Summary
Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll av kirurgiska aorta debanding i den väletablerade mössmodellen av aorta-förträngning. Detta förfarande tillåter inte bara att studera mekanismerna bakom den vänstra Ventrikulärt omvända ombyggnad och regression av hypertrofi men också att testa nya terapeutiska alternativ som kan påskynda skador återhämtning.
Abstract
För att bättre förstå den vänstra ventrikulära (LV) omvända ombyggnad (RR), beskriver vi en gnagare modell vari, efter aorta banding-inducerad LV ombyggnad, möss genomgår RR vid avlägsnande av aorta förträngning. I detta dokument beskriver vi en steg-för-steg förfarande för att utföra en minimalt invasiv kirurgiska aorta debanding hos möss. Ekokardiografi användes därefter för att bedöma graden av hjärt hypertrofi och dysfunktion under LV ombyggnad och RR och för att fastställa den bästa tidpunkten för aorta debanding. I slutet av protokollet genomfördes terminal hemodynamic utvärdering av hjärt funktionen och prover samlades in för histologiska studier. Vi visade att debanding är associerad med kirurgisk överlevnad på 70-80%. Dessutom, två veckor efter debanding, utlöser den betydande minskningen av ventrikulär efterbelastning regressionen av ventrikulär hypertrofi (~ 20%) och fibros (~26%), återhämtning av diastolisk dysfunktion som bedöms genom normalisering av vänster Ventrikulärt fyllning och end-diastolic tryck (E/e' och LVEDP). Aortabanding är en användbar experimentell modell för att studera LV RR hos gnagare. Omfattningen av skador återhämtning är variabel mellan ämnen, därför efterlikna mångfalden av RR som uppstår i det kliniska sammanhanget, såsom aorta ventil ersätter. Vi dra slutsatsen att den aorta banding/debanding modellen representerar ett värdefullt verktyg för att nysta upp nya insikter i mekanismerna i RR, nämligen regression av hjärt hypertrofi och återvinning av diastolic dysfunktion.
Introduction
Förträngning av tvärgående eller stigande stora kroppspulsådern i musen är en allmänt använd experimentell modell för trycköverbelastning-inducerad hjärthypertrofi, diastolisk och systolisk dysfunktion och hjärtsvikt1,2,3,4. Aorta-förträngning leder ursprungligen till kompenserad vänster ventrikel (LV) koncentrisk hypertrofi för att normalisera väggspänning1. Men under vissa omständigheter, såsom långvarig hjärtöverbelastning, är denna hypertrofi otillräcklig för att minska väggstressen, vilket utlöser diastolisk och systolisk dysfunktion (patologisk hypertrofi)5. Parallellt leder förändringar i extracellulär matris (ECM) till kollagendeposition och korslänkning i en process som kallas fibros, som kan delas in i ersättningsfibros och reaktiv fibros. Fibros är i de flesta fall irreversibel och äventyrar myokardåterhämtning efter överbelastningsavlastning6,7. Ändå visade nyligen hjärtmagnetisk resonanstomografistudier att reaktiv fibros kan regressivt på lång sikt8. Sammantaget är fibros, hypertrofi och hjärtdysfunktion en del av en process som kallas myokardombyggnad som snabbt utvecklas mot hjärtsvikt (HF).
Att förstå funktionerna i myokardisk ombyggnad har blivit ett viktigt mål för att begränsa eller vända dess progression, den senare känd som omvänd ombyggnad (RR). Termen RR omfattar alla hjärtinfarktförändringar som kroniskt upphävs av ett visst ingrepp, sådan farmakologisk behandling (t.ex. blodtryckssnål medicinering), ventilkirurgi (t.ex. aortastenos) eller ventrikulära hjälpmedel (t.ex. kronisk HF). RR är dock ofta ofullständig på grund av den rådande hypertrofi eller systoliska/diastoliska dysfunktion. Således saknas klargörandet av RR underliggande mekanismer och nya terapeutiska strategier fortfarande, vilket främst beror på omöjligheten att komma åt och studera mänskliga skador vävnad under RR i de flesta av dessa patienter.
För att övervinna denna begränsning har gnagaremodeller spelat en viktig roll för att främja vår förståelse av signalvägarna som är involverade i HF-progression. Specifikt representerar aortabandning av möss med en aortaförträngning en användbar modell för att studera de molekylära mekanismerna bakom negativ LV-ombyggnad9 och RR10,11 eftersom det tillåter insamling av kortprover vid olika tidpunkter i dessa två faser. Dessutom ger det en utmärkt experimentell miljö för att testa potentiella nya mål som kan främja / påskynda RR. Till exempel, i aortastenos sammanhang, denna modell kan ge information om de molekylära mekanismer som är involverade i den stora mångfalden av skador svar ligger till grund för (in)fullständigheten av RR6,12, samt den optimala tidpunkten för ventil ersättning, som representerar en stor brist på den aktuella kunskapen. Den optimala tidpunkten för detta ingripande är faktiskt föremål för debatt, främst för att den definieras på grundval av storleken på aortagradienterna. Flera studier förespråkar att denna tidpunkt kan vara för sent för hjärtinfarkt återhämtning som fibros och diastolisk dysfunktion är ofta redan närvarande12.
