Summary
Her beskriver vi en trinvis protokol af kirurgisk aorta debanding i den veletablerede mus model af aorta-indsnævring. Denne procedure ikke kun tillader at studere de mekanismer, der ligger til grund for venstre ventrikel omvendt remodeling og regression af hypertrofi, men også at teste nye terapeutiske muligheder, der kan fremskynde myokardie opsving.
Abstract
For bedre at forstå venstre ventrikulær (LV) omvendt remodeling (RR), beskriver vi en gnaver model, hvori, efter aorta banding-induceret LV remodeling, mus gennemgår RR ved fjernelse af aorta indsnævring. I dette papir beskriver vi en trinvis procedure til at udføre en minimalt invasiv kirurgisk aorta debanding hos mus. Ekkokardiografi blev efterfølgende brugt til at vurdere graden af hjertehypertrofi og dysfunktion under LV remodeling og RR og til at bestemme den bedste timing for aorta debanding. I slutningen af protokollen blev der udført terminal hæmodynamisk evaluering af hjertefunktionen, og der blev indsamlet prøver til histologiske undersøgelser. Vi viste, at debanding er forbundet med kirurgiske overlevelsesrater på 70-80%. To uger efter debanderingen udløser den betydelige reduktion af ventrikulær efterlast desuden regressionen af ventrikikulær hypertrofi (~20%) og fibrose (~26%), genvinding af diastolisk dysfunktion som vurderet ved normalisering af venstre ventrikelfyldning og end-diastolisk tryk (E/e' og LVEDP). Aorta debanding er en nyttig eksperimentel model til at studere LV RR hos gnavere. Omfanget af myokardie opsving er variabel mellem emner, derfor efterligner mangfoldigheden af RR, der opstår i den kliniske sammenhæng, såsom aortaklappen udskiftning. Vi konkluderer, at den aorta banding / debanding model repræsenterer et værdifuldt redskab til at optrævle nye indsigter i mekanismerne i RR, nemlig regression af hjerte hypertrofi og inddrivelse af diastolisk dysfunktion.
Introduction
Indsnævring af den tværgående eller opstigende aorta i musen er en udbredt eksperimentel model for trykoverbelastningsinduceret hjertehypertrofi, diastolisk og systolisk dysfunktion og hjertesvigt1,2,3,4. Aorta-indsnævring i første omgang fører til kompenseret venstre hjertekammer (LV) koncentrisk hypertrofi at normalisere væg stress1. Under visse omstændigheder, såsom langvarig hjerteoverbelastning, er denne hypertrofi imidlertid utilstrækkelig til at mindske vægstress, hvilket udløser diastolisk og systolisk dysfunktion (patologisk hypertrofi)5. Sideløbende fører ændringer i ekstracellulær matrix (ECM) til kollagenaflejring og krydslinking i en proces kendt som fibrose, som kan opdeles i udskiftningsfibrose og reaktiv fibrose. Fibrose er i de fleste tilfælde irreversibel og kompromitterer myokardie opsving efter overbelastning relief6,7. Ikke desto mindre viste nylige hjerte magnetiske resonansbilleddannelsesundersøgelser, at reaktiv fibrose er i stand til at regresse på lang sigt8. Alt i alt er fibrose, hypertrofi og hjertedysfunktion en del af en proces kendt som myokardieombygning, der hurtigt udvikler sig i retning af hjertesvigt (HF).
Forståelse af funktionerne i myokardie remodeling er blevet et vigtigt mål for at begrænse eller vende sin progression, sidstnævnte kendt som omvendt remodeling (RR). Udtrykket RR omfatter enhver myokardie ændring kronisk vendt af en given intervention, sådan farmakologisk behandling (f.eks antihypertensive medicin), ventil kirurgi (f.eks aorta stenose) eller ventrikulær hjælpeanordninger (f.eks kronisk HF). Men, RR er ofte ufuldstændig på grund af den fremherskende hypertrofi eller systolisk / diastolisk dysfunktion. Således er afklaringen af RR underliggende mekanismer og nye terapeutiske strategier stadig mangler, hvilket mest skyldes umuligheden af at få adgang til og studere humant myokardievæv under RR hos de fleste af disse patienter.
For at overvinde denne begrænsning har gnavermodeller spillet en væsentlig rolle i at fremme vores forståelse af de signalveje, der er involveret i HF-progression. Specifikt, aorta debanding af mus med en aorta indsnævring repræsenterer en nyttig model til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for negative LV remodeling9 og RR10,11, da det giver mulighed for indsamling af myokardieprøver på forskellige tidspunkter i disse to faser. Desuden giver det en fremragende eksperimentel indstilling til at teste potentielle nye mål, der kan fremme / fremskynde RR. For eksempel, i aorta stenose sammenhæng, denne model kan give oplysninger om de molekylære mekanismer, der er involveret i den enorme mangfoldighed af myokardie svar underliggende (in)fuldstændighed af RR6,12, samt den optimale timing for ventil udskiftning, som repræsenterer en stor mangel ved den nuværende viden. Den optimale timing for dette indlæg er faktisk genstand for debat, hovedsagelig fordi det er defineret på grundlag af omfanget af aortagradienter. Flere undersøgelser går ind for, at dette tidspunkt kan være for sent for myokardie opsving som fibrose og diastolisk dysfunktion er ofte allerede til stede12.
