Summary
Ici nous décrivons un protocole étape par étape d’aorte chirurgicale débandant dans le modèle bien établi de souris de l’aortique-constriction. Ce procédé permet non seulement d’étudier les mécanismes à la base de la retouche et de la régression inverses ventriculaires gauches de l’hypertrophie mais également d’essayer les options thérapeutiques originales qui pourraient accélérer le rétablissement myocardique.
Abstract
Pour mieux comprendre le remodelage inverse ventriculaire gauche (BT) (RR), nous décrivons un modèle de rongeur dans lequel, après le remodelage causé par bande aortique de BT, les souris subissent le RR sur le déplacement de la constriction aortique. En ce document, nous décrivons un procédé étape par étape pour exécuter un debanding aortique chirurgical d’une façon minimum invahissant chez les souris. L’échocardiographie a été plus tard employée pour évaluer le degré d’hypertrophie et de dysfonctionnement cardiaques pendant la retouche de LV et le rr et pour déterminer le meilleur moment pour le debanding aortique. À la fin du protocole, l’évaluation hémodynamique terminale de la fonction cardiaque a été conduite, et des échantillons ont été rassemblés pour des études histologiques. Nous avons prouvé que le debanding est associé aux taux de survie chirurgicaux de 70-80%. De plus, deux semaines après le débandage, la réduction significative de l’afterload ventriculaire déclenche la régression de l’hypertrophie ventriculaire (~20%) et la fibrose (~ 26%), la récupération du dysfonctionnement diastolique tel qu’évalué par la normalisation du remplissage ventriculaire gauche et des pressions fin-diastoliques (E / e ' et LVEDP). La débandage aortique est un modèle expérimental utile pour étudier le LV RR chez les rongeurs. L’ampleur du rétablissement myocardique est variable entre les sujets, donc, imitant la diversité du RR qui se produit dans le contexte clinique, tel que le remplacement de valve aortique. Nous concluons que le modèle aortique de bande/debanding représente un outil valable pour démêler les perspicacités originales dans les mécanismes du rr, à savoir la régression de l’hypertrophie cardiaque et le rétablissement du dysfonctionnement diastolique.
Introduction
La constriction de l’aorte transversale ou ascendante chez la souris est un modèle expérimental largement utilisé pour l’hypertrophie cardiaque induite par la surcharge de pression, le dysfonctionnement diastolique et systolique et l’insuffisance cardiaque1,2,3,4. L’aortique-constriction conduit initialement à une hypertrophie concentrique compensée du ventricule gauche (LY) pour normaliser le stress mural1. Cependant, dans certaines circonstances, telles qu’une surcharge cardiaque prolongée, cette hypertrophie est insuffisante pour diminuer le stress de la paroi, déclenchant un dysfonctionnement diastolique et systolique (hypertrophie pathologique)5. En parallèle, les changements de la matrice extracellulaire (ECM) conduisent au dépôt de collagène et à la réticulation dans un processus connu sous le nom de fibrose, qui peut être subdivisé en fibrose de remplacement et fibrose réactive. La fibrose est, dans la plupart des cas, irréversible et compromet la récupération myocardique après soulagement de surcharge6,7. Néanmoins, des études récentes d’imagerie par résonance magnétique cardiaque ont révélé que la fibrose réactive est capable de régresser à long terme8. Au total, la fibrose, l’hypertrophie et le dysfonctionnement cardiaque font partie d’un processus connu sous le nom de remodelage myocardique qui progresse rapidement vers l’insuffisance cardiaque (HF).
Comprendre les caractéristiques du remodelage myocardique est devenu un objectif majeur pour limiter ou inverser sa progression, ce dernier connu sous le nom de remodelage inverse (RR). Le terme RR comprend toute altération myocardique chroniquement inversée par une intervention donnée, une telle thérapie pharmacologique (p. ex. médicament antihypertenseur), une chirurgie valvulaire (p. ex. sténose aortique) ou des dispositifs d’assistance ventriculaire (p. ex. HF chronique). Cependant, le RR est souvent dû inachevé à l’hypertrophie dominante ou au dysfonctionnement systolique/diastolique. Ainsi, la clarification des mécanismes fondamentaux de RR et des stratégies thérapeutiques originales manquent toujours, qui est principalement due à l’impossibilité d’accéder et d’étudier le tissu myocardique humain pendant le RR dans la plupart de ces patients.
