Summary
Le interazioni di GPCR-z-arrestin sono un campo emergente nella scoperta di farmaci GPCR. Metodi accurati, precisi e facili da impostare sono necessari per monitorare tali interazioni nei sistemi viventi. Mostriamo un saggio di complemento strutturale per monitorare le interazioni di GPCR-arresto-arresto in celle viventi in tempo reale, e può essere esteso a qualsiasi GPCR.
Abstract
Le interazioni tra i recettori accoppiati alle proteine G (GLR) e gli arresti z sono processi vitali con implicazioni fisiologiche di grande importanza. Attualmente, la caratterizzazione di nuovi farmaci verso le loro interazioni con gli arresti z e altre proteine citosoliche è estremamente preziosa nel campo della scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo studio dell'agonismo di parte della GPCR. Qui, mostriamo l'applicazione di un nuovo saggio di complemento strutturale per monitorare con precisione le interazioni recettore-arresto in sistemi viventi in tempo reale. Questo metodo è semplice, preciso e può essere facilmente esteso a qualsiasi GPCR di interesse e ha anche il vantaggio di superare interazioni non specifiche a causa della presenza di un promotore di bassa espressione presente in ogni sistema vettoriale. Questa analisi di complemento strutturale fornisce caratteristiche chiave che consentono un monitoraggio accurato e preciso delle interazioni recettore-z-arrestin, rendendolo adatto nello studio dell'agonismo distorto di qualsiasi sistema GPCR e del GPCR c-terminus 'phosphorylation diversi codici 'scritti da diverse chinasi GPCR (GRK) e modifiche post-traduzionali di arrestini che stabilizzano o destabilizzano il complesso recettore-arresto.
Introduction
I GPD rappresentano l'obiettivo di quasi il 35% dei farmaci attuali sul mercato1,2 e una chiara comprensione della loro farmacologia è cruciale nello sviluppo di nuovi farmaci terapeutici3. Uno degli aspetti chiave nella scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo sviluppo di agonisti di parte è la caratterizzazione di nuovi ligandi verso le interazioni recettore-arresto4 e le interazioni di arresto-arresto con altre proteine citosoliche come come clathrin5.
È stato documentato che la segnalazione dipendente da z-arrestin svolge un ruolo chiave nei disturbi neurologici come il disturbo bipolare, la depressione maggiore e la schizofrenia6 e anche gravi effetti collaterali in alcuni farmaci come la morfina7.
I metodi attuali utilizzati per monitorare queste interazioni di solito non rappresentano livelli endogeni effettivi delle proteine in studio, in alcuni casi mostrano segnale debole, fotosbiancamento e a seconda del GPCR potrebbe essere tecnicamente difficile da impostare8. Questa nuova analisi di complemento strutturale utilizza vettori promotori di bassa espressione per simulare livelli fisiologici endogeni e fornisce un'elevata sensibilità rispetto ai metodi attuali9. Utilizzando questo approccio, è stato possibile caratterizzare facilmente le interazioni di Galanin receptor-z-arrestin11/2 e anche di z-arrestin2-clathrin10. Questa metodologia può essere ampiamente utilizzata per qualsiasi GPCR di particolare interesse in cui gli arresti z svolgono una funzione fisiologica chiave o la loro segnalazione è rilevante in alcune malattie.
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Protocol
1. Strategia di progettazione dei primer
- Progettare i primi geni di interesse nei vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT].
- Selezionare almeno uno di questi tre siti come uno dei due enzimi di restrizione univoci necessari per la clonazione direzionale a causa della presenza di un codon di stop in-frame che divide il sito di multicloning come illustrato nella Figura 111.
- Incorporare la sequenza dei nucleotidi nei primer come illustrato nella Tabella 1 per codificare i residui del linker visualizzati in rosso nella tabella 211.
- Per i vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT2.1-C [TK/SmBiT], assicurarsi che il numero a 5 contenga un codone ATG e una potente sequenza di consenso Kozak (GCCGCCACC).
- Per i vettori pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT], assicurarsi che il 3 - primer contenga un codone di arresto.
NOTA: Ogni vettore contiene il promotore HSV-TK per ridurre al minimo l'associazione non specifica e ridurre gli artefatti sperimentali, inoltre ogni vettore ha una cassetta di espressione per la resistenza all'antipicillina nei batteri.