Så vidt vi ved, er dette den eneste dyremodel, der opsummerer processen med både myokardie remodeling og RR, der finder sted under forhold som aorta stenose eller hypertension før og efter ventiludskiftning eller starten af henholdsvis anti-hypertensive medicin.
Søger at løse de udfordringer, der er opsummeret ovenfor, beskriver vi en kirurgisk dyremodel, der kan implementeres både hos mus og rotter og adressere forskellene mellem disse to arter. Vi beskriver de vigtigste trin og detaljer, der er involveret i udførelsen af disse operationer. Endelig rapporterer vi de vigtigste ændringer, der finder sted i LV umiddelbart før og i hele RR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg er i overensstemmelse med vejledningen om pasning og anvendelse af forsøgsdyr (NIH-publikation nr. 85-23, revideret 2011) og den portugisiske lov om dyrevelfærd (DL 129/92, DL 197/96; S2-1131/97). De kompetente lokale myndigheder godkendte denne forsøgsprotokol (018833). Syv uger gamle C57B1/J6-mus blev opretholdt i passende bure med et regelmæssigt 12/12 timers lysmørke cyklusmiljø, en temperatur på 22 °C og 60% fugtighed med adgang til vand og en standard kost ad libitum.
1. Forberedelse af det kirurgiske felt
- Desinficer operationsstedet med 70% alkohol og læg et engangsbordsborddæksel over det kirurgiske område.
- Steriliser alle instrumenterne før operationen.
BEMÆRK: Denne procedure kræver mikrokirurgisk saks, 2 fine buede pincet, 3 fine lige pincet, en skalpel, små pincet, en vinklet dissektorsaks, en nåleholder, et ultrafint ligationsstøtte, 2 hæmostater, og endelig anbefales et magnetisk fikseringssystem (Figur 1A). - Kurve spidsen af en 26 G afstumpet nål til 90 ° for en lettere tilgang til aorta. En 26 G nål vil skabe en 0,45 mm diameter aorta indsnævring (Figur 1B).
- Temperaturen på varmepuden justeres til 37 ± 0,1 °C.
2. Tilberedning og intubation af mus
- Bedøve unge C57B1/J6 mus (20-25 g) ved indånding af 8% sevoflurane med 0,5 - 1,0 L/min 100% O2 i en kegle rør.
- Kontroller anæstesidybden ved hjælp af tåklempningsrefleksen.
- Placer musen på dorsal recumbency på en skrå plade og fortsæt til orotracheal intubation.
- Flyt musen til varmepuden, og tilslut hurtigt orotrachealrøret til ventilatoren for at starte den mekaniske ventilation.
- Respiratorparametrene justeres til en frekvens på 160 vejrtrækninger/min. og et tidevandsvolumen på 10 mL/kg.
3. Forberedelse til kirurgi (til både banding og debanding operationer)
- Barber og påfør depilatory cremen fra halsudskæringen til midten af brystet niveau af musene.
- Påfør oftalmisk gel på dyrenes øjne for at forhindre udtørring af hornhinden.
- Placer en rektal sonde og oximeteret på poten eller halen til overvågning af henholdsvis temperatur og iltning i blodet og puls.
BEMÆRK: Anæstesi fremkalder betydelig hypotermi, derfor er det vigtigt at opretholde normal kropstemperatur under operationen for at undgå et hurtigt fald i pulsen. - Opretholde anæstesi med sevoflurane (2,0 - 3,0%). Kontroller det korrekte niveau af anæstesi ved manglen på tå-knivspids refleks.
- Placer musene i højre-lateral decubitus på en varmepude og fastgør lemmerne til det magnetiske fixator tilbagetrækningssystem med et tape for at holde dyret i den rigtige position under operationen (Figur 2, Figur 3A).
- Desinficere musen brystet med 70% alkohol efterfulgt af providone-jod løsning.
4. Stigende aorta banding kirurgi
BEMÆRK: Du kan finde en detaljeret protokolbeskrivelse i 2,3,4,13.
- Med et engangsblad skal du udføre et lille (~0,5 cm) hudindsnit på venstre side umiddelbart under axillaniveauet og dissekere huden.
- Dissekeres forsigtigt og adskille pectoralis muskel og andre muskellag, indtil ribbenene bliver synlige. Brug fine pincet og undgå at skære musklen.
- Under et mikroskop identificeres intercostalrummene og åbnes et lille snit mellem2. og3.
- Træk ribbenene tilbage ved at placere bryst retractoren (Figur 2A).
- Brug små pincet til forsigtigt at dissekere og adskille thymic lapper indtil stigende aorta bliver synlige.
BEMÆRK: Bomuldsapplikatorer skal være praktiske i tilfælde af blødning. Varm steril saltvand bør gives subkutan i tilfælde af betydelig blødning (f.eks. brystarterien). - Brug små pincet til forsigtigt at dissekere aorta.
BEMÆRK: Aorta anses for at være dissekeret, når der ikke er fedt eller andre vedhæftninger omkring det, og det er muligt nemt at omringe beholderen med en lille kurve pincet. - Efter aortadissektionen anbringes en 7-0 polypropylenetaltur omkring aorta ved hjælp af ligationsstøtte og buede pincet(figur 2B).
- Placer den afstumpede 26 G-nål parallelt med aortaen (spids pegede mod musehovedet) (Figur 2B). For mus, der vejer 20-25 g, fremkalder denne nål en reproducerbar 65-70% aorta indsnævring.
- Lav 2 løse knob omkring aorta og 26 G nål ved hjælp af 2 pincet (Figur 2B).
- Stram 1st knude og hurtigt efter, den 2nd knude. Kort bekræfte den rigtige placering af indsnævring og hurtigt fjerne nålen for at genoprette aorta blodgennemstrømningen. Endelig gør en 3rd knude (BA-gruppen).
- Flyt thymus og musklerne i deres oprindelige position.
- Udfør den falske procedure, der er identisk med indsnævringsproceduren, men hold suturen løs omkring aorta (SHAM-gruppen).
- Skær enderne af suturen og fjern bryst retractoren.
BEMÆRK: Korte suturender kan øge sandsynligheden for, at knuder løsner sig med aortatryk, mens lange ender gør afbindingsproceduren mere risikabel, da der kan forekomme vedhæftninger mellem suturen og venstre atrium. - Luk brystvæggen ved hjælp af 6-0 polypropylen sutur med en simpel afbrudt eller kontinuerlig sutur ved hjælp af det lavest mulige antal sting. Stram den sidste bryst knude med lungerne oppustet i slutningen inspiration ved klemt udstrømningen af ventilatoren for 2s at puste lungerne.
- Luk huden med en 6-0 silke/polypropylen sutur i et kontinuerligt suturmønster.
NOTER: Hvis der bruges en nyere ventilator, er det muligt at programmere den til at holde pause i inspiration (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Postoperativ pleje
- Påfør providone-jodopløsning på hud suturstedet.
- For korrekt analgesi administreres buprenorphin subkutan 0,1 mg/kg, to gange dagligt, indtil dyret kommer sig helt (normalt 2-3 dage efter operationen).
- Injicere steril saltvand intraperitoneally at forhindre dehydrering i tilfælde af betydelig blødning under operationen.
- Sluk for anæstesi (uden at deintubating musen) og vente, indtil dyret genvinde reflekser (whiskers bevægelser er en opvågnen signal) og begynder at trække vejret spontant.
- Fjern luftrørsbeholderen.
- Lad dyret komme sig i en inkubator ved 37 °C.
- Returner dyret til et 12 timers lys/mørkt cyklusrum efter fuld genopretning.
6. Aorta debanding kirurgi
- Syv uger senere, udføre debanding af aorta i halvdelen af BA dyr og fjerne den løse sutur fra halvdelen af SHAM mus, der giver anledning til 2 nye grupper - debanding (DEB) og debanding SHAMA (DESHAM), hhv. DESHAM repræsenterer styringen for DEB-gruppen (figur 4).
- Gentag alle ovenstående trin 2.1 til 3.6.
- Disseker forsigtigt væv, vedhæftninger og fibrose omkring aorta, indtil dens indsnævring bliver synlig.
- Disseker forsigtigt aortaen og adskil suturen fra aortaen. Sæng suturen med vinklet fjedersaks med en sonde(figur 3B).
- Luk brystvæggen ved hjælp af 6-0 polypropylen sutur med en simpel afbrudt eller kontinuerlig sutur ved hjælp af det mindste antal sting muligt.
BEMÆRK: Prøv at stramme den sidste bryst sutur, når lungerne er oppustet for at undgå pneumothorax. - Luk huden med en 6-0 silke/polypropylen sutur i et kontinuerligt suturmønster.
- Udfør alle postoperative plejeprocedurer som nævnt i 5.
- Ofre dyrene 2 uger senere.
7. Ekkokardiografi til vurdering af hjertefunktion og venstre ventrikulær hypertrofi in vivo
- Udfør den ekkokardiografiske eksamen hver 2-3 uger for at følge udviklingen af hypertrofi og hjertefunktion.
- Bedøve dyrene, som beskrevet, ved indånding af 5% sevoflurane med en næsekegler. Juster anæstesiniveauet ved at reducere det til 2,5%.
- Barber og påfør depilatory cremen fra halsudskæringen til midten af brystet niveau.
- Placer dyret på en varmepude og læg EKG-elektroderne. Sørg for et godt EKG-spor, og bevar pulsen mellem 300 og 350 slag/min.
- Overvåg temperaturen (~37 °C).
- Påfør ekkogel og placer dyret til venstre lateral decubitus.
- Start ekkokardiografien, og juster indstillingerne.
- Placer en ultralydssonde over brystkassen.
- Vurder trykgradienten på tværs af bandingen efter henholdsvis 7 og 2 uger efter banding og debanding kirurgi. Placer sonden ved LV's lange akse, og placer strålen over aorta. Tryk på knappen PW for at aktivere pulserende bølge Doppler ekkokardiografi. Efter syv ugers banding vil aortagradienter blive > 25 mmHg i de banded dyr.
- Optag todimensionelle guidede billeder af aorta, der viser tilstedeværelsen eller fraværet af den opstigende aorta indsnævring for anatomisk at visualisere effekten af banding og debanding.
BEMÆRK: Det er muligt at visualisere turbulent flow på indsnævringsniveau, hvis farvetilstanden er tilgængelig. - Vurder hypertrofi ved at placere sonden på en kort LV-akse ved papillært muskelniveau, og tryk på M-mode tracing for at visualisere LV forreste væg (LVAW), LV-diameter (LVD) og LV posterior væg (LVPW) i diastole (D) og systole (S) (Figur 5).
- Vurder systolisk funktion, beregn udslyngningsfraktionen og fraktioneret afkortning som tidligere beskrevet14,15.
- Vurder diastolisk funktion ved 1) bestemmelse af toppen af pulserende bølge Doppler af tidlig og sen mitral flow hastighed (E og A bølger, henholdsvis) ved hjælp af en apiktisk 4-kammer apical opfattelse lige over mitral foldere; 2) optagelse lateral mitral ringformede myokardie tidlig diastolisk (E') og peak systoliske (S') hastigheder ved hjælp af pulserende-TDI og apical 4-kammer apical view(Figur 5).
- Registrer mindst tre på hinanden følgende hjerteslag i hver parametervurdering. Disse værdier vil efterfølgende blive gennemsnit.
8. Hæmodynamisk vurdering
- I slutningen af protokollen (Figur 4) udføres den endelige ekkokardiografi, som beskrevet i 7, før den terminale hæmodynamiske vurdering.
- Gentag trin 2.1 til 3.6.
- Kanyller den rigtige halspulsåre og perfuse steril saltvand ved 64 mL/kg/h.
- Roter lidt dyret til venstre side og lav et hudindsnit på niveau med xiphoidtillægget.
- Adskil huden fra musklen med pincet eller med en saks.
- Lav et lateralt snit mellem venstre ribben på xiphoid appendiks niveau.
- Udfør en venstre lateral thoracotomy at udsætte hjertet fuldt ud.
BEMÆRK: For at undgå blødning og lungeskader skal du sætte en vatpind i brysthulen og skubbe lungerne forsigtigt, mens du indsætter to hæmostater på højre og venstre side af det sted, hvor det skal skæres. - P-V-sløjfekateteret opvarmes på forhånd i et vandbad ved 37 °C.
- Kalibrer kateteret (opsætning, kanalindstilling, valgte den rigtige kanal for tryk og volumen, enheder).
- Sæt et kateter apisk ind i LV og sikre volumen sensorer er placeret mellem aortaklappen og toppen. Mængderne kan vurderes ved hjælp af ekkokardiografi (figur 5). Visualisering af trykvolumensløjferne er med til at bekræfte kateterets korrekte placering (Figur 6).
- Lad dyret stabilisere 20-30 minutter uden væsentlige ændringer i formen af trykvolumensløjferne.
- Med ventilation suspenderet ved udgangen af udløb, erhverve baseline optagelser (Figur 6). Løbende erhverve data på 1.000 Hz, der efterfølgende analyseres off-line af passende software.
- Beregning parallel ledningsføring efter den hypertoniske saltvandsbolus (10%, 10 μL).
- Mens bedøvet, ofre dyret ved exsanguination, indsamle og centrifuge blodet.
- Endelig punktafgifter og indsamle hjertet. Vægt hjertet, venstre og højre hjertekammer separat og opbevar straks prøverne i flydende nitrogen eller formalin til henholdsvis efterfølgende molekylære eller histologiske undersøgelser.
9. Procedure for bånd/debanding af aorta hos rotter
- Udfør aorta banding i unge Wistar (70-90 g) ved hjælp af en 22 G nål og 6-0 polypropylen ligatur at snøre aorta.
- Sørg for en korrekt bedøvelse og smertestillende procedurer med henholdsvis 3-4% af sevofluran og 0,05 mg/kg buprenorphin.
- Under ekkokardiografi skal du sikre en puls, der altid er over 300 hastighed / min (ideelt mellem 300 og 350).
- Før trin 8.9 dissekeres rotteorta forsigtigt, og der placeres en flowsonde omkring den for at måle hjerteproduktionen. Brugen af aorta flow sonde er guldstandardproceduren for rotter.
- Til den hæmodynamiske vurdering kan dunulere halspulsåren eller lårbenet for væskeindgift (32 mL/kg/h).
- Trykvolumenkateteret SPR-1035 erstattes af SPR-847 eller SPR-838, hvis størrelser passer bedre til rotteudluftningsdimensionerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Postoperativ og sen overlevelse
Den perioperative overlevelse af banding procedure er 80%, og dødeligheden i løbet af den første måned er typisk <20%. Som tidligere nævnt er succesen med debandingsoperationen meget afhængig af, hvor invasiv den tidligere operation var. Efter en indlæringskurve er dødeligheden under debandingsprocedurerne omkring 25%. For denne dødelighed tegner sig for det meste dødsfald under operationen procedure, herunder aorta eller venstre atrium brud (hos rotter, overlevelsesraten er højere i begge kirurgiske procedurer).
Aorta banding og myokardie remodeling
Succesen med aortasnære indsnævring blev verificeret ved øget LV end-systolisk tryk (LVESP) og af Doppler aorta flow hastigheder > 2,5 m / s, hvilket svarer til et tryk gradient på 25 mmHg ved hjælp af den modificerede Bernoulli ligning (Figur 5). Sammenlignet med SHAM-mus, banding induceret LV hypertrofi som vurderet ved øget LV-masse (Tabel 1 og figur 5) og nedsat diastolisk funktion tydeligt ved højere påfyldningstryk (forholdet mellem mitral peak hastighed af tidlig påfyldning (E) til tidlig diastolisk mitral ringformet hastighed (E'), (E /e') og venstre ventrikulært end-diastolisk tryk (LVEDP) og langvarig afslapning (t, Tabel 1, figur 5og figur 6) inden for 7 uger. Udslyngning fraktion var stadig bevaret på dette stadium af sygdommen.
Histologisk, syv ugers aorta banding induceret betydelig kardiomyocyt hypertrofi og fibrose (Figur 7).
Aorta debanding og myokardie omvendt ombygning
Hos mus, der blev udsat for debanding, blev en vellykket fjernelse af aorta stenose verificeret ved ekko dopplerhastigheder(tabel 1 og figur 5). Samlet set debanding fremmet et betydeligt fald i efterlast (nedsat LVESP) og LV hypertrofi (vurderet ved morfometrisk, ekkokardiografi, og histologi). Desuden observerede vi normalisering af diastolisk funktion og aortahastigheder(tabel 1, figur 5, figur 6og figur 7).
Tabel 1: Venstre ventrikelmorofunktionelle ændringer vurderet ved ekkokardiografi og hæmodynamik.
| Kritiske trin | råd |
| Invasivitet af banding kirurgi |
Det er vigtigt at undgå: ● langvarig okklusion af den opstigende aorta under ligationen, hvilket kan føre til lungeødem og aktivering af inflammatoriske veje, der kan påvirke fænotypen og sygdoms sværhedsgraden15 ● blødning af brystpulsåren, som, hvis den ikke omgås rettidigt, kan føre til nedsat blodtryk og fremme større mængder fibrose, når brystkassen åbnes igen (debanding) ● skadelige mus pleura og lunger; Mini venstre lateral thoracotomy til banding og debanding (samme sted; nuværende undersøgelse) vs venstre lateral thoracotomy for banding og en sternotomy for debanding kirurgi11: ● den første er mindre invasiv og har en kort restitutionstid, hvilket forbedrer succesen for den åbne bryst hæmodynamiske udført to uger senere. Ikke desto mindre kan brugen af samme position til at genåbne brystet øge antallet af komplikationer på grund af vedhæftninger (omkring venstre atrium, lungearterie osv.). Overvind dette problem ved at have ekstracarefull under banding procedure. |
| Internalisering af sutur |
Kan forhindres ved hjælp af: ● to båndstår side om side16; ● silke i stedet for polypropylen11; ● titaniumklemmer eller en O-ringe omkring aorta for at fremkalde dens indsnævring21; ● dobbelt løkke-klip thecnique15; ● oppustelig manchet til at udføre supracoronary aorta banding22. |
| Fysiologiske parametre |
Under operationen er det vigtigt at overvåge: ● puls; ● iltning i blodet, holde det over 90% (specielt under aorta manupilation); ● anæstesi, holde det på den lavest mulige dosis uden at påføre ubehag på dyret. |
Tabel 2: Protokollens kritiske trin.