Pour surmonter cette limitation, les modèles de rongeurs ont joué un rôle important dans l’avancement de notre compréhension des voies de signalisation impliquées dans la progression de HF. Plus précisément, le débandage aortique de souris avec une constriction aortique représente un modèle utile pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents au remodelage indésirable du RV9 et RR10,11 car il permet la collecte d’échantillons myocardiques à différents moments dans ces deux phases. De plus, il fournit un excellent cadre expérimental pour tester de nouvelles cibles potentielles qui peuvent promouvoir / accélérer le RR. Par exemple, dans le contexte de la sténose aortique, ce modèle pourrait fournir des informations sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la grande diversité de la réponse myocardique sous-jacente à l'(in)complétion du RR6,12,ainsi que sur le moment optimal pour le remplacement des valves, ce qui représente une lacune majeure des connaissances actuelles. En effet, le timing optimal de cette intervention fait l’objet de débats, principalement parce qu’il est défini en fonction de l’ampleur des gradients aortiques. Plusieurs études préconisent que ce point de temps pourrait être trop tard pour la récupération myocardique car la fibrose et le dysfonctionnement diastolique sont souvent déjà présents12.
À notre connaissance, c’est le seul modèle animal qui récapitule le processus du remodelage myocardique et du RR ayant lieu dans des conditions telles que la sténose aortique ou l’hypertension avant et après le remplacement de valve ou le début du médicament antihypertenseur, respectivement.
Cherchant à relever les défis résumés ci-dessus, nous décrivons un modèle animal chirurgical qui peut être mis en œuvre à la fois chez les souris et les rats, en abordant les différences entre ces deux espèces. Nous décrivons les principales étapes et les détails impliqués lors de la réalisation de ces chirurgies. Enfin, nous rapportons les changements les plus importants qui ont lieu dans la RV immédiatement avant et tout au long du RR.
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Protocol
Toutes les expérimentations animales sont conformes au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication des NIH n° 85–23, révisée en 2011) et à la loi portugaise sur le bien-être des animaux (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Les autorités locales compétentes ont approuvé ce protocole expérimental (018833). Des souris mâles C57B1/J6 âgées de sept semaines ont été maintenues dans des cages appropriées, avec un environnement régulier de cycle clair-foncé de 12/12 h, une température de 22 °C et une humidité de 60 % avec accès à l’eau et un régime alimentaire standard ad libitum.
1. Préparation du champ chirurgical
- Désinfectez le site opératoire avec 70 % d’alcool et placez un couvercle de table de salle d’opération jetable sur la zone chirurgicale.
- Stérilisez tous les instruments avant la chirurgie.
REMARQUE: Cette procédure nécessite des ciseaux microchirurgicaux, 2 pinces courbes fines, 3 pinces droites fines, un scalpel, une petite pince, un ciseau dissecteur incliné, un porte-aiguille, une aide à la ligature ultrafine, 2 hémostats et, enfin, un système de rétraction de fixateur magnétique est fortement recommandé(Figure 1A). - Courber la pointe d’une aiguille émoussée de 26 G à 90° pour une approche plus facile de l’aorte. Une aiguille de 26 G créera un rétrécissement aortique de 0,45 mm de diamètre(figure 1B).
- Régler la température du coussin chauffant à 37 ± 0,1 °C.
2. Préparation et intubation des souris
- Anesthésier les jeunes souris C57B1/J6 (20-25 g) par inhalation de 8% de sévoflurane avec 0,5 - 1,0 L/min 100%O2 dans un tube conique.
- Vérifiez la profondeur de l’anesthésie à l’aide du réflexe de retrait du pincement des pincements.
- Placez la souris à la réamence dorsale sur une plaque inclinée et procédez à l’intubation orotracheal.
- Déplacez la souris sur le coussin chauffant et connectez rapidement le tube orotracheal au ventilateur pour lancer la ventilation mécanique.
- Régler les paramètres du ventilateur à une fréquence de 160 respirations/min et à un volume de marée de 10 mL/kg.
3. Préparation à la chirurgie (pour les chirurgies de baguage et de débandage)
- Rasez et appliquez la crème dépilatoire de l’encolure au niveau de la poitrine moyenne des souris.
- Appliquez du gel ophtalmique sur les yeux des animaux pour éviter le dessèchement de la cornée.
- Placez une sonde rectale et l’oxymètre à la patte ou à la queue pour surveiller la température et l’oxygénation du sang, ainsi que la fréquence cardiaque, respectivement.
REMARQUE: L’anesthésie induit une hypothermie importante, par conséquent, il est important de maintenir une température corporelle normale pendant la chirurgie pour éviter une diminution rapide de la fréquence cardiaque. - Maintenir l’anesthésie avec le sévoflurane (2,0 - 3,0%). Vérifiez le niveau correct d’anesthésie par l’absence du réflexe pincement des interteils.
- Placez les souris dans un décubitus latéral droit sur un coussin chauffant et fixez les membres au système de rétraction du fixateur magnétique à l’aide d’un ruban adhésif pour maintenir l’animal dans la bonne position pendant la chirurgie(figure 2, figure 3A).
- Désinfectez la poitrine de la souris avec de l’alcool à 70% suivi d’une solution de providone-iode.
4. Chirurgie de baguage aortique ascendante
NOTA : Pour une description détaillée du protocole, consultez les sections 2,3,4,13.
- Avec une lame jetable, effectuez une petite incision cutanée (~0,5 cm) sur le côté gauche immédiatement en dessous du niveau de l’aisselle et disséquez la peau.
- Disséquer et séparer doucement le muscle pectoral et les autres couches musculaires jusqu’à ce que les côtes deviennent visibles. Utilisez une pince fine et évitez de couper le muscle.
- Au microscope, identifier les espaces intercostaux et ouvrir une petite incision entre le 2ème et le3ème espace intercostal avec une pince fine.
- Rétracter les côtes en plaçant le rétracteur thoracique(figure 2A).
- Utilisez une petite pince pour disséquer et séparer doucement les lobes thymiques jusqu’à ce que l’aorte ascendante devienne visible.
REMARQUE: Les applicateurs de coton devraient être pratiques en cas de saignement. Une solution saline stérile chaude doit être administrée par voie sous-cutanée en cas de saignement important (p. ex. l’artère mammaire). - Utilisez une petite pince pour disséquer doucement l’aorte.
REMARQUE: L’aorte est considérée comme disséquée lorsqu’il n’y a pas de graisse ou d’autres adhérences autour d’elle et il est possible d’encercler facilement le récipient avec une petite pince courbe. - Après une dissection aortique, placez une ligature de polypropylène 7-0 autour de l’aorte à l’aide à la ligature et d’une pince incurvée(figure 2B).
- Placer l’aiguille émoussée de 26 G parallèlement à l’aorte (pointe pointée vers la tête de la souris)(figure 2B). Pour les souris pesant 20-25 g, cette aiguille induit une constriction aortique reproductible de 65-70%.
- Faire 2 nœuds lâches autour de l’aorte et de l’aiguille de 26 G à l’aide de 2 pinces(Figure 2B).
- Serrez le 1er nœud et, rapidement après, le 2e nœud. Confirmez brièvement le bon positionnement de la constriction et retirez rapidement l’aiguille pour rétablir le flux sanguin aortique. Enfin, faire un3ème nœud (groupe BA).
- Repositionnez le thymus et les muscles dans leur position initiale.
- Effectuez la procédure de trompe-l’œil identique à la procédure de constriction, mais en gardant la suture lâche autour de l’aorte (groupe SHAM).
- Coupez les extrémités de la suture et retirez le rétracteur thoracique.
REMARQUE: Les extrémités courtes de suture peuvent augmenter la probabilité que les nœuds se desserrent avec la pression aortique, tandis que les extrémités longues rendent la procédure de débandage plus risquée puisque des adhérences peuvent se produire entre la suture et l’oreillette gauche. - Fermez la paroi thoracique à l’aide d’une suture de polypropylène 6-0 avec une suture simple interrompue ou continue en utilisant le plus petit nombre possible de points de suture. Serrez le dernier nœud de poitrine avec les poumons gonflés à l’inspiration d’extrémité en pincé l’écoulement du ventilateur pendant 2s pour re-gonfler les poumons.
- Fermez la peau avec une suture de soie/polypropylène 6-0 dans un motif de suture continu.
NOTES: Si un ventilateur plus récent est utilisé, il est possible de le programmer pour faire une pause dans l’inspiration (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Soins postopératoires
- Appliquer une solution de providone-iode sur le site de suture de la peau.
- Pour une analgésie appropriée, administrer de la buprénorphine par voie sous-cutanée à 0,1 mg/kg, deux fois par jour, jusqu’à ce que l’animal se rétablisse complètement (généralement 2 à 3 jours après la chirurgie).
- Injecter une solution saline stérile par voie intrapéritonéale pour prévenir la déshydratation en cas de saignement important pendant la chirurgie.
- Éteignez l’anesthésie (sans désintubating la souris) et attendez que l’animal retrouve les réflexes (les mouvements des moustaches sont un signal d’éveil) et commence à respirer spontanément.
- Retirez la canule trachéale.
- Laissez l’animal récupérer dans un incubateur à 37 °C.
- Ramener l’animal dans une salle de cycle claire/sombre de 12 h après une récupération complète.
6. Chirurgie de débandage aortique
- Sept semaines plus tard, effectuer le debanding de l’aorte dans la moitié des animaux de BA et enlever la suture lâche de la moitié des souris sham, donnant lieu à 2 nouveaux groupes -- debanding (DEB) et debanding SHAMA (DESHAM), respectivement. DESHAM représente le contrôle du groupe DEB (Figure 4).
- Répétez toutes les étapes 2.1 à 3.6 mentionnées ci-dessus.
- Disséquer doucement les tissus, les adhérences et la fibrose autour de l’aorte jusqu’à ce que sa constriction devienne visible.
- Disséquer soigneusement l’aorte et séparer la suture de l’aorte. Couper la suture à l’aide de ciseaux à ressort inclinés à sonde unique(Figure 3B).
- Fermez la paroi thoracique à l’aide d’une suture de polypropylène 6-0 avec une suture simple interrompue ou continue en utilisant le nombre minimum de points de suture possible.
REMARQUE: Essayez de serrer la dernière suture thoracique lorsque les poumons sont gonflés pour éviter le pneumothorax. - Fermez la peau avec une suture de soie/polypropylène 6-0 dans un motif de suture continu.
- Effectuer toutes les procédures de soins postopératoires comme mentionné au 5.
- Sacrifiez les animaux 2 semaines plus tard.
7. Échocardiographie pour évaluer la fonction cardiaque et l’hypertrophie ventriculaire gauche in vivo
- Effectuer l’examen échocardiographique toutes les 2-3 semaines pour suivre la progression de l’hypertrophie et de la fonction cardiaque.
- Anesthésier les animaux, comme décrit, par inhalation de 5% de sévoflurane avec un cône de nez. Ajustez le niveau d’anesthésie en le diminuant à 2,5%.
- Rasez et appliquez la crème dépilatoire de l’encolure au niveau de la poitrine moyenne.
- Placez l’animal sur un coussin chauffant et placez les électrodes ECG. Assurer une bonne trace ECG et maintenir la fréquence cardiaque entre 300 et 350 battements/min.
- Surveillez la température (~ 37 °C).
- Appliquez du gel d’écho et positionnez l’animal au niveau du décubitus latéral gauche.
- Démarrez l’échocardiographe et ajustez les paramètres.
- Placez une sonde échographique sur le thorax.
- Évaluer le gradient de pression à travers la bande à 7 et 2 semaines après la chirurgie de bande et debanding, respectivement. Placez la sonde sur l’axe long LV et placez le faisceau sur l’aorte. Appuyez sur le bouton PW pour activer l’échocardiographie Doppler à ondes pulsées. Après sept semaines de baguage, les gradients aortiques seront >25 mmHg chez les animaux bagués.
- Enregistrez des images guidées bidimensionnelles de l’aorte montrant la présence ou l’absence de la constriction ascendante de l’aorte pour visualiser anatomiquement l’efficacité de la bande et du débandage.
REMARQUE: Il est possible de visualiser l’écoulement turbulent au niveau de la constriction si le mode de couleur est disponible. - Évaluer l’hypertrophie en positionnant la sonde à un axe court LV, au niveau des muscles papillaires, et appuyez sur le traçage en mode M pour visualiser la paroi antérieure LV (LVAW), le diamètre LV (LVD) et la paroi postérieure LV (LVPW) dans la diastole (D) et la systole (S)(Figure 5).
- Évaluer la fonction systolique, calculer la fraction d’éjection et le raccourcissement fractionnaire comme décrit précédemment14,15.
- Évaluer la fonction diastolique par 1) déterminer le pic de Doppler à ondes pulsées de la vitesse d’écoulement mitrale précoce et tardive (ondes E et A, respectivement) en utilisant une vue apicale apicale à 4 chambres juste au-dessus des feuillets mitraux; 2) enregistrement des vitesses diastoliques diastoliques précoces (E') et systoliques maximales (S') annulaires latérales latérales à l’aide de TDI pulsé et d’une vue apicale à 4 chambres apicale(Figure 5).
- Enregistrez au moins trois pulsations consécutives à chaque évaluation de paramètre. Ces valeurs feront l’suite l’état d’une moyenne.
8. Évaluation hémodynamique
- A la fin du protocole(figure 4),effectuer l’échocardiographie finale, comme décrit au point 7, avant l’évaluation hémodynamique terminale.
- Répétez les étapes 2.1 à 3.6.
- On peut onduler la veine jugulaire droite et perfuser une solution saline stérile à 64 mL/kg/h.
- Faites pivoter légèrement l’animal sur le côté gauche et faites une incision cutanée au niveau de l’appendice xiphoïde.
- Séparez la peau du muscle avec une pince ou avec un ciseau.
- Faire une incision latérale entre les côtes gauches au niveau de l’appendice xiphoïde.
- Effectuer une thoracotomie latérale gauche pour exposer complètement le cœur.
REMARQUE: Pour éviter les saignements et les lésions pulmonaires, insérez un coton-tige dans la cavité thoracique et poussez doucement le poumon tout en insérant deux hémostatiques sur les côtés droit et gauche de l’endroit à couper. - Préchauffer les cathéters à boucle P-V dans un bain-marie à 37 °C.