2. PCR
- Impostare ed eseguire le reazioni PCR per amplificare il DNA inserto del gene di interesse utilizzando i primer progettati dal punto 1. È importante usare una polimerasi del DNA ad alta fedeltà per ridurre al minimo le mutazioni.
- Utilizzare esattamente il seguente ordine per preparare 50 l-L di reazione PCR. Aggiungere 35,5 l di acqua distillata, 5 lofani da 10 x il tampone di polimerasi, 5 di miscela dNTP (2,5 mM ciascuno), 1 l l di modello plasmide (200 ng/LL), 1,25 l di intornatori avanti e primo (10 M) e 1 l of high-polymerase (5 U/LL).
- Utilizzando un termociclore impostare il seguente programma di amplificazione del DNA.
- Denaturare a 95 gradi centigradi per 5 min.
- Ripetere 25 volte il seguente ciclo termico: 95 gradi centigradi per 30 s, 60 gradi centigradi per 1 min, 72 s per 2 min per 1 kbp da amplificare.
- Eseguire un'estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 min.
- Tenere i campioni a 4 gradi centigradi all'interno del termociclore.
NOTA: Si consiglia vivamente di utilizzare una polimerasi ad alta fedeltà per ridurre al minimo le mutazioni puntiformi in particolare quelle che si verificano durante l'amplificazione di sequenze lunghe. Man mano che l'amplificatore diventa più lungo, il grado di precisione nella replicazione del DNA diminuisce. Per la reazione PCR, scegliere la temperatura di annessione in base alla temperatura di fusione della regione in cui le oligosisidirettamente si ibridano con il modello di DNA e non con tutta la sequenza del primer.
- Purificazione del prodotto PCR
- Isolare il prodotto PCR dal resto della reazione PCR utilizzando un kit da un produttore di preferenza12. Il prodotto PCR è ora pronto per la digestione delle restrizioni.
3. digestione del DNA
- Per la digestione del prodotto PCR preparare 50 : L di reazione di digestione come segue.
- Utilizzando un tubo da 1,5 mL, aggiungere 12 l di acqua distillata.
- Aggiungere 5 - L di 10x buffer con la migliore compatibilità con entrambi gli enzimi di restrizione.
- A partire dalla 2.4 aggiungere 30 ll di prodotto PCR
- Infine, aggiungere 1,5 l di ogni enzima di restrizione.
- Mescolare brevemente per vortice e incubare a 37,5 gradi durante la notte.
- Per la digestione del plasmide ricevente preparare 50 L di reazione di digestione come segue:
- Utilizzando un tubo da 1,5 mL, aggiungere 23 l di acqua distillata.
- Aggiungere 5 - L di 10x buffer con la migliore compatibilità con entrambi gli enzimi di restrizione.
- Aggiungere 15 l di plasmide del recipiente (200 ng/L).
- Aggiungere 1,5 l di ogni enzima di restrizione.
- Mescolare brevemente per vortice e incubare a 37,5 gradi durante la notte.
NOTA: È importante utilizzare 3 g di plasmide ricevente per ottenere materiale sufficiente dopo la purificazione del gel di agarose DNA. È anche rilevante lasciare le digestione del DNA durante la notte utilizzando entrambi gli enzimi per ottenere un'elevata efficienza di clonazione.
4. Purificazione e clonazione del gel di agarose DNA
- Preparare un gel di agarose dell'1% per eseguire il plasmide di DNA digerito e gli inserti e procedere a tagliare le bande corrispondenti. Una volta che le bande vettoriali e inserto corrispondenti sono state purificate12, determinare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro.
- Eseguire la legatura del DNA per fondere l'inserto al plasmide del destinatario.
- Preparare le reazioni di legatura di circa 100 ng di DNA totale tra cui 50 ng di vettore plasmide.
- Impostare il rapporto di inserimento plasmid del destinatario di circa 1:3; può essere calcolato utilizzando una calcolatrice di inserimento vettoriale13.
- Impostare i controlli negativi in parallelo. Ad esempio, una legatura del DNA plasmide del destinatario senza alcun inserto fornirà informazioni sulla quantità di background del plasmide del destinatario non digerito o auto-ligante.
5. Trasformazione dei cloni
- Collocare un tubo di celle competenti del DH5 dal congelatore a -80 gradi centigradi e trasferirlo immediatamente sul ghiaccio per 20 min.
- Dopo di che, prendere 55 L di cellule competenti DH5 e aggiungere 4 L di reazione di legatura e mescolare facendo scorrere il tubo e conservare sul ghiaccio per 45 min.
- Mettere il tubo in un bagno d'acqua precedentemente riscaldato a 42 gradi centigradi per esattamente 48 s e ottenere immediatamente i tubi di nuovo sul ghiaccio per altri 3 min.
- Aggiungere 600 l- di Luria Broth (LB) in precedenza riscaldato a 37,5 gradi centigradi e incubare con agitazione per 1 ora a 200 giri/min.
- Trasferire 200 l in una piastra di agar contenente ampicillina 100 g/mL e spalmati delicatamente sulla superficie con il liquido viene per lo più assorbito.
- Incubare le piastre durante la notte per vedere le colonie mattina successiva. Il plasmide ricevente sulla piastra di inserimento dovrebbe avere un numero significativamente maggiore di colonie rispetto alla sola piastra del plasmide ricevente.
6. Isolamento del plasmide finito
- Scegli 3-10 colonie batteriche individuali e trasferiscili in 1 mL di lB media contenente ampicillina (100 g/mL) e incuba per 6 h.
- Prendere 200 litri di sospensione batterica e trasferirli a 5 mL di lB media contenente la stessa concentrazione di ampicillina del punto 6.1 e incubare pernottamento a 37,5 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/m.
- Utilizzando una purificazione del kit di DNA miniprep, eseguire miniprep dna purifications utilizzando 5 mL di LB coltivato durante la notte seguendo le istruzioni del produttore14.
- Per identificare i ligazioni riuscite, impostare le reazioni PCR allo stesso modo della sezione 2 utilizzando il DNA ottenuto dal passaggio 6.3 come modello con gli stessi primer della sezione 2 durante la prima PCR. Cloni positivi produrranno prodotti PCR con le dimensioni corrispondenti.
- Dopo una grande purificazione del DNA di preparazione dei cloni positivi, condurre una digestione diagnostica restrizione di 500 ng di DNA purificato con gli enzimi utilizzati durante la fase di clonazione ed eseguire i prodotti digeriti su un 1% gel di agarose. Dovrebbero essere presenti due bande: una delle dimensioni del vettore e una la dimensione del nuovo inserto.
- Verificare la sequenza di costruzione sequenziando utilizzando i seguenti numeri primi: Avanti 5'- aaggtgagcgtgtgggcctcgaac-3' e inverso 5'-gcatttttttcactgctagttt-3'.
NOTA: Quando il DNA viene replicato utilizzando la PCR, c'è sempre la possibilità di errori durante l'amplificazione anche quando si utilizza una polimerasi ad alta fedeltà, quindi è molto importante per sequenziare i costrutti finali.
7. La trasfezione e l'espressione proteica
- In una piastra bianca precedentemente rivestita in poli-L-lisina 96, eseguire la semina cellulare un giorno prima della trasfezione a 2,5 x 104 celle per pozzo utilizzando il mezzo di Alano modificato di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 100 U/mL penicillinA G e 100 g/ mL streptomicina.
- Utilizzare solo i 60 pozzi interni per ridurre al minimo il potenziale di gradienti termici attraverso la piastra e gli effetti del bordo dall'evaporazione. Aggiungete 200 l di acqua distillata sterile ai 36 pozzi esterni e 150 l negli spazi tra i pozze e incubate durante la notte a 37,5 gradi centigradi e il 5% di CO2.
- La mattina seguente esegue la trasfezione utilizzando 100 ng di DNA totale (50 ng ogni costrutto).
- Impostare quattro diverse combinazioni di plasmide (recettore:z-arrestin) secondo la figura 2b.
- Per ogni combinazione di plasmide utilizzare 20 -L del Minimum Essential Media dell'Aquila modificato memorizzato nel buffer con HEPES utilizzando 0,3 dollari di reagente di trasfezione lipidico per pozzo.
- Aggiungere 20 - L di miscela reagente-DNA di trasfeone lipidica ad ogni pozzo e mescolare la piastra in cerchi per 10 s.
- Cambiare il mezzo fresco dopo 6 ore di incubazione a 37,5 sC e 5% CO2.
