरिमाज़ीन शारीरिक पीएच पर या उसके निकट जलीय विलयन में निम्नीकृत हो जाएगा, जिससे GPCR-- arrestin बातचीत16में किसी भी परिवर्तन से स्वतंत्र संदीप्ति तीव्रता में क्रमिक कमी हो जाएगी। इस सीमा को दूर करने के लिए उपयोगकर्ता हमेशा एक सामान्यीकरण नियंत्रण शामिल करना चाहिए (वाहन का इलाज नमूने) जब लगातार विस्तारित समय अवधि के लिए संदीप्ति की निगरानी. परख के दौरान भ्रूण गोजातीय सीरम के निम्न स्तर का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि इसकी उपस्थिति से यह फरीमाज़ीन अवक्रमण की दर में वृद्धि कर सकताहै. एक समस्या है कि परख के दौरान उत्पन्न हो सकता है कि एक ज्ञात GPCR के लिए luminescent मूल्यों के लिए-जेड-arrestin बातचीत कोई महत्वपूर्ण वृद्धि हो सकती है सभी चार अलग प्लाज्मिड संयोजनों में आधार रेखा मूल्यों की तुलना में पंजीकृत है. यह एचएसवी-टीके प्रमोटर17से कम अभिव्यक्ति के कारण हो सकता है। उस मामले में, एक विकल्प के लिए खुला पढ़ना फ्रेम्स encoding LgBiT और SmBiT संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति वैक्टर में CMV प्रमोटर का उपयोग कर subclone है. जब एक मजबूत प्रमोटर को बदलने, transfected डीएनए की राशि का अनुकूलन किया जाना चाहिए ताकि सबसे अच्छा परख प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए.

इस संरचनात्मक पूरक परख का उपयोग कर हम महान सटीकता के साथ निरीक्षण करने में सक्षम थे एक protypical वर्ग बी GPCR द्वारा $-arrestin1]2 भर्ती बातचीत. इस विधि का उपयोग करके, औषधीय रूप से GPCRs को लक्षित करने वाले विशेष हित की नवीन औषधियों की विशेषता संभव है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

यह काम विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी, और भविष्य की योजना द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के अनुसंधान कार्यक्रम (एनआरएफ 2015M3A9E7172) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotics penicillin streptomycin Welgene LS202-02 Penicillin/Streptomycin
Bacterial Incubator JEIO Tech IB-05G Incubator (Air-Jacket), Basic
Cell culture medium Welgene LM 001-05 DMEM Cell culture medium
Cell culture transfection medium Gibco 31985-070 Optimem 1X cell culture medium
CO2 Incubator NUAIRE NU5720 Direct Heat CO2 Incubator
Digital water bath Lab Tech LWB-122D Digital water bath lab tech
DNA Polymerase proof reading ELPIS Biotech EBT-1011 PfU DNA polymerase
DNA purification kit Cosmogenetech CMP0112 miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase Enzynomics P750 nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII New England Biolabs R0144L BglII
Enzyme restriction buffer New England Biolabs B72045 CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI New England Biolabs R3101L EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI New England Biolabs R01315 NheI
Enzyme restriction XhoI New England Biolabs R0146L XhoI
Fetal Bovine Serum Gibco Canada 12483020 Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit Real Biotech Corporation KH23108 HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase ELPIS Biotech EBT-1025 T4 DNA Ligase
Light microscope Olympus CKX53SF CKX53 Microscope Olympus
lipid transfection reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000
Luminometer Biotek/Fisher Scientific 12504386 Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT System Promega N2014 NanoBiT PPI MCS Starter System
Nanoluciferase substrate Promega N2012 Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler Eppendorf 6336000015 Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine Sigma Aldrich P4707-50ML Poly-L-lysine solution
Trypsin EDTA Gibco 25200-056 Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well plates Corning 3917 Assay Plate 96 well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
  4. Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
  5. Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
  6. Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
  7. Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
  8. Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
  9. Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  10. Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
  11. Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
  12. Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
  13. New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
  14. Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
  15. Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
  16. ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
  17. Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).

Tags

जैव रसायन अंक 148 जेड-arrestins जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स दवा की खोज रहने वाले सिस्टम वास्तविक समय संरचनात्मक पूरक परख दवा विकास
निगरानी GPCR-जेड-arrestin1/2 ड्रग डिस्कवरी में तेजी लाने के लिए वास्तविक समय रहने वाले सिस्टम में बातचीत
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun,… More

Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Monitoring GPCR-β-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery. J. Vis. Exp. (148), e59994, doi:10.3791/59994 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter