Summary
Les interactions GPCR-MD-arrestin sont un domaine émergent dans la découverte de médicaments par gpCR. Des méthodes précises, précises et faciles à mettre en place sont nécessaires pour surveiller de telles interactions dans les systèmes vivants. Nous montrons un test de complémentarité structurelle pour surveiller les interactions GPCR-MD-arrestin dans les cellules vivantes en temps réel, et il peut être étendu à n'importe quel GPCR.
Abstract
Les interactions entre les récepteurs couplés à la protéine G (GpCR) et les arrestins sont des processus vitaux ayant des implications physiologiques de grande importance. À l'heure actuelle, la caractérisation de nouveaux médicaments en vue de leurs interactions avec les arrestins et autres protéines cytosoliques est extrêmement précieuse dans le domaine de la découverte de médicaments par GPCR, en particulier lors de l'étude de l'agonisme biaisé du GPCR. Ici, nous montrons l'application d'un nouveau test de complémentarité structurelle pour surveiller avec précision les interactions récepteur-arrestin dans les systèmes vivants en temps réel. Cette méthode est simple, précise et peut être facilement étendue à n'importe quel GPCR d'intérêt et a également l'avantage qu'elle surmonte les interactions non spécifiques en raison de la présence d'un promoteur de faible expression présent dans chaque système vectoriel. Cet analyse de complémentarité structurelle fournit des caractéristiques clés qui permettent une surveillance précise et précise des interactions récepteur-arrestin, ce qui le rend approprié dans l'étude de l'agonisme biaisé de tout système GPCR ainsi que GPCR c-terminus 'phosphorylation codes écrits par différents GPCR-kinases (GRKs) et des modifications post-traductionnelle des arrestins qui stabilisent ou déstabilisent le complexe récepteur---arrestin.
Introduction
Les GPCR représentent la cible de près de 35 % des médicaments actuels sur le marché1,2 et une compréhension claire de leur pharmacologie est cruciale dans le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques3. L'un des aspects clés de la découverte de médicaments par le GPCR, en particulier pendant le développement d'agonistes biaisés, est la caractérisation de nouveaux ligands vers les interactions récepteur-arrestin4 et les interactions de l'arrestine avec d'autres protéines cytosoliques telles que comme clathrine5.
Il a été documenté que la signalisation dépendante de l'arrêt-arrêt joue un rôle clé dans les troubles neurologiques tels que le trouble bipolaire, la dépression majeure, et la schizophrénie6 et aussi des effets secondaires graves dans certains médicaments tels que la morphine7.
Les méthodes actuelles utilisées pour surveiller ces interactions ne représentent généralement pas les niveaux endogènes réels des protéines à l'étude, dans certains cas, ils montrent un signal faible, photoblanchiment et en fonction de la GPCR, il pourrait être techniquement difficile de mettre en place8. Ce nouvel exemple de complémentarité structurelle utilise des vecteurs de promoteur à faible expression afin d'imiter les niveaux physiologiques endogènes et fournit une sensibilité élevée par rapport aux méthodes actuelles9. En utilisant cette approche, il a été possible de caractériser facilement le récepteur Galanin--arrestin1/2 et aussi les interactions de la clathrine10. Cette méthodologie peut être largement utilisée à n'importe quel GPCR d'intérêt particulier où les '-arrestins jouent une fonction physiologique clé ou leur signalisation est pertinente dans certaines maladies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stratégie de conception d'apprêt
- Concevoir des amorces pour introduire des gènes d'intérêt dans pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
- Sélectionnez au moins l'un de ces trois sites comme l'une des deux enzymes de restriction uniques nécessaires au clonage directionnel en raison de la présence d'un codon d'arrêt dans le cadre qui divise le site multicloing comme le montre la figure 111.
- Incorporez la séquence de nucléotide dans les amorces, comme le montre le tableau 1, pour coder les résidus de liaison indiqués en rouge dans le tableau 211.
- Pour les vecteurs pBiT1.1-C [TK/LgBiT] et pBiT2.1-C [TK/SmBiT], assurez-vous que l'amorce de 5 euros contient un codon ATG et une puissante séquence de consensus Kozak (GCCACC).
- Pour les vecteurs pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT], assurez-vous que l'amorce 3 contient un codon d'arrêt.