- Calibrer le cathéter (configuration, réglage du canal, choix du bon canal pour la pression et le volume, unités).
- Insérez un cathéter par l’apathie dans le V et assurez-vous que les capteurs de volume sont positionnés entre la valve aortique et l’apex. Les volumes peuvent être évalués par échocardiographie (Figure 5). La visualisation des boucles pression-volume permet de confirmer le positionnement correct du cathéter (Figure 6).
- Laissez l’animal se stabiliser 20-30 min sans changements significatifs dans la forme des boucles pression-volume.
- Avec la ventilation suspendue à l’expiration finale, acquérir des enregistrements de base (Figure 6). Acquérir continuellement des données à 1 000 Hz pour être ensuite analysées hors ligne par un logiciel approprié.
- Calculer la conductance parallèle après le bolus salin hypertonique (10 %, 10 μL).
- Pendant l’anesthésie, sacrifiez l’animal par exsanguination, collectez et centrifugez le sang.
- Enfin, exciser et récupérer le cœur. Peser le cœur, le ventricule gauche et le ventricule droit séparément et stocker immédiatement les échantillons dans de l’azote liquide ou du formol pour des études moléculaires ou histologiques ultérieures, respectivement.
9. Procédure de baguage/débandage aortique chez les rats
- Effectuer des bandes aortiques chez le jeune Wistar (70-90 g) à l’aide d’une aiguille de 22 G et d’une ligature de polypropylène 6-0 pour resserrer l’aorte.
- Assurer une procédure anesthésique et analgésique appropriée avec 3-4% de sévoflurane et 0,05 mg/kg de buprénorphine, respectivement.
- Lors de l’échocardiographie, assurer une fréquence cardiaque toujours supérieure à 300 fréquence/min (idéalement entre 300 et 350).
- Avant l’étape 8.9, disséquer doucement l’aorte du rat, placer une sonde d’écoulement autour d’elle pour mesurer le débit cardiaque. L’utilisation de la sonde à flux aortique est la procédure de référence pour les rats.
- Pour l’évaluation hémodynamique, on peut moduler la veine jugulaire ou fémorale pour l’administration liquide (32 mL/kg/h).
- Remplacer le cathéter à volume pression SPR-1035 par le SPR-847 ou le SPR-838, dont les tailles conviennent mieux aux dimensions ventriculaires du rat.
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Representative Results
Survie postopératoire et tardive
La survie perioperative du procédé de bande est de 80% et la mortalité pendant le premier mois est typiquement <20%. Comme mentionné précédemment, le succès de la chirurgie de debanding dépend fortement de la façon dont la chirurgie précédente était invahissante. Après une courbe d’apprentissage, le taux de mortalité pendant les procédures de débandage est d’environ 25%. Pour cela, la mortalité explique principalement les décès au cours de la procédure chirurgicale, y compris l’aorte ou la rupture de l’oreillette gauche (chez les rats, le taux de survie est plus élevé dans les deux procédures chirurgicales).
Baguage aortique et remodelage myocardique
Le succès de la constriction aortique a été vérifié par l’augmentation de la pression systolique finale du VV (LVESP) et par des vitesses d’écoulement aortique Doppler >2,5 m/s, ce qui correspond à un gradient de pression de 25 mmHg à l’aide de l’équation de Bernoulli modifiée(figure 5). Par rapport aux souris SHAM, la bande a induit l’hypertrophie de LV telle qu’évaluée par l’augmentation de la masse de BT(tableau 1 et figure 5) et la fonction diastolique altérée évidente par des pressions de remplissage plus élevées (rapport de la vitesse maximale mitrale du remplissage précoce (E) à la vitesse annulaire mitrale diastolique tôt (E'), (E/e'), et la pression diastolique finale ventriculaire gauche (LVEDP) et la relaxation prolongée (t, tableau 1, Figure 5et Figure 6)dans les 7 semaines. La fraction d’éjection a été encore préservée à cette étape de la maladie.
Histologiquement, sept semaines de baguage aortique ont induit une hypertrophie et une fibrose cardiomyocytes significatives (Figure 7).
Débandage aortique et remodelage inverse myocardique
Chez les souris soumises au débandage, l’élimination réussie de la sténose aortique a été vérifiée par les vitesses doppler de l’écho(tableau 1 et figure 5). De façon générale, le débandage a favorisé une diminution significative d’afterload (diminution de LVESP) et d’hypertrophie de LV (évaluée par morphométrie, échocardiographie, et histologie). De plus, nous avons observé la normalisation de la fonction diastolique et des vitesses aortiques(tableau 1, figure 5, figure 6et figure 7).
Tableau 1 : Changements morphofonctionnels du ventricule gauche évalués par échocardiographie et par hémodynamique.
| Étapes critiques | conseil |
| Caractère invasif de la chirurgie de baguage |
Il est important d’éviter : ● occlusion prolongée de l’aorte ascendante pendant la ligature, ce qui peut entraîner un œdème pulmonaire et l’activation des voies inflammatoires capables d’influencer le phénotype et la gravité de la maladie15 ● saignement de l’artère mammaire qui, s’il n’est pas contourné en temps opportun, peut entraîner une diminution de la pression artérielle et favoriser des quantités plus élevées de fibrose lors de la réouverture du thorax (débandage); ● endommager la plèvre et les poumons des souris; Mini thoracotomie latérale gauche pour bande et débandage (même endroit ; étude actuelle) vs thoracotomie latérale gauche pour le baguage et une sternotomie pour la chirurgie de débandage11: ● le premier est moins invasif et a un temps de récupération court, ce qui améliore le succès de l’hémodynamique de la poitrine ouverte effectuée deux semaines plus tard. Néanmoins, l’utilisation de la même position pour rouvrir la poitrine peut augmenter le nombre de complications dues aux adhérences (autour de l’oreillette gauche, de l’artère pulmonaire, etc.). Surmontez ce problème en ayant extracarefull pendant la procédure de baguage. |
| Internalisation de la suture |
Peut être évité en utilisant: ● deux sutures à bandes côte à côte16; ● soie au lieu de polypropylène11; ● des clips en titane ou un joint torique autour de l’aorte pour induire sa constriction21; ● double boucle-clip thecnique15; ● brassard gonflable pour réaliser des bandes aortiques supracoronaires22. |
| Paramètres physiologiques |
Pendant la chirurgie, il est important de surveiller: ● fréquence cardiaque; ● oxygénation du sang, en le maintenant au-dessus de 90% (spécialement pendant la fabrication de l’aorte); ● anesthésie, en le maintenant à la dose la plus faible possible sans infliger d’inconfort à l’animal. |
Tableau 2 : Étapes critiques du protocole.
Figure 1: Instruments chirurgicaux ultrafins utilisés pour les procédures de baguage et de débandage. (A) 2 porte-aiguilles et une lame de scalpel; 2 cathéters pour l’intubation des souris et un ciseau; un scalpel, 2 pinces incurvées, une aide à la ligature, un ciseau microchirurgical, 3 pinces droites; (B) et 26G-aiguille et émoussé 26G-aiguille courbée pour s’adapter à la souris petite ouverture thoracique correctement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Procédure de baguage aortique ( A) Approche thoracique de l’aorte ascendante réalisée à l’aide d’un système de rétraction de fixateur magnétique (3 rétracteurs sont visibles). (B) L’aorte ascendante est clairement disséquée et visible. L’aiguille émoussée et la suture en polypropylène 6-0 sont placées dans la bonne position pour effectuer la bande aortique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Procédure de débandage aortique ( A) La souris est placée dans un système de rétraction magnétique, représentant un outil pratique pour rétracter les muscles et les tissus. La souris est intubée pour la ventilation mécanique. Une sonde rectale contrôle la température et un oxymètre est placé sur la patte de souris droite pour surveiller l’oxygénation du sang pendant la chirurgie. La fibrose et le tissu adhérent sont soigneusement enlevés autour de l’aorte et de la suture, pour pouvoir couper la suture (B) et (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Conception de protocole expérimental pour les souris. Le remodelage myocardique (rouge) et le remodelage inverse (vert) sont montrés en bas avec toutes les tâches d’évaluation. Il convient de noter que la chirurgie de débandage peut donner lieu à deux groupes d’animaux avec des degrés distincts de remodelage inverse. Ainsi, nous avons obtenu la souris de DEB avec le rétablissement myocardique complet (DEB-COMP) et inachevé (DEB-INCOM). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Évaluation échocardiographique de la structure et de la fonction cardiaques. (A) Vitesses d’écoulement aortique ; (B) masse LV; (C) Dimensions ventriculaires (diamètre LV, LVD) et épaisseur de la paroi (paroi postérieure LV, paroi antérieure LVPW et LV, LVAW); (D) Flux de transmission (pic de l’onde Doppler d’impulsion de vitesse d’écoulement mitrale tardive, A, et pic d’onde Doppler pulsée de vitesse d’écoulement mitral précoce, E) et(E) vitesses myocardiques (vitesse du tissu annulaire mitral diastolique tardif, A'; vitesse du tissu annulaire mitral diastolique précoce, E' et vitesse du tissu annulaire mitral systolique, S'). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Boucles pression-volume représentatives pour les groupes SHAM, BA et DEB. Les données ont été acquises en continu à 1000 Hz et analysées par la suite hors ligne par le logiciel PVAN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Hypertrophie myocardique et fibrose évaluées histologiquement. (A)Hypertrophie du ventricule gauche évaluée par la zone sectionnelle des cardiomyocytes des sections colorées par hématoxyline-éosine (HE) (5 μm) du SHAM (n = 17), du BA (n = 14) et du groupe DEB (n = 12). (B) Fibrose interstitielle ventriculaire gauche et images représentatives de sections colorées par Sirius rouge (5 μm) de SHAM (n = 17), BA (n = 13) et DEB (n = 12). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le modèle proposé ici imite le processus de remodelage LV et rr après bande aortique et debanding, respectivement. Par conséquent, il représente un excellent modèle expérimental pour avancer notre connaissance sur les mécanismes moléculaires impliqués dans le remodelage défavorable de LV et pour tester des stratégies thérapeutiques originales capables d’induire le rétablissement myocardique de ces patients. Ce protocole détaille des étapes sur la façon dont créer un modèle animal de rongeur de bande et de débanding aortiques avec une technique chirurgicale d’une façon minimum invahissante et fortement conservatrice pour réduire le trauma chirurgical.
L’étape la plus critique du protocole est liée au degré d’agression chirurgicale pendant la bande aortique. Le succès de la chirurgie de débandage aortique subséquente dépend énormément d’une procédure de baguage mini-invasive qui évite l’agression tissulaire et la fibrose autour de l’aorte et, par conséquent, une approche moins invasive est obligatoire (Tableau 2). L’internalisation de suture est associée à moins d’hypertrophie de LV et à une meilleure fonction cardiaque16 (tableau 2) et rend la procédure de débandage impossible à exécuter sans causer une rupture aortique. Dans la présente étude, nous avons essayé d’utiliser la soie, car elle crée plus de tissu cicatriciel au site de baguage, déclenchant un degré plus stable de surcharge de pression. Cependant, dans nos mains, la chirurgie de débandage était plus exigeante lorsque la soie a été utilisée car il s’agit d’un fil multifilament rendant son retrait total de l’aorte plus difficile. Néanmoins, il s’agit de questions techniques qui dépendent largement du protocole et de l’opérateur, et ces variations, type de suture, ne sont pas incompatibles avec les bonnes pratiques techniques et les résultats de reproduction. La surveillance des paramètres physiologiques pendant le baguage et en particulier pendant le débandage est obligatoire pour le succès de la mise en œuvre du modèle(tableau 2).
En 1991, Rockman et al., ont décrit la constriction transversale de l’aorte (TAC) chez la souris pour la première fois4. Depuis lors, une quantité considérable d’articles est sortie fournissant de nombreuses versions de cette procédure avec des variations en ce qui concerne l’âge/taille de l’animal17,le fond génétique des souris18,le diamètre de l’aiguille/constriction19,le matériau utilisé pour le baguage, l’emplacement aortique du baguage, la durée du baguage19 et le débandage11. Toutes ces alternatives méthodologiques sont valables tant qu’elles répondent aux objectifs de chaque étude. Cependant, nous devrions souligner que la progression de la maladie vers l’insuffisance cardiaque est plus rapide et donc RR est plus incomplet lors de la sélection: 1) des durées de bande plus longues, 2) plus lourd / plus vieux les souris20 et 3) plus petit diamètre d’aiguille utilisé pour la constriction aortique (pourcentage plus élevé de constriction aortique)16.
La durée du baguage et du débandage ont un impact significatif sur le stade de la maladie et, par conséquent, sur le rétablissement pendant le RR. De même, il est obligatoire de choisir le bon moment pour la débandation afin de s’adapter à la gravité de la maladie envisagée. Les résultats observés dans notre étude sont conformes à la préexistence animale11, 21et aux études humaines22,à l’exception de l’hypertrophie des cardiomyocytes, où certaines études ont montré sa normalisation10,21 et d’autres sa régression partielle23. De plus, des études ont montré que la régression de la fibrose peut se produire à long terme (70 mois pour les patients humains)24. Les résultats semblent dépendre de la technique utilisée pour traiter la fibrose25. Récemment, Treibel et al. ont pu différencier les compartiments cellulaires (myocytes, fibroblastes, endothéliaux, globules rouges) et extracellulaires (ECM, plasma sanguin) chez les patients atteints de sténose aortique après remplacement de la valve aortique (AVR) en utilisant la résonance magnétique cardiovasculaire avec la cartographie T122. Ils ont décrit que la régression de la masse LV après AVR peut être conduite par 1) régression matricielle seule, où le volume extracellulaire réduit ; 2) régression cellulaire seule, où le volume extracellulaire augmente ; 3) soit par une régression proportionnelle dans les compartiments cellulaires et matriciels, où le volume extracellulaire est inchangé22. Ces auteurs ont conclu que, après AVR, tandis que la fibrose diffuse et l’hypertrophie cellulaire myocardique régressent, la fibrose focale ne résout pas. Ainsi, la fibrose interstitielle diffuse, telle qu’évaluée par volume de matrice, est une cible thérapeutique potentielle. Dans notre étude, la réduction de la fibrose semble se produire dans un délai de 2 semaines de RR et avant la normalisation d’hypertrophie de cardiomyocytes. En outre, sacrifier les animaux pendant 2 semaines après le debanding était le moment parfait pour obtenir la diversité ventriculaire parmi le groupe de DEB, à savoir les animaux avec la persistance diastolique de dysfonctionnement (DEB-INCOM) et d’autres avec l’inversion complète de masse de BT et l’amélioration diastolique de fonction (DEB-COM). D’ailleurs, dès que 2 semaines après debanding, nous avons précédemment montré des changements ventriculaires droits significatifs dans le groupe de bande qui récupèrent partiellement après debanding26, tandis que Bjornstad et autres ont rapporté la normalisation de l’expression foetale de gènes, indicatif du remodelage myocardique dans le même délai11.