- Incubare la piastra per 24 h a 37,5 gradi centigradi e il 5% di CO2.
8. Monitoraggio delle interazioni recettore-arresto-z-arresto1/2 nelle cellule HEK293
- Aspirare il mezzo e aggiungere 100 l di Eagle's Minimum Essential Media modificato memorizzato nel buffer con HEPES in ogni pozzo e lasciare che la piastra si stabilizzi a RT per 10 min.
- Preparare il substrato di furimazine combinando 1 volume di 100x substrato con 19 volumi di LCS Dilution Buffer (una diluizione di 20 volte)11, creando un stock 5x da mescolare con il mezzo di coltura cellulare.
- Aggiungere 25 luna di 5x furimazine ad ogni pozzo e mescolare delicatamente a cerchi per 10 s.
- Misurare la luminescenza per 10 min per la stabilizzazione del segnale a RT.
NOTA: Utilizzando questo segnale di base per normalizzare la risposta di ogni pozzo contribuirà a ridurre la variabilità causata dalle differenze nel numero di cellule placcate per bene, anche differenze nell'efficienza della trasfezione, ecc. Una volta calcolato, calcolare la media della risposta normalizzata da pozzi replicati per un determinato trattamento farmacologico. - Prepara una soluzione di ligando 13.5x nel Minimum Essential Media di Eagle modificato con HEPES.
- Per esperimenti a temperatura ambiente con 10 .
- Per gli esperimenti a 37,5 gradi centigradi con 10 luna di 13,5 volte l'aggiunta di ligando, utilizzare iniettori per erogare composti e mescolare utilizzando lo shaker orbitale dello strumento. In caso di non utilizzo di iniettori, rimuovere la piastra dal luminometro, aggiungere i ligandanti e mescolare la piastra a mano o utilizzando uno shaker orbitale (20 s a 200 rpm).
NOTA: Utilizzare iniettori e uno shaker all'interno dello strumento di rilevamento per ridurre al minimo le fluttuazioni di temperatura associate alla rimozione della piastra dal luminometro. Per questo saggio è possibile utilizzare i luminometri standard della panca. Utilizzare un tempo di integrazione di 0,25–2 s.
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Representative Results
Utilizzando la procedura qui presentata, sono state monitorate le interazioni tra un prototipo di GPCR e due isoformi di arresto z. Glucagon come il recettore peptide (GLP-1r) sono stati realizzati utilizzando primer contenenti siti di restrizione enzimatica NheI ed EcoRI e clonati nei vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mentre, nel caso degli arresti zin, due vettori aggiuntivi sono stati, due vettori aggiuntivi sono stati ha usato pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT] utilizzando siti di restrizione enzimatica BgIII ed EcoRI nel caso di z-arrestin2 e NheI e XhoI nel caso di z-arrestin1. Le cellule HEK293 sono state traffettate utilizzando 50 ng di GLP-1r-LgBiT/SmBiT e 50 ng di z-arrestin etichettati con LgBiT o SmBiT al N- o C-terminale. Sono state selezionate quattro diverse combinazioni di plasmidi (Figura 3) e quella con il segnale luminescente più alto è stata scelta per ulteriori esperimenti (Figura 4). Per determinare i valori EC50 per ogni assunzione isoforme z-arrestin, le curve di risposta alla dose sono state eseguite utilizzando 10 M, 1 m, 100 nM, 10 nM e 1 nM di concentrazione di ligando GLP-1 (Figura4c). Le curve di risposta alla dose sono state ottenute dalla risposta massima di ogni concentrazione dagli studi cinetici (Figura 4a, 4b).
come illustrato nella Figura 1. Sequenze nucleotidiche dei siti multiclonazione dei vettori utilizzati nella progettazione del saggio di complemento strutturale GLP-1r-z-arrestin1/2.