REMARQUE: Chaque vecteur contient le promoteur HSV-TK pour minimiser l'association non spécifique et réduire les artefacts expérimentaux, aussi chaque vecteur a une cassette d'expression pour la résistance à l'ampicilline dans les bactéries.
2. PCR
- Configurez et exécutez des réactions PCR pour amplifier l'ADN d'insertion du gène d'intérêt à l'aide des amorces conçues à partir de l'étape 1. Il est important d'utiliser une polymérase d'ADN haute fidélité pour minimiser les mutations.
- Utilisez exactement l'ordre suivant pour préparer 50 L de réaction PCR. Ajouter 35,5 l d'eau distillée, 5 l de 10x tampon de polymérase, 5 l de mélange dNTP (2,5 ml chacun), 1 l de modèle de plasmide (200 ng/L), 1,25 l d'amorces avant et inversées (10 M) et 1 l de polymérase haute fidélité (5 U/L).
- À l'aide d'un thermocycleur, configurez le programme d'amplification de l'ADN suivant.
- Dénaturer à 95 oC pendant 5 min.
- Répéter 25 fois le cycle thermique suivant : 95 oC pour 30 s, 60 oC pour 1 min, 72 oC pour 2 min par 1 kbp à amplifier.
- Exécuter une extension finale à 72 oC pendant 10 min.
- Maintenez les échantillons à 4 oC dans le thermocycleur.
REMARQUE : Il est fortement recommandé d'utiliser une polymérase haute fidélité afin de minimiser les mutations ponctuelles, en particulier celles qui se produisent lors de l'amplification de longues séquences. À mesure que l'amplicon s'allonge, le degré de précision dans la réplication de l'ADN diminue. Pour la réaction PCR, choisissez la température d'annealing basée sur la température de fusion de la région où les oligos s'hybrident directement avec le modèle d'ADN et non avec toute la séquence de l'amorce.
- Purification du produit PCR
- Isolez le produit PCR du reste de la réaction PCR à l'aide d'un kit d'un fabricant de préférence12. Le produit PCR est maintenant prêt pour la digestion de restriction.
3. Digestion de l'ADN
- Pour la digestion du produit PCR préparer 50 L de réaction de digestion comme suit.
- À l'aide d'un tube de 1,5 ml, ajouter 12 l d'eau distillée.
- Ajouter 5 ll de tampon 10x avec la meilleure compatibilité avec les deux enzymes de restriction.
- À partir de l'étape 2.4 ajouter 30 L de produit PCR
- Enfin, ajoutez 1,5 L de chaque enzyme de restriction.
- Mélanger brièvement par vortex et incuber à 37,5 oC pendant la nuit.
- Pour le plasmide receveur, la digestion prépare 50 L de réaction de digestion comme suit :
- À l'aide d'un tube de 1,5 ml, ajouter 23 l d'eau distillée.
- Ajouter 5 ll de tampon 10x avec la meilleure compatibilité avec les deux enzymes de restriction.
- Ajouter 15 l'un de plasmide receveur (200 ng/L).
- Ajouter 1,5 L de chaque enzyme de restriction.
- Mélanger brièvement par vortex et incuber à 37,5 oC pendant la nuit.
REMARQUE : Il est important d'utiliser 3 g de plasmide receveur afin d'obtenir suffisamment de matériel après la purification du gel d'agarose d'ADN. Il est également pertinent de laisser les digestions d'ADN pendant la nuit en utilisant les deux enzymes pour obtenir une efficacité de clonage élevée.
4. Purification et clonage de gel d'agarose d'ADN
- Préparer un gel d'agarose de 1% pour faire fonctionner le plasmide d'ADN digéré et les inserts et procéder à couper les bandes correspondantes. Une fois que les bandes correspondantes de vecteur et d'insertion ont été purifiées12, déterminez la concentration d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Effectuer la ligature d'ADN pour fusionner l'insert au plasmide du destinataire.
- Préparer des réactions de ligature d'environ 100 ng d'ADN total, y compris 50 ng de vecteur plasmide.
- Configurer le rapport plasmi-insertion du destinataire d'environ 1:3; il peut être calculé à l'aide d'une calculatrice à insertion vectorielle13.
- Mettre en place des contrôles négatifs en parallèle. Par exemple, une ligature de l'ADN plasmide du destinataire sans aucun encart fournira des informations sur la quantité de fond du plasmide receveur non digéré ou auto-ligating est présent.
5. Transformation des clones
- Placez un tube de cellules compétentes DH5MD du congélateur à -80 oC et transférez-le immédiatement sur la glace pendant 20 min.
- Après ce temps, prendre 55 l de cellules compétentes DH5 et ajouter 4 'L de réaction de ligature et mélanger en faisant glisser le tube et stocker sur la glace pendant 45 min.
- Placez le tube dans un bain d'eau préalablement réchauffé à 42 oC pour exactement 48 s et reprenez immédiatement les tubes sur la glace pendant 3 minutes de plus.
- Ajouter 600 ll de l'eau-de-vie luria Broth (LB) préalablement réchauffée à 37,5 oC et couver en secouant pendant 1 heure à 200 tr/min.
- Transférer 200 l dans une plaque d'agar contenant de l'ampicilline 100 g/mL et répartir délicatement sur la surface avec le liquide est principalement absorbé.
- Incuber les plaques toute la nuit pour voir les colonies le lendemain matin. Le plasmide receveur sur la plaque d'insertion devrait avoir beaucoup plus de colonies que la plaque de plasmide seule.
6. Isolement du plasmide fini
- Choisissez 3 à 10 colonies bactériennes individuelles et transférez-les dans 1 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline (100 g/mL) et incubez pendant 6 h.
- Prendre 200 ll de suspension bactérienne et transférer à 5 ml de milieu LB contenant la même concentration d'ampicilline que dans l'étape 6.1 et couver toute la nuit à 37,5 oC en secouant à 200 tr/min.
- À l'aide d'un kit d'ADN miniprep, effectuer des purifications d'ADN miniprep en utilisant 5 ml de LB cultivé pendant la nuit suivant les instructions du fabricant14.
- Pour identifier les ligatures réussies, configurez les réactions PCR de la même manière que dans la section 2 en utilisant l'ADN obtenu à partir de l'étape 6.3 comme modèle avec les mêmes amorces que dans la section 2 lors de la première PCR. Les clones positifs produiront des produits PCR avec la taille correspondante.
- Après la purification d'ADN de grande préparation des clones positifs, mener une digestion diagnostique de restriction de 500 ng de l'ADN purifié avec les enzymes employées pendant l'étape de clonage et exécuter les produits digérés sur un gel d'agarose de 1%. Il devrait y avoir deux bandes : l'une de la taille du vecteur et l'autre de la taille du nouvel insert.
- Vérifier la séquence de construction en séquençant à l'aide des amorces suivantes: Forward 5'- aaggtgacgcgtgtgcctcgaac-3' et inversé 5'-gcattttttcactgcattctagtt-3'.
REMARQUE : Lorsque l'ADN est reproduit à l'aide de PCR, il y a toujours la possibilité d'erreurs pendant l'amplification même lors de l'utilisation d'une polymérase haute fidélité, il est donc très important de séquencer les constructions finales.
7. Transfection et expression protéique
- Dans une plaque de puits blanche 96 enduite de poly-L-lysine, effectuer l'ensemencement cellulaire un jour avant la transfection à 2,5 x 104 cellules par puits en utilisant le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline G et 100 g/ mL streptomycine.
- Utilisez uniquement les 60 puits intérieurs pour minimiser le potentiel de gradients thermiques à travers la plaque et les effets de bord de l'évaporation. Ajouter 200 l'eau distillée stérile aux 36 puits extérieurs et 150 l dans les espaces entre les puits et incuber pendant la nuit à 37,5 oC et 5 % du CO2.
- Le lendemain matin effectuer la transfection en utilisant 100 ng d'ADN total (50 ng chaque construction).
- Configurez quatre combinaisons de plasmides différentes (récepteur : 'arrestin' ) selon la figure 2b.
- Pour chaque combinaison de plasmides, utilisez 20 l de support essentiel minimum modifié d'Eagle tamponné avec HEPES en utilisant 0,3 L de réactif de transfection lipidique par puits.
- Ajouter 20 l de mélange réagent-ADN de transfection lipidique à chaque puits et mélanger la plaque en cercles pendant 10 s.
- Changer de milieu frais après 6 heures d'incubationà 37,5 oC et 5 % de CO 2.
- Incuber la plaque pendant 24 h à 37,5 oC et 5 % de CO2.
8. Surveillance des interactions récepteur--arrestin1/2 dans les cellules HEK293
- Aspirez le milieu et ajoutez 100 l de tampon satisme modifié de eagle's Minimum Essential Media avec HEPES à chaque puits et laissez la plaque se stabiliser à RT pendant 10 min.
- Préparer le substrat de furimazine en combinant 1 volume de substrat 100x avec 19 volumes de LCS Dilution Buffer (une dilution 20 fois)11, créant un stock 5x à mélanger avec le milieu de culture cellulaire.
- Ajouter 25 l de 5x furimazine à chaque puits et mélanger délicatement en cercles pendant 10 s.
- Mesurer la luminescence pendant 10 min pour la stabilisation du signal à RT.
REMARQUE : En utilisant ce signal de base pour normaliser la réponse de chaque puits, il aidera à réduire la variabilité causée par les différences dans le nombre de cellules plaquées par puits, aussi des différences dans l'efficacité de la transfection, etc. Une fois calculé, la moyenne de la réponse normalisée des puits de repli pour un traitement médicamenteux donné. - Préparer la solution ligand 13.5x dans le support essentiel minimum d'Eagle modifié tamponné avec HEPES.
- Pour les expériences à température ambiante avec 10 l de 13,5x ligand s'ajoutent, ajoutez les composés à l'aide d'injecteurs ou d'une pipette multicanal et mélangez la plaque à la main ou à l'aide d'un shaker orbital (20 s à 200 tr/min).
- Pour les expériences à 37,5 oC avec 10 L d'ajout de ligand 13,5x, utilisez des injecteurs pour distribuer des composés et mélanger en utilisant le shaker orbital de l'instrument. En cas de non-utilisation d'injecteurs, retirer la plaque du luminomètre, ajouter les ligands et mélanger la plaque à la main ou à l'aide d'un shaker orbital (20 s à 200 tr/min).
REMARQUE : Utilisez des injecteurs et un shaker dans l'instrument de détection pour minimiser les fluctuations de température associées à l'enlèvement de la plaque du luminomètre. Les luminomètres standard de banc peuvent être employés pour cet analyse. Utilisez un temps d'intégration de 0,25 à 2 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilisant la procédure présentée ici, les interactions entre un GPCR prototypique et deux isoformes de '-arrestin ont été surveillées. Des constructions de récepteurs de peptides (GLP-1r) ont été faites à l'aide d'amorces contenant des sites de restriction d'enzymes NheI et EcoRI et clonées dans les vecteurs pBiT1.1-C [TK/LgBiT] et pBiT2.1-C [TK/SmBiT] alors que dans le cas de l'arrêt ins, deux vecteurs supplémentaires ont été pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT] utilisant les sites de restriction enzymatiques BgIII et EcoRI dans le cas de l'arrêt-arrêt2 et de l'ile xhoI dans le cas de l'arrêt-arrêt1. Les cellules HEK293 ont été transfectées à l'aide de 50 ng de GLP-1r-LgBiT/SmBiT et de 50 ng de 'arrestin'a marqué avec LgBiT ou SmBiT au terminal N ou C. Quatre combinaisons de plasmides différentes ont été examinées (figure 3) et celle avec le signal luminescent le plus élevé a été choisie pour d'autres expériences (Figure 4). Afin de déterminer les valeurs EC50 pour chaque recrutement isoforme d'arrêtin, des courbes de réponse de dose ont été exécutées en utilisant 10 M, 1 M, 100 nM, 10 nM et 1 nM de concentration de ligands GLP-1 (figure 4c). Des courbes de réponse de dose ont été obtenues à partir de la réponse maximale de chaque concentration des études cinétiques (figure 4a, 4b).
Figure 1. Séquences de nucléotides des sites multiclons des vecteurs utilisés dans la conception de l'analyse de complémentation structurale GLP-1r--arrestin1/2.