La procédure chirurgicale de baguage / débandage peut également être effectuée chez les rats26, cependant, certaines différences doivent être mises en évidence. En raison de sa plus grande taille, les rats ont plus de couches musculaires que les souris, ce qui diminue la visualisation aortique et entrave le positionnement de la ligature autour de l’aorte. D’autre part, le risque d’endommager les tissus et les organes adjacents, tels que les oreillettes ou les poumons, est minimisé. Pour surmonter la question de l’internalisation de suture nous avons employé une plus grande ligature de polypropylène chez les rats pour maintenir serré l’aorte (6.0 au lieu de polypropylène 7.0).
En raison de la manipulation d’aorte, la chirurgie de débandage pourrait diminuer le débit cardiaque en imposant l’afterload supplémentaire sur le V et ainsi altérer le système circulatoire et respiratoire. Par rapport aux souris, les rats semblent être plus résistants à une période anesthésique plus prolongée et sont donc plus faciles à contrôler les paramètres respiratoires physiologiques pendant la longue chirurgie de débandage. Chez le rat, le développement de l’hypertrophie du V est plus rapide que chez les souris, mais il faut plus de temps pour progresser vers l’insuffisance cardiaque. Ainsi, la chirurgie de délinement peut être faite entre 5-9 semaines après la procédure de baguage sans compromettre la fraction d’éjection26.
La principale limite du modèle animal de baguage/débandage est les compétences microchirurgicales et la technique exigeantes de l’opérateur, nécessitant habituellement une longue courbe d’apprentissage pour accomplir la chirurgie de débandage. Une autre limitation est l’impossibilité d’effectuer une hémodynamique thoracique rapprochée chez la souris et le rat, ce qui sera plus physiologique. Cependant, en utilisant cette méthode est obligatoire d’insérer le cathéter de l’artère carotide droite à LV qui est, dans ce cas particulier pas faisable puisque dans la bande des animaux l’aorte ascendante est resserré avant les branches carotides. D’ailleurs, chez la souris, nous ne pouvions pas mesurer la contractilité charge-indépendante (ESPVR) et les paramètres diastoliques (pente d’EDPVR) en exécutant la manoeuvre d’occlusion de veine cave, un paramètre important pour à caractériser à caractérisation proportionnée de fonction myocardique. Nous avons trouvé cette manœuvre difficile à effectuer chez les souris avec la constriction ascendante d’aorte due à leur petite taille (20-25g).
L’application future du modèle animal de baguage/débandage comprend le développement de nouvelles approches thérapeutiques aux maladies myocardiques et la caractérisation des voies qui sous-tendent le processus de remodelage du RV et du RR.
En conclusion, ce modèle cliniquement-pertinent permet de caractériser temporellement et mécanistement la progression vers l’HF, aussi bien que, sa récupération puisqu’il permet la collecte des échantillons myocardiques à différentes étapes de remodelage myocardique et de RR. De plus, il s’avère être un modèle expérimental utile pour tester des stratégies thérapeutiques visant à la récupération du cœur défaillant.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT), l’Union européenne, quadro de referência estratégico nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) et Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) pour le financement de l’unité de recherche UnIC (UID/IC/00051/2013). Ce projet est soutenu par FEDER à travers COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), le projet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), soutenu par le programme opérationnel régional Norte Portugal (NORTE 2020), dans le cadre de l’accord de partenariat Portugal 2020, à travers le Fonds européen de développement régional (FEDER), le projet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), soutenu par les Fonds structurels et d’investissement européens, le programme opérationnel régional 2020 de Lisbonne. Daniela Miranda-Silva et Patrícia Rodrigues sont financées par la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) par des bourses (SFRH/BD/87556/2012 et SFRH/BD/96026/2013 respectivement).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
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