Figur 1:Ultrafine kirurgiske instrumenter, der anvendes til banding og debanding. (A)2 nåleholdere og skalpelblade 2 katetre til mus intubation og en saks; en skalpel, 2 buede pincet, en ligation støtte, en mikrokirurgisk saks, 3 lige pincet; (B) og 26G-nål og afstumpet 26G-nål buet, så den passer til musenes lille bryståbning korrekt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Aorta-bandingsprocedure. (B) Den opstigende aorta er tydeligt dissekeret og synlig. Den afstumpede nål og polypropylen sutur 6-0 er placeret i den rigtige position til at udføre aorta banding. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Aorta-debandingsprocedure. Musen er intuberet til mekanisk ventilation. En rektal sonde styrer temperaturen og et oximeter er placeret på højre mus pote til at overvåge iltning i blodet under operationen. Fibrose og vedhængende væv fjernes forsigtigt omkring aorta og sutur for at kunne skære suturen (B) og (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksperimentel protokoldesign for mus. Myokardie remodeling (rød) og omvendt remodeling (grøn) vises i bunden sammen med alle evalueringsopgaver. Bemærk, debanding kirurgi kan give anledning til to grupper af dyr med forskellige grader af omvendt remodeling. Således opnåede vi DEB mus med komplet (DEB-COMP) og ufuldstændig (DEB-INCOM) myokardie opsving. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:Ekkokardiografisk vurdering af hjertestruktur og -funktion. b) LV-masse; (C) Ventrikulære dimensioner (LV-diameter, LVD) og vægtykkelse (LV-bagvæg, LVPW og LV-forreste væg, LVAW) (D) Transmissionsstrøm (toppen af puls Doppler bølge af sen mitral flow hastighed, A, og toppen af pulserende Doppler bølge af tidlige mitral flow hastighed, E) og (E)Myokardie hastigheder (sent diastolisk mitral ringformede væv hastighed, A'; tidlig diastolisk mitral ringformede væv hastighed, E ' og systolisk mitral ringformede væv hastighed, S'). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative trykvolumensløjfer for SHAM-, BA- og DEB-grupper. Data blev løbende erhvervet på 1000 Hz og efterfølgende analyseret off-line af PVAN software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Myokardiehypertrofi og fibrose vurderet histologisk. (A) Venstre ventrikelhypertrofi vurderet ved kardiomyocytter sektionsområde af hematoxylin-eosin (HE)-farvede sektioner (5 μm) fra SHAM (n = 17), BA (n = 14) og DEB-gruppen (n = 12). (B) Venstre ventrikulær interstitiel fibrose og repræsentative billeder af røde Sirius-farvede sektioner (5 μm) fra SHAM (n = 17), BA (n = 13) og DEB (n = 12). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den model, der foreslås heri, efterligner processen med LV-ombygning og RR efter henholdsvis aorta banding og debanding. Derfor repræsenterer det en fremragende eksperimentel model til at fremme vores viden om de molekylære mekanismer, der er involveret i den negative LV remodeling og til at teste nye terapeutiske strategier i stand til at fremkalde myokardie opsving af disse patienter. Denne protokol beskriver trin om, hvordan man opretter en gnaver dyr model af aorta banding og debanding med en minimalt invasiv og meget konservativ kirurgisk teknik til at reducere det kirurgiske traume.
Det mest kritiske trin i protokollen er relateret til graden af kirurgisk aggression under aorta banding. Succesen med den efterfølgende aorta debanding kirurgi afhænger enormt af en minimalt invasiv banding procedure, der undgår væv aggression og fibrose omkring aorta og derfor en mindre invasiv tilgang er obligatorisk (Tabel 2). Suturinterialisering er forbundet med mindre LV hypertrofi og bedre hjertefunktion16 (tabel 2)og gør debandingsproceduren umulig at udføre uden at forårsage et aortabrud. I denne undersøgelse forsøgte vi at bruge silke, da det skaber mere arvæv på bandingstedet, hvilket udløste en mere stabil grad af trykoverbelastning. Men i vores hænder var debandingsoperationen mere krævende, da silke blev brugt, da det er en multifilamenttråd, hvilket gør det fuldstændig fjernelse fra aorta vanskeligere. Ikke desto mindre er der tale om tekniske spørgsmål, der er meget protokol- og operatørafhængige, og disse variationer, suturtype, er ikke uforenelige med god teknisk praksis og reproduktive resultater. Fysiologiske parametre, der overvåges under bånd og især under debanding, er obligatorisk for, at modelimplementeringen (tabel 2) kan lykkes .
I 1991 beskrev Rockman et al., den tværgående aorta indsnævring (TAC) i mus for første gang4. Siden da er der kommet en betydelig mængde papirer ud, som gav talrige versioner af denne procedure variationer med hensyn til dyrets alder/størrelse17, muss genetiske baggrund18, nålens diameter/indsnævring19, det materiale, der blev anvendt til banding, bandingens aortaplacering, varigheden af banding19 og debanding11. Alle disse metodologiske alternativer er gyldige, så længe de opfylder målene for hver undersøgelse. Vi bør dog understrege, at sygdommens progression mod hjertesvigt er hurtigere, og dermed er RR mere ufuldstændig, når man vælger: 1) længere båndvarigheder, 2) tungere / ældre musene20 og 3) mindre nålediameter, der bruges til aortasnævring (højere procentdel af aortasnævring)16.
Varigheden af banding og debanding påvirker sygdommens stadium betydeligt og dermed genopretningen under RR. På samme måde er det obligatorisk at vælge den rigtige timing for debanding for at tilpasse sig sværhedsgraden af den påtænkte sygdom. Resultaterne observeret i vores undersøgelse er i overensstemmelse med præ-eksistens dyr11,21 og humane undersøgelser22, bortset fra kardiomyocytter hypertrofi, hvor nogle undersøgelser viste normalisering10,21 og andre sin delvise regression23. Desuden har undersøgelser vist, at fibrose regression kan forekomme på lang sigt (70 måneder for humane patienter)24. Resultaterne synes at være afhængige af den teknik, der anvendes til at løse fibrose25. For nylig, Treibel et al. var i stand til at skelne mellem cellulære (myocytter, fibroblast, endotel, røde blodlegemer) og ekstracellulære (ECM, blodplasma) rum hos patienter med aorta stenose efter aortaklappen erstatning (AVR) ved hjælp af hjerte-kar-magnetisk resonans med T1 kortlægning22. De beskrev, at regression af LV masse efter AVR kan være drevet af 1) matrix regression alene, hvor den ekstracellulære volumen reducerer; 2) cellulær regression alene, hvor ekstracellulær volumen stiger; 3) eller ved en proportional regression i cellulære rum og matrixrum, hvor det ekstracellulære volumen er uændret22. Disse forfattere konkluderede, at efter AVR, mens diffus fibrose og myokardie cellulære hypertrofi regress, focal fibrose ikke løse. Diffus interstitiel fibrose, vurderet ved matrixvolumen, er således et potentielt terapeutisk mål. I vores undersøgelse, reduktion af fibrose synes at forekomme inden for 2 uger efter RR og før kardiomyocytter hypertrofi normalisering. At ofre dyrene 2 uger efter debandingen var også den perfekte timing for at opnå ventrikulær mangfoldighed blandt DEB-gruppen, nemlig dyr med diastolisk dysfunktion persistens (DEB-INCOM) og andre med fuldstændig LV-massetilbageførsel og diastolisk funktionsforbedring (DEB-COM). Desuden, så snart 2 uger efter debanding, har vi tidligere vist betydelige højre ventrikulære ændringer i banding gruppe, der delvist inddrive efter debanding26, mens Bjornstad et al. rapporterede normalisering af fostergener udtryk, der tyder på myokardie remodeling inden for samme tidsramme11.
Den kirurgiske procedure for banding / debanding kan også udføres hos rotter26, men nogle forskelle bør fremhæves. På grund af sin større størrelse har rotter flere muskellag end mus, hvilket reducerer aortavisualisering og hindrer placeringen af ligaturen omkring aortaen. På den anden side minimeres risikoen for at beskadige tilstødende væv og organer, såsom atrier eller lunger. For at overvinde spørgsmålet om sutur internalisering vi brugte en større polypropylen ligatur hos rotter til at holde stramt aorta (6,0 i stedet for 7,0 polypropylen).
På grund af aortamanipulation kan debandingskirurgi reducere hjerteproduktionen ved at pålægge yderligere efterbelastning på LV og dermed forringe kredsløbs- og åndedrætssystemet. Sammenlignet med mus synes rotter at være mere modstandsdygtige over for mere forlænget bedøvelsesperiode og er derfor lettere at holde de fysiologiske åndedrætsparametre kontrolleret under den lange debandingsoperation. Hos rotter er LV hypertrofiudvikling hurtigere end mus, men det tager længere tid at udvikle sig til hjertesvigt. Således kan debanding kirurgi ske mellem 5-9 uger efter banding procedure uden at gå på kompromis udslyngning fraktion26.
Den største begrænsning af banding / debanding dyremodel er de krævende mikrokirurgiske færdigheder og teknik af operatøren, som regel kræver en lang indlæringskurve for at udføre debanding kirurgi. En anden begrænsning er umuligheden af at udføre tæt bryst hæmodynamik hos mus og rotte, hvilket vil være mere fysiologisk. Ved hjælp af denne metode er det imidlertid obligatorisk at indsætte kateteret fra højre halspulsåre til LV, hvilket i dette særlige tilfælde ikke er muligt, da det i banding af dyr, der stiger op ad aorta, er indsnævret før halspulsårerne. Desuden var vi i mus ikke i stand til at måle belastningsuafhængig kontraktilitet (ESPVR) og diastoliske parametre (hældning af EDPVR) ved at udføre vena cava okklusionsmanøvre, en vigtig parameter for en passende karakterisering af myokardiefunktion. Vi fandt denne manøvre vanskelig at udføre hos mus med stigende aorta indsnævring på grund af deres lille størrelse (20-25g).