Afin de développer l'analyse de complémentarité structurelle pour le système GLP-1r--arrestin1/2, il a été nécessaire d'étiqueter au C-terminal le GLP-1r avec LgBiT et SmBiT en utilisant les restrictions enzymatiques NheI et EcoRI au pBiT1.1-C [TK/LgBiT] et pBiT2.1-C [TK/SmBiT] vecteur. Dans le cas de l'arrêt-arrêt1/2, ils ont également été étiquetés avec le LgBiT et le SmBiT au terminal C et N en utilisant les restrictions enzymatiques BglII/EcoRI pour l'arrêt-arrêt2 et le NheI/XhoI pour l'arrêt-arrêt1 aux quatre vecteurs. Tous les vecteurs utilisent le promoteur HSV-TK pour minimiser l'association non spécifique et réduire les artefacts expérimentaux et chaque vecteur contient une cassette d'expression pour la résistance à l'ampicilline chez les bactéries. Image adaptée de la référence 11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Représentation schématique de l'analyse de complémentation structurale gpCR:-arrestin1/2.
(a) Comment fonctionne le GPCR : -arrestin1/2 analyse de complémentation structurelle en présence de ligand. ( b) Représentation structurelle des différentes combinaisons de plasmides pour les isoformes GPCR et '-arrestin's marqués avec LgBiT ou SmBiT. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Dépistage d'orientation GLP-1r/MD-arrestins.
Afin d'obtenir la sensibilité la plus élevée, 4 combinaisons de plasmides différentes ont été exprimées pendant 24 h après la transfection. Des signaux luminescents ont été détectés dans presque toutes les combinaisons de plasmides différentes (a-c) à l'exception d'un seul GLP-1r : l'orientation de l'arrestine (d). Les résultats sont exprimés comme moyen - S.E.M. de deux expériences effectuées en double; chaque double a été moyenné avant de calculer le S.E.M. Les flèches indiquent l'heure à laquelle les cellules ont été traitées avec GLP-1 à la concentration finale de 10 M. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Les interactions GLP-1r--arrestin1/2 sont dépendantes de la dose.
Dose dépendante ligand relation de '-arrestin2 (a) et '-arrestin1 recrutement (b). Courbes de réponse des doses montrant un recrutement différentiel entre '-arrestin1 et 'arrestin2 par GLP-1r (c). Les résultats sont exprimés comme moyen - S.E.M. de deux expériences effectuées en double; chaque double a été moyenné avant de calculer le S.E.M. Les flèches indiquent l'heure à laquelle les cellules ont été traitées avec gLP-1 aux concentrations correspondantes (10 M, 1 M, 100 nM, 10 nM et 1 nM, concentrations finales). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| vecteur | Restriction d'enzyme utilisée | Séquence d'apprêt |
| pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | Saci | 5 -XXXXXXXXGAGCTCC(Rev SI)-3 |
| Ecori | 5 -XXXXXXXXGAATTCCC(Rev SI)-3 | |
| XhoI XhoI | 5 -XXXXXXXXCTCGAGCC(Rev SI)-3 | |
| pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | Xho Xho | 5-XXXXXXXXCTCGAGCGGT (SI)-3 |
| Saci | 5-XXXXXXXXGAGCTCAG(SI)-3 | |
| Ecori | 5-XXXXXXXXGAATTCA(SI)-3 |
Tableau 1. Séquences d'amorces pour les différents sites d'enzymes de restriction dans la séquence de codage du linker pour les vecteurs pBiT1.1 et pBiT2.1.
SI - Séquence d'intérêt; Rev SI - inverser complémentaire de la séquence d'intérêt. Tableau adapté de la référence 11.
| vecteur | Séquence Linker | Restriction d'enzyme utilisée | ||
| pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | SI-GlyAlaGlnGlyAsnSerGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlySerSerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerSerGlyGly | Saci | ||
| SI-GlyAsnSerGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerSerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGLySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGly | Ecori | |||
| SI-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGSerGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerG | XhoI XhoI | |||
| pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerGlySer SerGlySer | XhoI XhoI | ||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyAlaGln-SI | Saci | |||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlySerGlyGlyAlaGllglyAsnSer-SI | Ecori | |||
Tableau 2. Les séquences d'acides aminés De Linker liées aux sites de restriction SacI, EcoRI ou XhoI dans les vecteurs pBiT1.1 et pBiT2.1.