Vår kännedom om detta är den enda djurmodellen som rekapitulerar processen med både hjärtinfarkt och RR som äger rum under förhållanden som aortastenos eller högt blodtryck före och efter ventilbyte eller uppkomsten av antihypertensiv medicinering.
För att möta de utmaningar som sammanfattas ovan beskriver vi en kirurgisk djurmodell som kan implementeras både hos möss och råttor, som tar itu med skillnaderna mellan dessa två arter. Vi beskriver de viktigaste stegen och detaljerna som är involverade när du utför dessa operationer. Slutligen rapporterar vi de viktigaste förändringarna som äger rum i LV omedelbart före och under hela RR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök överensstämmer med vägledningen för vård och användning av laboratoriedjur (NIH-publikation nr 85–23, reviderad 2011) och den portugisiska djurskyddslagen (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). De behöriga lokala myndigheterna godkände detta experimentella protokoll (018833). Sju veckor gamla manliga C57B1/J6 möss bibehölls i lämpliga burar, med en regelbunden 12/12 h ljus-mörk cykel miljö, en temperatur på 22 °C och 60% fuktighet med tillgång till vatten och en standard diet ad libitum.
1. Förberedelse av operationsområdet
- Desinficera operationsstället med 70% alkohol och placera ett engångsduksbord över operationsområdet.
- Sterilisera alla instrument före operationen.
OBS: Detta förfarande kräver mikrokirurgisk sax, 2 fina böjda tångar, 3 fina raka tångar, en skalpell, små tångar, en vinklad dissekatorsax, en nålhållare, ett ultrafint ligaturstöd, 2 hemostater och slutligen rekommenderas ett magnetiskt fixatorupprullningssystem starkt (figur 1A). - Vrid spetsen på en 26 G trubbig nål till 90° för en enklare inflygning till aortan. En 26 G-nål skapar en aorta-förträngning med diametern 0,45 mm (figur 1B).
- Justera värmedynans temperatur till 37 ± 0,1 °C.
2. Beredning och intubering av möss
- Söv unga C57B1/J6 möss (20-25 g) genom inandning av 8% sevofluran med 0,5 - 1,0 L/min 100% O2 i ett konrör.
- Kontrollera anestesidjupet med hjälp av tå nypa abstinensreflexen.
- Placera musen vid dorsal recumbency på en lutande tallrik och fortsätt till orotrakeal intubation.
- Flytta musen till värmedynan och anslut snabbt orotrakealröret till fläkten för att initiera den mekaniska ventilationen.
- Justera ventilatorparametrarna till en frekvens av 160 andetag/min och en tidvattenvolym på 10 ml/kg.
3. Förberedelse för kirurgi (för både banding och debanding operationer)
- Raka och applicera den depilatoriska krämen från halsringningen till mössens mitt bröstnivå.
- Applicera oftalmisk gel på djurens ögon för att förhindra torkning ur hornhinnan.
- Placera en rektal sond och oximetern vid tassen eller svansen för övervakning av temperatur och blodsyrening respektive hjärtfrekvens.
OBS: Anestesi inducerar betydande hypotermi, därför är det viktigt att upprätthålla normal kroppstemperatur under operationen för att undvika en snabb minskning av hjärtfrekvensen. - Behåll anestesi med sevofluran (2,0 - 3,0%). Kontrollera rätt nivå av anestesi genom bristen på tå-nypa reflex.
- Placera mössen i höger-lateral decubitus på en värmedyna och fäst benen på magnetfixatorupprullningssystemet med en tejp för att hålla djuret i rätt position under operationen (Figur 2, Figur 3A).
- Desinficera muskistan med 70% alkohol följt av providone-jodlösning.
4. Stigande aortabanding kirurgi
OBS: För en detaljerad protokollbeskrivning, se 2,3,4,13.
- Med ett engångsblad, utför ett litet (~ 0,5 cm) hudsnitt på vänster sida omedelbart under axillanivån och dissekera huden.
- Dissekera försiktigt och separera bröstmuskeln och andra muskellager tills revbenen blir synliga. Använd fina tångar och undvik att skära muskeln.
- Under ett mikroskop, identifiera interkostala utrymmen och öppna ett litet snitt mellan2: a och 3rd interkostala utrymmet med fina tång.
- Dra tillbaka revbenen genom att placera bröstupprullningsdonet (Figur 2A).
- Använd små tång för att försiktigt dissekera och separera de thymic loberna tills stigande aorta blir synlig.
OBS: Bomullsapplikatorer ska vara praktiska vid blödning. Varm steril saltlösning ska ges subkutant vid betydande blödning (t.ex. bröstartären). - Använd små tångar för att försiktigt dissekera aortan.
OBS: Aorta anses vara dissekerad när det inte finns något fett eller andra vidhäftningar runt det och det är möjligt att enkelt omringa kärlet med en liten kurva tång. - Efter aorta dissekering, placera en 7-0 polypropylen ligatur runt aorta med hjälp av ligatur stöd och böjda tång(figur 2B).
- Placera den trubbiga 26 G-nålen parallellt med aortan (spetsen riktad mot mösshuvudet) (Figur 2B). För möss som väger 20-25 g inducerar denna nål en reproducerbar 65-70% aortaförträngning.
- Gör 2 lösa knutar runt aortan och 26 G-nålen med hjälp av 2 tångar (Figur 2B).
- Dra åt den1: a knuten och, snabbt efter, den2: a knuten. Bekräfta kort rätt positionering av förträngningen och ta snabbt bort nålen för att återställa aortablodflödet. Slutligen, gör en 3rd knut (BA-grupp).
- Flytta tymus och musklerna till sin ursprungliga position.
- Utför skenproceduren identisk med förträngningsproceduren men håll suturen lös runt aortan (SHAM-gruppen).
- Skär suturens ändar och ta bort bröstupprullningsdonet.
OBS: Korta suturändar kan öka sannolikheten för att knutar lossnar med aortatryck, medan långa ändar gör avbandningsproceduren mer riskabel eftersom vidhäftningar kan uppstå mellan suturen och det vänstra atriumet. - Stäng bröstväggen med 6-0 polypropylen sutur med en enkel avbruten eller kontinuerlig sutur med minsta möjliga antal stygn. Dra åt den sista bröstknuten med lungorna uppblåsta i slutet inspiration genom att klämma av utflödet av fläkten i 2s för att blåsa upp lungorna igen.
- Stäng huden med en 6-0 silke/polypropylen sutur i ett kontinuerligt suturmönster.
ANMÄRKNINGAR: Om en nyare ventilator används är det möjligt att programmera den för att pausa i inspiration (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Postoperativ vård
- Applicera providone-jodlösning på hudens suturställe.
- För korrekt analgesi, administrera buprenorfin subkutant 0,1 mg/kg, två gånger dagligen, tills djuret återhämtar sig helt (vanligtvis 2-3 dagar efter operationen).
- Injicera steril saltlösning intraperitoneally för att förhindra uttorkning vid betydande blödning under operationen.
- Stäng av anestesin (utan att deintubera musen) och vänta tills djuret återfår reflexerna (whiskers rörelser är en uppvaknande signal) och börjar andas spontant.
- Ta bort trakeal cannula.
- Låt djuret återhämta sig i en inkubator vid 37 °C.
- Sätt tillbaka djuret i ett 12 h ljust/mörkt cykelrum efter full återhämtning.
6. Aortabanding kirurgi
- Sju veckor senare utför debanding av aortan i hälften av BA-djuren och tar bort den lösa suturen från hälften av SHAM-mössen, vilket ger upphov till 2 nya grupper - debanding (DEB) respektive debanding SHAMA (DESHAM). DESHAM representerar kontrollen för DEB-gruppen (figur 4).
- Upprepa alla steg 2.1 till 3.6 som nämns ovan.
- Dissekera försiktigt vävnaderna, vidhäftningarna och fibrosen runt aortan tills dess förträngning blir synlig.
- Dissekera försiktigt aortan och separera suturen från aortan. Skär suturen med vinklad ensond fjädersax (Figur 3B).
- Stäng bröstväggen med 6-0 polypropylen sutur med en enkel avbruten eller kontinuerlig sutur med minsta möjliga stygn.
OBS: Försök att dra åt den sista bröst suturen när lungorna är uppblåsta för att undvika lungkollaps. - Stäng huden med en 6-0 silke/polypropylen sutur i ett kontinuerligt suturmönster.
- Utför alla postoperativa vårdprocedurer som nämns i 5.
- Offra djuren 2 veckor senare.
7. Ekokardiografi för att bedöma hjärtfunktion och vänster ventrikulär hypertrofi in vivo
- Utför ekokardiografisk undersökning var 2-3 veckor för att följa utvecklingen av hypertrofi och hjärtfunktion.
- Bedöva djuren, som beskrivits, genom inandning av 5% sevofluran med en näskon. Justera anestesinivån genom att minska den till 2,5%.
- Raka och applicera den depilatoriska krämen från halsringningen till mitten av bröstet.
- Placera djuret på en värmeplatta och placera EKG-elektroderna. Säkerställ en bra EKG-spårning och håll pulsen mellan 300 och 350 slag/min.
- Övervaka temperaturen (~37 °C).
- Applicera ekogel och placera djuret vid vänster lateral decubitus.
- Starta ekokardiografin och justera inställningarna.
- Placera en ultraljudssond över bröstkorgen.
- Utvärdera tryckgradienten över bandningen vid 7 och 2 veckor efter banding och debanding kirurgi, respektive. Placera sonden på LV:s långa axel och placera strålen över aortan. Tryck på knappen PW för att aktivera pulsad våg Doppler ekokardiografi. Efter sju veckors bandning kommer aortagradienter att >25 mmHg i de bandade djuren.
- Spela in tvådimensionella guidade bilder av aorta som visar närvaron eller frånvaron av den stigande aortaförträngningen för att anatomiskt visualisera effekten av banding och debanding.
OBS: Det är möjligt att visualisera turbulent flöde på förträngningsnivån om färgläget är tillgängligt. - Utvärdera hypertrofi genom att placera sonden på en kort LV-axel, på papillär muskelnivå, och tryck på M-lägesspårning för att visualisera LV-främre vägg (LVAW), LV-diameter (LVD) och LV bakre vägg (LVPW) i diastole (D) och systole (S) (Figur 5).
- Utvärdera systolisk funktion, beräkna utmatningsfraktionen och den fraktionella förkortningen enligt tidigarebeskrivna 14,15.
- Utvärdera diastolisk funktion med 1) bestämma toppen av pulsed-wave Doppler av tidig och sen mitral flöde hastighet (E respektive A vågor, respektive) med hjälp av en apical 4-kammare apical vy strax ovanför mitral broschyrer; 2) Registrering av laterala mitrala ringformiga kortokardiska tidiga diastoliska (E') och topp systoliska (S') hastigheter med pulserad-TDI och apical 4-kammar apical vy (Figur 5).
- Registrera minst tre på varandra följande pulsslag i varje parameterbedömning. Dessa värden kommer därefter att medelvärdet vara medelvärdet.
8. Hemodynamisk bedömning
- I slutet av protokollet (figur 4), utför slutlig ekokardiografi, enligt beskrivningen i 7, före den slutliga hemodynamiska bedömningen.
- Upprepa steg 2.1 till 3.6.
- Kanylera rätt halsven och perfusera steril saltlösning vid 64 ml/kg/tim.
- Rotera något djuret till vänster sida och gör ett hudsnitt på nivån för xiphoid-tillägget.
- Separera huden från muskeln med tång eller med en sax.
- Gör ett sidosnitt mellan de vänstra revbenen vid xiphoid-tilläggsnivån.
- Utför en vänster laterala thoracotomy för att exponera hjärtat helt.
OBS: För att undvika blödning och lungskador, sätt in en bomullspinne i brösthålan och tryck försiktigt på lungan samtidigt som du sätter in två hemostater på höger och vänster sida av platsen att skära. - Förvärm P-V-slingkatetrarna i ett vattenbad vid 37 °C.
- Kalibrera katetern (inställning, kanalinställning, välj rätt kanal för tryck och volym, enheter).
- Sätt in en kateter aply i LV och se till att volymsensorerna är placerade mellan aortaventilen och toppen. Volymerna kan bedömas med ekokardiografi (figur 5). Visualiseringen av tryckvolymsöglorna bidrar till att bekräfta kateterns korrekta placering (figur 6).
- Låt djuret stabilisera 20-30 min utan betydande förändringar i formen på tryckvolymslingorna.
- Med ventilationen upphängd vid utgångsdatumet, förvärva baslinjeinspelningar (figur 6). Kontinuerligt förvärva data vid 1 000 Hz för att därefter analyseras off-line med lämplig programvara.
- Beräkna parallell resistans efter hyperton saltlösning bolus (10%, 10 μL).
- Medan bedövad, offra djuret genom exsanguination, samla och centrifugera blodet.
- Slutligen, punktskatter och samla hjärtat. Vikt hjärtat, vänster och höger ventrikel separat och omedelbart lagra proverna i flytande kväve eller formalin för efterföljande molekylära eller histologiska studier, respektive.
9. Aortabanding/debanding förfarande hos råttor
- Utför aortabanding i unga Wistar (70-90 g) med en 22 G nål och 6-0 polypropylen ligatur för att begränsa aortan.
- Säkerställa en korrekt bedövningsmedel och smärtstillande förfaranden med 3-4% sevofluran respektive 0,05 mg/kg buprenorfin.
- Under ekokardiografi, försäkra en puls alltid över 300 hastighet / min (helst mellan 300 och 350).
- Före steg 8.9, dissekera försiktigt råtta storasorten, placera en flödessond runt den för att mäta hjärtminutvolymen. Användningen av aortaflödessonden är guldstandardproceduren för råttor.
- För den hemodynamiska utvärderingen kan manylulera halsvenen eller lårbensvenen för vätskeadministration (32 ml/kg/h).
- Byt ut tryckvolymkatetern SPR-1035 mot SPR-847 eller SPR-838, vars storlekar bättre passar råtta ventrikulära dimensioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Postoperativ och sen överlevnad
Den perioperativa överlevnaden av banding förfarandet är 80% och dödligheten under den första månaden är vanligtvis <20%. Som tidigare nämnts är framgången för debanding kirurgi mycket beroende av hur invasiv den tidigare operationen var. Efter en inlärningskurva är dödligheten under debandingprocedurerna cirka 25%. För denna dödlighet står mestadels dödsfall under kirurgiproceduren, inklusive aorta eller vänster atriumruptur (hos råttor är överlevnadsgraden högre i båda kirurgiska ingreppen).
Aortabanding och ombyggnad av hjärtinfarkt
Framgången för kolorektal förträngning verifierades av ökat LV-ändsystoliskt tryck (LVESP) och av Doppler kolorektal flödeshastigheter >2,5 m/s, vilket motsvarar en tryckgradient på 25 mmHg med hjälp av den modifierade Bernoulli-ekvationen (figur 5). Jämfört med SHAM-möss inducerade bandning LV hypertrofi enligt bedömning av ökad LV-massa(tabell 1 och figur 5) och nedsatt diastolisk funktion som framgår av högre påfyllningstryck (förhållandet mellan mitral topphastighet för tidig fyllning (E) till tidig diastolisk mitral ringformig hastighet (E),(E/e') och vänster ventrikulärt änddiastoliskt tryck (LVEDP) och långvarig avslappning (t, Tabell 1, figur 5och figur 6inom 7 veckor. Utmatningsfraktionen bevarades fortfarande i detta skede av sjukdomen.
Histologiskt inducerade sju veckors aortabanding signifikant kardiomyocythypertrofi och fibros (figur 7).
Aortabanding och ombyggnad av myokarder
Hos möss som utsattes för debanding kontrollerades framgångsrikt avlägsnande av kolorektalstenos genom eko Dopplerhastigheter (tabell 1 och figur 5). Totalt sett främjade debanding en betydande minskning av efterbelastning (minskad LVESP) och LV hypertrofi (bedöms av morfometry, ekokardiografi och histologi). Dessutom observerade vi normalisering av diastolisk funktion och aortahastigheter(tabell 1, figur 5, figur 6och figur 7).
Tabell 1: Vänster ventrikel morphofunctional förändringar bedöms av ekokardiografi och av hemodynamics.
| Kritiska steg | råd |
| Invasivitet i bandningsoperationen |
Det är viktigt att undvika: ● långvarig ocklusion av den stigande stora kroppsorten under ligaturen, vilket kan leda till lungödem och aktivering av inflammatoriska vägar som kan påverka fenotyp och sjukdoms allvarlighetsgrad15 ● blödning av bröstartären som, om den inte kringgås i rätt tid, kan leda till sänkt blodtryck och främja högre mängder fibros vid återöppning av bröstkorgen (debanding); ● skada möss pleura och lungor; Mini vänster laterala thoracotomy för banding och debanding (samma plats; nuvarande studie) vs vänster laterala thoracotomy för banding och en sternotomy för debanding kirurgi11: ● den första är mindre invasiv och har kort återhämtningstid, vilket förbättrar framgången för den öppna bröst hemodynamiken som utförs två veckor senare. Aldrig utan problem kan användningen av samma position för att öppna bröstet igen öka antalet komplikationer på grund av vidhäftningar (runt vänster atrium, lungartär etc. ). Övervinn problemet genom att ha extra omsorg under bandningsproceduren. |
| Sutur internalisering |
Kan förhindras genom att använda: ● två bandsuturer sida vid sida16; ● silke istället för polypropylen11; ● titanklämmor eller O-ringar runt aortan för att inducera dess förträngning21; ● dubbelslinga-clip thecnique15; ● uppblåsbar manschett för att utföra suprakoronär kolorektalband22. |
| Fysiologiska parametrar |
Under operationen är det viktigt att övervaka: ● hjärtfrekvens; ● syresättning i blodet, hålla den över 90% (speciellt under aorta manupilation); ● anestesi, hålla den vid lägsta möjliga dos utan att orsaka obehag på djuret. |
Tabell 2: Viktiga steg i protokollet.
Figur 1:Ultrafina kirurgiska instrument som används för bandning och debanding. A)2 nålhållare och ett skalpellblad, 2 katetrar för intubering av möss och en sax; en skalpell, 2 böjda tångar, ett ligaturhjälpmedel, en mikrokirurgisk sax, 3 raka tångar; B)och 26G-nål och trubbig 26G-nål böjd för att passa mössens lilla bröstöppning ordentligt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Aortabandningsprocedur. (A) Bröstmetoden för den stigande stora kroppspulsådern som utförs med hjälp av ett magnetiskt fixatorupprullningssystem (3 upprullningsdon är synliga). B)Den stigande aortan är tydligt dissekerad och synlig. Den trubbiga nålen och polypropylen suturen 6-0 placeras i rätt läge för att utföra aortabanding. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Aortabandingsprocedur. (A) Musen placeras i ett magnetiskt upprullningssystem, som representerar ett praktiskt verktyg för att dra tillbaka musklerna och vävnaderna. Musen är intuberad för mekanisk ventilation. En rektal sond styr temperaturen och en oximeter placeras på rätt möss tass för att övervaka blodsyrening under operationen. Fibros och vidhäftande vävnad avlägsnas försiktigt runt aortan och suturen för att kunna skära suturen (B) och (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Experimentell protokolldesign för möss. Ombyggnad av myokardvätska (röd) och omvänd ombyggnad (grön) visas längst ned tillsammans med alla utvärderingsuppgifter. Observera att debanding kirurgi kan ge upphov till två grupper av djur med distinkta grader av omvänd ombyggnad. Således fick vi DEB mus med komplett (DEB-COMP) och ofullständig (DEB-INCOM) kortdiell återhämtning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Ekokardiografisk bedömning avhjärtstruktur och funktion. B)LV-massa, C)Ventrikulära mått (LV-diameter, LVD) och väggtjocklek (LV bakre vägg, LVPW och LV främre vägg, LVAW). D)Överföringsflöde (pulstoppen Dopplervågen med sen mitralflödeshastighet, A och topp av pulserande Dopplervåg av tidig mitralflödeshastighet, E) och (E) Myokardala hastigheter (sen diastolisk mitral rund vävnadshastighet, A'; tidig diastolisk mitral rund vävnadshastighet, E' och systolisk mitral ringformig vävnadshastighet, S'). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Representativa tryckvolymslingor för SHAM-, BA- och DEB-grupper. Data förvärvades kontinuerligt vid 1000 Hz och analyserades därefter off-line av PVAN programvara. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:Myokardhypertrofi och fibros bedömde histologiskt. (A) Vänster ventrikelhypertrofi bedömd av kardiomyocyter sektionsområde hematoxylin-eosin (HE)-färgade sektioner (5 μm) från SHAM (n = 17), BA (n = 14) och DEB grupp (n = 12). (B) Vänster ventrikulär interstitiell fibros och representativa bilder av röda Sirius-färgade sektioner (5 μm) från SHAM (n = 17), BA (n = 13) och DEB (n = 12). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den modell som föreslås häri efterliknar processen med LV-ombyggnad och RR efter aortabanding respektive debanding. Därför representerar det en utmärkt experimentell modell för att främja vår kunskap om de molekylära mekanismer som är involverade i den negativa LV-ombyggnaden och för att testa nya terapeutiska strategier som kan inducera hjärtinfarkt återhämtning av dessa patienter. Detta protokoll beskriver steg om hur man skapar en gnagare djur modell av aorta banding och debanding med en minimalt invasiv och mycket konservativ kirurgisk teknik för att minska kirurgiska trauma.
Det mest kritiska steget i protokollet är relaterat till graden av kirurgisk aggression under aortabanding. Framgången för den efterföljande aorta debanding kirurgi beror enormt på en minimalt invasiv banding förfarande som undviker vävnad aggression och fibros runt stora kroppskort och därför är en mindre invasiv strategi obligatorisk (tabell 2). Sutur internalisering är associerad med mindre LV hypertrofi och bättre hjärtfunktion 16 (tabell 2) och gör debanding förfarandet omöjligt att utföra utan att orsaka en aorta sprängning. I den nuvarande studien försökte vi använda silke, eftersom det skapar mer ärrvävnad på bandningsplatsen, vilket utlöser en stabilare grad av trycköverbelastning. Men i våra händer var debanding kirurgi mer krävande när silke användes eftersom det är en multifilament tråd vilket gör det totala avlägsnande från stora delar svårare. Detta är dock tekniska frågor som i stor utsträckning är protokoll- och verksamhetsberoende, och dessa variationer, typ av sutur, är inte oförenliga med god teknisk praxis och reproduktiva resultat. Övervakning av fysiologiska parametrar under bandning och särskilt under debanding är obligatorisk för att modellen ska bli framgångsrik (tabell 2).
År 1991 beskrev Rockman et al., den tvärgående aortaförträngningen (TAC) i musen för första gången4. Sedan dess har en ansenlig mängd papper kommit ut med många versioner av detta förfarande med variationer med avseende på djuråldern /storlek 17, möss genetisk bakgrund18, diametern på nålen / förträngningen19, materialet som används för bandning, bandningens aortaplats, varaktigheten av banding19 och debanding11. Alla dessa metodologiska alternativ är giltiga så länge de uppfyller målen för varje studie. Vi bör dock betona att sjukdomsförloppet mot hjärtsvikt är snabbare och därför är RR mer ofullständigt när man väljer: 1) längre bandningstider, 2) tyngre /äldremössen 20 och 3) mindre nåldiameter som används för aortaförträngning (högre andel aortaförträngning)16.
Varaktigheten av banding och debanding påverkar avsevärt sjukdomsstadiet och därmed återhämtningen under RR. På samma sätt är det obligatoriskt att välja rätt tidpunkt för debanding för att anpassa sig till svårighetsgraden av den planerade sjukdomen. Resultaten som observerats i vår studie är i enlighet med pre-existence djur11,21 och humanstudier22, med undantag för kardiomyocyter hypertrofi, där vissa studier visade dess normalisering10,21 och andra dess partiella regression23. Dessutom har studier visat att fibrosregression kan förekomma på lång sikt (70 månader för mänskliga patienter)24. Resultaten verkar vara beroende av den teknik som används för att ta itu med fibros25. Nyligen kunde Treibel et al. skilja mellan cellulära (myocyter, fibroblast, endotel, röda blodkroppar) och extracellulära (ECM, blodplasma) fack hos patienter med aorta stenos efter aorta ventil ersättermennt (AVR) med hjälp av kardiovaskulär magnetisk resonans med T1mappning 22. De beskrev att regression av LV-massa efter AVR kan drivas av 1) matrisregression ensam, där den extracellulära volymen minskar; 2) Enbart cellulär regression, där extracellulär volym ökar; 3) eller genom en proportionell regression i cellulära och matrisutrymmen, där den extracellulära volymen är oförändrad22. Dessa författare drog slutsatsen att efter AVR, medan diffus fibros och hjärtinfarkt cellulär hypertrofi regress, focal fibros inte lösa. Diffus interstitiell fibros, bedömd efter matrisvolym, är således ett potentiellt terapeutiskt mål. I vår studie verkar minskning av fibros ske inom 2 veckor efter RR och före kardiomyocyter hypertrofi normalisering. Att offra djuren 2 veckor efter debanding var också den perfekta tidpunkten för att få ventrikulär mångfald bland DEB-gruppen, nämligen djur med diastolisk dysfunktion persistens (DEB-INCOM) och andra med fullständig LV-massåterföring och diastolisk funktionsförbättring (DEB-COM). Dessutom, så snart som 2 veckor efter debanding, har vi tidigare visat betydande rätt Ventrikulärt förändringar i banding gruppen som delvis återhämtar sig efter debanding26, medan Björnstad et al. rapporterade normalisering av fetala gener uttryck, vägledande för skador ombyggnad inom samma tidsram11.
Det kirurgiska ingreppet av bandning / debanding kan också utföras hos råttor26, men vissa skillnader bör markeras. På grund av sin större storlek har råttor fler muskelskikt än möss som minskar aortavisualisering och hindrar positionering av ligaturen runt aortan. Å andra sidan minimeras risken för att skada intilliggande vävnader och organ, såsom atria eller lungor. För att övervinna frågan om sutur internalisering använde vi en större polypropylen ligatur hos råttor för att hålla tätt aortan (6,0 istället för 7,0 polypropylen).
På grund av aorta manipulation, debanding kirurgi kan minska hjärt produktionen genom att införa ytterligare efterbelastning på LV och därmed försämra cirkulations- och andningsorganen. Jämfört med möss verkar råttor vara mer resistenta mot mer förlängd anestesiperiod och är därför lättare att hålla de fysiologiska andningsparametrarna kontrollerade under den långa debandingoperationen. Hos råttor är LV hypertrofiutveckling snabbare än möss, men det tar längre tid att gå vidare till hjärtsvikt. Således kan debanding kirurgi göras mellan 5-9 veckor efter banding förfarande utan att kompromissa utstötning fraktion26.
Den största begränsningen av bandnings-/debanding-djurmodellen är operatörens krävande mikrokirurgiska färdigheter och teknik, vilket vanligtvis kräver en lång inlärningskurva för att utföra debandingkirurgin. En annan begränsning är omöjligheten att utföra nära bröst hemodynamics i mus och råtta, vilket kommer att vara mer fysiologiskt. Genom att använda denna metod är det dock obligatoriskt att föra in katetern från rätt halspulsåder till LV, vilket i detta speciella fall inte är möjligt eftersom vid bandning av djur som stiger upp i aorta är sammanstådd före halspulsådern. Dessutom, i musen, kunde vi inte mäta belastningsoberoende kontraktilitet (ESPVR) och diastoliska parametrar (lutning av EDPVR) genom att utföra vena cava ocklusion manöver, en viktig parameter för en adekvat karakterisering av hjärtinfarkt funktion. Vi fann denna manöver svår att utföra hos möss med stigande aorta förträngning på grund av deras lilla storlek (20-25g).