Fremtidig anvendelse af banding / debanding dyremodel omfatter udvikling af nye terapeutiske tilgange til myokardie sygdomme og karakterisering af de veje, der ligger til grund for processen med LV remodeling og RR.
Afslutningsvis gør denne klinisk relevante model det muligt at temporally og mekanistisk karakterisere progressionen mod HF, såvel som dens genopretning, da den tillader indsamling af myokardieprøver i forskellige stadier af myokardieombygning og RR. Desuden viser det sig at være en nyttig eksperimentel model til test af terapeutiske strategier rettet mod genopretning af det svigtende hjerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker det portugisiske institut for videnskab og teknologi (FCT), Den Europæiske Union, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) og Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) til finansiering af UnIC (UID/IC/00051/2013) forskningsenhed. Dette projekt støttes af FEDER gennem COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), støttet af Norte Portugals regionale operationelle program (NORTE 2020), i henhold til Portugals partnerskabsaftale fra 2020 gennem Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU), projektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), støttet af De Europæiske Struktur- og Investeringsfonde, Lissabons regionale operationelle program for 2020. Daniela Miranda-Silva og Patrícia Rodrigues finansieres af Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) ved stipendium (henholdsvis SFRH/BD/87556/2012 og SFRH/BD/96026/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
- Arany, Z., et al. Transverse aortic constriction leads to accelerated heart failure in mice lacking PPAR-gamma coactivator 1alpha. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (26), 10086-10091 (2006).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy. Journal of Visualized Experiment. (127), e56231 (2017).
- Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K., Chow, B. K. Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice. Journal of Visualized Experiment. (121), e55293 (2017).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Science. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Koide, M., et al. Premorbid determinants of left ventricular dysfunction in a novel model of gradually induced pressure overload in the adult canine. Circulation. 95 (6), 1601-1610 (1997).
- Rodrigues, P. G., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Myocardial reverse remodeling: how far can we rewind. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1402-1422 (2016).
- Weidemann, F., et al. Impact of myocardial fibrosis in patients with symptomatic severe aortic stenosis. Circulation. 120 (7), 577-584 (2009).
- Bing, R., et al. Imaging and Impact of Myocardial Fibrosis in Aortic Stenosis. JACC Cardiovascular Imaging. 12 (2), 283-296 (2019).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Weinheimer, C. J., et al. Load-Dependent Changes in Left Ventricular Structure and Function in a Pathophysiologically Relevant Murine Model of Reversible Heart Failure. Circulation Heart Failure. 11 (5), 004351 (2018).
- Bjornstad, J. L., et al. A mouse model of reverse cardiac remodelling following banding-debanding of the ascending aorta. Acta Physiologica (Oxford). 205 (1), 92-102 (2012).
- Yarbrough, W. M., Mukherjee, R., Ikonomidis, J. S., Zile, M. R., Spinale, F. G. Myocardial remodeling with aortic stenosis and after aortic valve replacement: mechanisms and future prognostic implications. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (3), 656-664 (2012).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation: Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Li, L., et al. Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging. Journal of Visualized Experiment. (112), e54101 (2016).
- Lygate, C. A., et al. Serial high resolution 3D-MRI after aortic banding in mice: band internalization is a source of variability in the hypertrophic response. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 8-16 (2006).
- Platt, M. J., Huber, J. S., Romanova, N., Brunt, K. R., Simpson, J. A. Pathophysiological Mapping of Experimental Heart Failure: Left and Right Ventricular Remodeling in Transverse Aortic Constriction Is Temporally, Kinetically and Structurally Distinct. Frontiers in Physiology. 9, 472 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Li, Y. H., et al. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. The Journal of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 58 (10), 895-899 (2003).
- Ruppert, M., et al. Myocardial reverse remodeling after pressure unloading is associated with maintained cardiac mechanoenergetics in a rat model of left ventricular hypertrophy. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 311 (3), 592-603 (2016).
- Treibel, T. A., et al. Reverse Myocardial Remodeling Following Valve Replacement in Patients With Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 860-871 (2018).
- Dadson, K., et al. Cellular, structural and functional cardiac remodelling following pressure overload and unloading. International Journal of Cardiology. 216, 32-42 (2016).
- Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79 (4), 744-755 (1989).
- McCann, G. P., Singh, A. Revisiting Reverse Remodeling After Aortic Valve Replacement for Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 872-874 (2018).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Science Reports. 9 (1), 2956 (2019).