Les résidus rouges doivent être codés par des amorces PCR. Tableau adapté de la référence 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En utilisant la méthode présentée ici, les interactions entre n'importe quel GPCR et '-arrestin1'2 peuvent être surveillées dans des systèmes de vie en temps réel en utilisant cet analyse de complémentation structurale GPCR---arrestin. À cet égard, nous avons pu observer un recrutement différentiel entre les deux isoformes de l'arrêt-arrêt par le GLP-1r (UN GPCR prototypique de classe B), nous avons également observé une dissociation du complexe récepteur--arrestin quelques minutes après avoir atteint le maximum signal luminescent.
Afin d'avoir la meilleure sensibilité dans le système d'analyse de complémentarité structurelle, il a été examiné avec quatre orientations spatiales différentes entre le récepteur et chaque isoforme de l'arrêt et celui avec le signal luminescent le plus élevé a été utilisé pour postérieur des études telles que les courbes de stimulation de la dose (figure 4). En utilisant cette méthodologie, il a été possible de caractériser les interactions récepteur--arrestin à l'aide d'un GPCR de grande valeur thérapeutique dans les maladies endocrinoologiques telles que le diabète sucré15. De la même manière, cette stratégie peut être facilement adaptée à n'importe quel GPCR en étiquetant simplement le GPCR d'intérêt avec LgBiT ou SmBiT au C-terminal et en utilisant les constructions de l'arrêt-arrêt1/2 décrites ici et elle apparaît comme une alternative puissante aux méthodologies actuelles sans la nécessité d'un complexe mis en place où le chevauchement entre le donneur et l'accepteur peut être un obstacle comme dans certains cas de BRET et FRET. Un autre avantage important est que les vecteurs utilisés dans ce système contiennent des promoteurs de faible expression dans une tentative d'imiter les niveaux d'expression endogènes. Avec cette fonctionnalité, nous pouvons exclure la possibilité d'associations non spécifiques en raison des niveaux élevés d'expression du récepteur et/ou de l'arrêtin. Dans la figure 3 et la figure 4, il y a une nette différence dans le complexe récepteur--arrestin entre le '-arrestin1 et '-arrestin2 et aussi une plus grande efficacité et intensité vers '-arrestin1 au-dessus de '-arrestin2. Le dépistage en quatre orientations différentes a été proposé pour augmenter la sensibilité de l'analyse rendant le système très sensible, même à des niveaux d'expression endogènes.
Cette méthodologie est très simple à réaliser. Peut-être l'étape la plus critique dans ce protocole est la conception d'apprêt pour amplifier le récepteur d'intérêt. L'utilisateur doit être très prudent dans la sélection de l'enzyme de restriction à utiliser selon la figure 1 et sur la base de cela pour ajouter les nucléotides correspondants aux amorces ( tableau1) pour coder les acides aminés surlignés rouges (tableau 2).
Une limitation de cette méthodologie peut être que la furimazine se dégradera dans une solution aqueuse au pH physiologique ou proche, conduisant à une diminution progressive de l'intensité de la luminescence indépendamment de tout changement dans les interactions GPCR--arrestin16. Pour surmonter cette limitation, l'utilisateur doit toujours inclure un contrôle de normalisation (échantillons traités par véhicule) lors de la surveillance continue de la luminescence pendant de longues périodes. Il est également important d'utiliser de faibles niveaux de sérum bovin fœtal pendant l'étude car sa présence pourrait augmenter le taux de dégradation de la furimazine16. Un problème qui peut survenir au cours de l'analyse est que pour les valeurs luminescentes pour une interaction connue GPCR---arrestin ne peut pas être une augmentation significative n'est enregistrée par rapport aux valeurs de la ligne de base dans les quatre combinaisons différentes plasmide. Cela peut être dû à la faible expression du promoteur HSV-TK17. Dans ce cas, une alternative consiste à sublimer les cadres de lecture ouverts codant les protéines de fusion LgBiT et SmBiT en vecteurs d'expression à l'aide du promoteur CMV. Lors du passage à un promoteur plus fort, l'optimisation de la quantité d'ADN transfecté doit être faite afin d'obtenir la meilleure réponse d'analyse.
Grâce à cet analyse de complémentation structurelle, nous avons pu observer avec une grande précision les interactions de recrutement de la classe B prototypique. En utilisant cette méthode, il est possible de caractériser pharmacologiquement de nouveaux médicaments d'intérêt particulier ciblant les GPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions du Programme de recherche (NRF- 2015M3A9E7029172) de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le Ministère des sciences, des TIC et de la Planification future.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