Al fine di sviluppare la prova di complemento strutturale per il sistema GLP-1r-z-arrestin1/2, è stato necessario etichettare presso il terminale C il GLP-1r con LgBiT e SmBiT utilizzando le restrizioni enzimatiche NheI ed EcoRI presso il pBiT1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT2.1-C [TK/SmBiT] vettore m. Nel caso di z-arrestin1/2 sono stati etichettati con il LgBiT e smBiT al terminale C- e N utilizzando le restrizioni enzimatiche BglII/EcoRI per z-arrestin2 e NheI/XhoI per z-arrestin1 presso i quattro vettori. Tutti i vettori utilizzano il promotore HSV-TK per ridurre al minimo l'associazione non specifica e ridurre gli artefatti sperimentali e ogni vettore contiene una cassetta di espressione per la resistenza all'ampicillina nei batteri. Immagine adattata dal riferimento 11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Rappresentazione schematica del saggio di complemento strutturale GPCR: z-arrestin1/2.
(a) Come funziona il saggio di complemento strutturale GPCR: z-arrestin1/2 in presenza di ligando. (b) Rappresentazione strutturale delle diverse combinazioni di plasmidi per le isoforme GPCR e z-arrestin contrassegnate con LgBiT o SmBiT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. screening dell'orientamento GLP-1r/z-arrestins.
Al fine di ottenere la massima sensibilità sono state espresse 4 diverse combinazioni di plasmidi a 24 ore dopo la trasfezione. Sono stati rilevati segnali luminescenti in quasi tutte le diverse combinazioni di plasmide (a-c) ad eccezione di un solo orientamento GLP-1r: z-arrestin (d). I risultati sono espressi come media: S.E.M. di due esperimenti eseguiti in duplicato; ogni duplicato è stato mediato prima di calcolare il S.E.M. Le frecce indicano l'ora in cui le cellule sono state trattate con GLP-1 a una concentrazione finale di 10 M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 4. Le interazioni GLP-1r-z-arrestin1-2 sono dipendenti dalla dose.
Rapporto ligando dipendente dalla dose di assunzione di z-arrestin2 (a) e z-arrestin1 (b). Curve di risposta alla dose che mostrano il reclutamento differenziale tra z-arrestin1 e z-arrestin2 da glP-1r (c). I risultati sono espressi come media: S.E.M. di due esperimenti eseguiti in duplicato; ogni duplicato è stato mediato prima di calcolare il S.E.M. Le frecce indicano il momento in cui le cellule sono state trattate con GLP-1 alle concentrazioni corrispondenti (10 m, 1 M, 100 nM, 10 nM e 1 nM, concentrazioni finali). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| vettore m | Restrizione enzimatica utilizzata | Sequenza primer |
| pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | Saci | 5 -XXXXXXXXXCTCC(Rev SI)-3 |
| EcoRI | 5 -XXXXXXXXXXXXXSIATTCCC(Rev SI)-3 | |
| XhoI | 5 - XXXXXXXXCTCGAGCC(Rev SI)-3 | |
| pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | Xho | 5-XXXXXXXXXCGAGCGGT (SI)-3 |
| Saci | 5 - XXXXXXXXGAGCTCAG(SI)-3 | |
| EcoRI | 5-XXXXXXXXXXXXXSIATTCA(SI)-3 |
Tabella 1. Sequenze di primer per i diversi siti di enzimi di restrizione nella sequenza di codifica del linker per i vettori pBiT1.1 e pBiT2.1.
SI - Sequenza di interesse; Rev SI: storna complementare alla sequenza di interessi. Tabella adattata dal riferimento 11.
| vettore m | Sequenza del linker | Restrizione enzimatica utilizzata | ||
| pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | SI-GlyAlaGlnGlyAsnSerGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerGlySerGlySerGly-(LgBiT/SmBiT) | Saci | ||
| SI-GlyAsnSerGlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerGly-(LgBiT/SmBiT) | EcoRI | |||
| SI-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerGly-(LgBiT/SmBiT) | XhoI | |||
| pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerSerGly-SI | XhoI | ||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlyAlaGln-SI | Saci | |||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerLyGlySerGlyGlyGlyGlyGlyAGlnGlyAsnSer-SI | EcoRI | |||
Tabella 2. Sequenze di amminoacidi del linker correlate ai siti di restrizione SacI, EcoRI o XhoI nei vettori pBiT1.1 e pBiT2.1.
I residui rossi devono essere codificati dai primer PCR. Tabella adattata dal riferimento 11.