Framtida tillämpning av banding / debanding djurmodell inkluderar utvecklingen av nya terapeutiska metoder för skador sjukdomar och karakterisering av de vägar som ligger till grund för processen med LV ombyggnad och RR.
Sammanfattningsvis tillåter denna kliniskt relevanta modell att temporalt och mekanistiskt karakterisera progressionen mot HF, liksom dess återhämtning eftersom det tillåter insamling av skador prover i olika stadier av skador ombyggnad och RR. Dessutom visar det sig vara en användbar experimentell modell för att testa terapeutiska strategier som syftar till att återställa det sviktande hjärtat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Portugisiska stiftelsen för vetenskap och teknik (FCT), Europeiska unionen, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) och Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) för finansiering av forskningsenhet unic (UID/IC/00051/2013). Detta projekt stöds av FEDER genom COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), med stöd av Norte Portugals regionala operativa program (NORTE 2020), inom ramen för portugalavtalet om partnerskap 2020. genom Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), projektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), med stöd av europeiska struktur- och investeringsfonder, Lissabons regionala operativa program 2020. Daniela Miranda-Silva och Patrícia Rodrigues finansieras av Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) genom stipendier (SFRH/BD/87556/2012 respektive SFRH/BD/96026/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
- Arany, Z., et al. Transverse aortic constriction leads to accelerated heart failure in mice lacking PPAR-gamma coactivator 1alpha. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (26), 10086-10091 (2006).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy. Journal of Visualized Experiment. (127), e56231 (2017).
- Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K., Chow, B. K. Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice. Journal of Visualized Experiment. (121), e55293 (2017).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Science. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Koide, M., et al. Premorbid determinants of left ventricular dysfunction in a novel model of gradually induced pressure overload in the adult canine. Circulation. 95 (6), 1601-1610 (1997).
- Rodrigues, P. G., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Myocardial reverse remodeling: how far can we rewind. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1402-1422 (2016).
- Weidemann, F., et al. Impact of myocardial fibrosis in patients with symptomatic severe aortic stenosis. Circulation. 120 (7), 577-584 (2009).
- Bing, R., et al. Imaging and Impact of Myocardial Fibrosis in Aortic Stenosis. JACC Cardiovascular Imaging. 12 (2), 283-296 (2019).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Weinheimer, C. J., et al. Load-Dependent Changes in Left Ventricular Structure and Function in a Pathophysiologically Relevant Murine Model of Reversible Heart Failure. Circulation Heart Failure. 11 (5), 004351 (2018).
- Bjornstad, J. L., et al. A mouse model of reverse cardiac remodelling following banding-debanding of the ascending aorta. Acta Physiologica (Oxford). 205 (1), 92-102 (2012).
- Yarbrough, W. M., Mukherjee, R., Ikonomidis, J. S., Zile, M. R., Spinale, F. G. Myocardial remodeling with aortic stenosis and after aortic valve replacement: mechanisms and future prognostic implications. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (3), 656-664 (2012).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation: Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Li, L., et al. Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging. Journal of Visualized Experiment. (112), e54101 (2016).
- Lygate, C. A., et al. Serial high resolution 3D-MRI after aortic banding in mice: band internalization is a source of variability in the hypertrophic response. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 8-16 (2006).
- Platt, M. J., Huber, J. S., Romanova, N., Brunt, K. R., Simpson, J. A. Pathophysiological Mapping of Experimental Heart Failure: Left and Right Ventricular Remodeling in Transverse Aortic Constriction Is Temporally, Kinetically and Structurally Distinct. Frontiers in Physiology. 9, 472 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Li, Y. H., et al. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. The Journal of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 58 (10), 895-899 (2003).
- Ruppert, M., et al. Myocardial reverse remodeling after pressure unloading is associated with maintained cardiac mechanoenergetics in a rat model of left ventricular hypertrophy. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 311 (3), 592-603 (2016).
- Treibel, T. A., et al. Reverse Myocardial Remodeling Following Valve Replacement in Patients With Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 860-871 (2018).
- Dadson, K., et al. Cellular, structural and functional cardiac remodelling following pressure overload and unloading. International Journal of Cardiology. 216, 32-42 (2016).
- Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79 (4), 744-755 (1989).
- McCann, G. P., Singh, A. Revisiting Reverse Remodeling After Aortic Valve Replacement for Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 872-874 (2018).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Science Reports. 9 (1), 2956 (2019).