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Discussion
Utilizzando il metodo qui presentato, le interazioni tra qualsiasi GPCR e .-arrestin1 1/2 possono essere monitorate in sistemi viventi in tempo reale utilizzando questo saggio di complemento strutturale GPCR-arresto-arresto. A questo proposito, siamo stati in grado di osservare il reclutamento differenziale di z-arrestin tra le due isoformi z-arrestin dal GLP-1r (Un prototipo di GPCR di classe B), abbiamo anche osservato una dissociazione del complesso recettore-z-arrestin pochi minuti dopo aver raggiunto il massimo segnale luminescente.
Al fine di avere la migliore sensibilità nel sistema di analisi di complemento strutturale, è stato esaminato con quattro diversi orientamenti spaziali tra il recettore e ogni isoforme z-arrestin e quello con il più alto segnale luminescente è stato utilizzato per il posteriore studi come le curve di stimolazione della risposta alla dose (Figura 4). Utilizzando questa metodologia è stato possibile caratterizzare le interazioni recettore-z-arrestin utilizzando un GPCR di alto valore terapeutico nelle malattie endocrinologiche come il diabete mellito15. Allo stesso modo questa strategia può essere facilmente adattata a qualsiasi GPCR aggulando semplicemente il GPCR di interesse con LgBiT o SmBiT al terminale C e utilizzando i costrutti di z-arrestin1/2 qui descritti ed emerge come una potente alternativa alle attuali metodologie senza la necessità di un complesso allestito in cui la sovrapposizione tra donatore e accettatore può essere un ostacolo come in alcuni casi di BRET e FRET. Un altro vantaggio significativo è che i vettori utilizzati in questo sistema contengono promotori di espressione bassa nel tentativo di simulare livelli di espressione endogeni. Con questa caratteristica, possiamo escludere la possibilità di associazioni non specifiche a causa di alti livelli di espressione del recettore e/o z-arrestin. Nella Figura 3 e nella Figura 4,c'è una netta differenza nel complesso recettore-arresto tra z-arrestin1 e z-arrestin2 e anche una maggiore efficacia e intensità nei confronti dell'arresto1 rispetto a z-arrestin2. È stato proposto lo screening in quattro diversi orientamenti per aumentare la sensibilità del saggio rendendo il sistema altamente sensibile anche a livelli di espressione endogeni.
Questa metodologia è molto semplice da eseguire. Forse il passo più critico all'interno di questo protocollo è il design primer per amplificare il recettore di interesse. L'utente deve prestare molta attenzione nella scelta dell'enzima di restrizione da utilizzare in base alla figura 1 e in base a questo per aggiungere i nucleotidi corrispondenti ai primer (Tabella 1) per codificare gli amminoacidi evidenziati in rosso ( Tabella2).
Una limitazione di questa metodologia può essere che la furimazina si degrada in una soluzione acquosa a pH o quasi fisiologica, portando ad una graduale diminuzione dell'intensità della luminescenza indipendente da qualsiasi cambiamento nelle interazioni GPCR-z-arrestin16. Per superare questa limitazione l'utente deve sempre includere un controllo di normalizzazione (campioni trattati con veicolo) quando monitora continuamente la luminescenza per lunghi periodi di tempo. È anche importante utilizzare bassi livelli di siero bovino fetale durante il saggio poiché la sua presenza potrebbe aumentare il tasso di degradazione della furimazina16. Un problema che può sorgere durante il saggio è che per i valori luminescenti per un'interazione noto GPCR-arrestin non può essere registrato alcun aumento significativo rispetto ai valori della linea di base in tutte e quattro le diverse combinazioni di plasmide. Ciò può essere dovuto alla bassa espressione del promotore HSV-TK17. In tal caso, un'alternativa è quella di sottoclonare i fotogrammi di lettura aperti che codificano le proteine di fusione LgBiT e SmBiT in vettori di espressione utilizzando il promotore CMV. Quando si passa a un promotore più forte, l'ottimizzazione della quantità di DNA trasvenuto dovrebbe essere fatto al fine di ottenere la migliore risposta di analisi.
Utilizzando questo esempio di complemento strutturale siamo stati in grado di osservare con grande precisione le interazioni di reclutamento di z-arrestin1/2 da parte di un prototipo di GPCR di classe B. Utilizzando questo metodo, è possibile caratterizzare farmacologicamente nuovi farmaci di particolare interesse mirati ai GPCR.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca (NRF- 2015M3A9E7029172) della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero della Scienza, iCT e Pianificazione Futura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
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