Summary
이 프로토콜은 갈모넬라 구동 장 섬유증의 마우스 모델을 설명합니다 이는 국외 염증과 섬유증을 포함하여 크론병의 주요 병리학 적 특징을 닮았다. 이 방법은 C57Bl/6 유전 적 배경에 유지 돌연변이 마우스를 사용하여 섬유성 결과를 변경 호스트 요인을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
콜라겐과 같은 세포외 기질의 병리학적 축적을 특징으로 하는 조직 섬유증은 지속적인 염증 및 이질성 수선의 결과이다. 염증성 장 질환 (IBD)에서 섬유증은 외과 적 절제술 이외의 효과적인 치료법이없는 재발성 협착 형성으로 이어집니다. 그것의 늦은 개시 때문에, 섬유증을 구동하는 프로세스는 보다 적게 공부하고 크게 알려지지 않습니다. 그러므로, 섬유성 합병증은 IBD에 있는 중요한 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜에서, 장 섬유증의 강력한 생체 내 모델은 C57Bl/6 마우스의 스트렙토마이신 전처리가 백신 등급살모넬라 티피무리움 ΔAroA 돌연변이를 이용한 경구 관치에 이어 지속적인 병원체 식민지화로 이어지는 곳에 설명되어 있습니다. 장의 섬유증. S를 준비하기 위한 방법론. 시피무리움 ΔAroA 는 장 내 의 장 내 적폐증, 병원균 부하 정량화, 장 조직에서 콜라겐 침착 평가에 대해 설명합니다. 이 실험적인 질병 모형은 CD 같이 장 섬유증을 강화하거나 악화시키는 호스트 요인을 검토하기 위해 유용합니다.
Introduction
궤양성 대장염(UC)과 크론병(CD)은 IBD의 두 가지 주요 형태이며 위장관의 만성 및 재발성 염증성 질환으로 특징지어진다 1,2. 이 무질서는 환자의 삶의 질에 중요한 충격이 있습니다. IBD의 현상은 복통, 설사, 구역질, 체중 감소, 발열 및피로를 포함합니다 3. 최근 연구는 질병 병인에 기여하는 유전적 및 환경적 요인을 확인했습니다. 그러한 위험 요소는 발광 항원 4의 전좌 또는 오버 샘플링을 초래하는 상피 장벽의 붕괴에기여한다고생각됩니다. 결과적으로, 이것은 장 내 면역 세포에 의해 매개된 동료 식물에 대한 비정상적인 염증 반응을개시4. IBD 관련 합병증의 특징은 합동, 피부 및 간1,2를포함하여 각종 기관에 영향을 미치는 위관을 넘어 사이트로 확장할 수 있습니다. UC의 특징은 결장1에서전형적으로 국한된 가혹하고 확산성 염증을 포함한다. 질병 병리학은 표면 점막 궤양의 결과로 창자의 점막 및 sub점막에 영향을 미칩니다1. 대조적으로, CD는 질병의 기록이 결장과 말단 ileum2에서일반적으로 발견되지만 기관의 어떤 부분에영향을 미칠 수 있습니다. 또한, CD의 염증은 장 벽2의모든 층에 영향을 미치는 교란입니다.
확인된 몇몇 IBD 감수성 유전자는 상피 장벽 또는 면역의 dysregulation가 질병 진행에 중요한 기여자임을 나타낼 것이다5. 단핵구에 의해 발현된 뉴클레오티드 올리고머화 도메인 2(NOD2)의 돌연변이는 CD에 대한 감수성 증가와 연관되는 것으로 나타났다; 이것은 세균성 분대의 변경한 선천적인 면역 탐지 와 질병6사이 링크를 강조합니다. 최근 게놈 전체 협회 연구 (GWAS)에서 유전 적 변이를 포함하여 IBD의 발병 기전에 잠재적으로 관여하는 추가 경로를 밝혔습니다: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R 종속 경로 적응형 면역, MUC1, MUC19및 PTGER4장 장벽 유지 보수 및 ATG16L-매개 자가 포식7,8,9에연결됩니다. 이 인구 기지를 둔 유전학 연구 결과가 IBD의 우리의 이해를 강화하는 동안, 감수성 eeles 혼자 만성 질병을 개시하고 유지하는 에 불충분합니다3. 창자 microbiome 조성에 있는 변경을 포함하여 그밖 비 유전 요인 및 다양성에 있는 감소는 장 염증과 연관되었습니다. 그러나, 그것은 창 자 dysbiosis 선행 또는 dysregulated 면역 반응의 결과 인지 불분명3. IBD의 병인학은 불분명하게 남아 있더라도, 질병의 병인의 우리의 이해는 장 염증의 실험적인 마우스 모형에 의해 강화되었습니다10,11. 이러한 모델은 개별적으로 인간 질병의 복잡성을 완전히 나타내지는 않지만 IBD와 관련이있을 수있는 병리 생리학적 경로를 해명하고 잠정 치료 전략10의검증에 유용합니다. 11. 이러한 마우스 모델은 전형적으로 화학적 유도 또는 감염, 면역 세포 전달 또는 유전 적 조작에 의한 염증의 개시에 의존한다. 더욱이, 이 전략은 수시로 상피 무결성또는 선천적인 적응성 면역의 변조에 있는 섭동을 관련시킵니다.
살모넬라 장테카 세로바르는 인간과 마우스를 감염시킬 수 있는 장 병원체입니다. 섭취 후, 살모넬라는 상피, M 세포, 또는 항원 제시 세포의 직접적인 침입에 의해 용기를 식민지화 할 수있다12. 마우스는 S와 구두로 감염. 티피무리움은 주로 비장 및 장만 림프절과 같은 전신 부위의 식민지화를 초래하며,기관(12)에서상대적으로 낮은 풍부도를 가진다. 그러나, 스트렙토마이신을 가진 마우스의 전처리는 일반적인 microbiota13의호스트 보호 효력을 감소시킴으로써 창자의 살모넬라 식민지화의 효율성을 향상시킵니다. 이 모델의 병리학적 특징은 상피 장벽의 중단 또는 궤양, 과립구 모집, 및 심한부종(13)을포함한다. 대안적으로, 백신 등급 S를 가진 감염. 티피무륨 ΔAroA 돌연변이는 감염14후에 40일까지 지속되는 장양과 결장의 만성 식민지화로 이끌어 냅니다. S. 티피무륨 ΔAroA 균주는 방향족 아미노산의 생합성에 결함이 있다; 이는 돌연변이 균주를 avirulent렌더링하고 매우 효과적인백신(15)으로서이용될 수 있다. 마우스에서의 경구 감염은 Th1- 및 Th17-사이토카인 관련 염증 반응, 광범위한 조직 리모델링 및 콜라겐 침착을 유도한다. 조직 병리학은 TGF-β1, CTGF 및 IGF14와같은 프로 섬유성 인자의 높은 수준과 연관됩니다. 이 모형에서 보고된 경막섬유성 흉터는 IBD에서 수시로 관찰된 협착한 구조물을 연상시킵니다. 살모넬라에 의한 섬유증의 유도는 살모넬라 병원성 섬 (SPI)-1 및 2 12에의해 인코딩 된 독성을 필요로한다. 중요한 것은,이 S. Tymphimurium ΔAroA 감염 모델은 C57/Bl6 배경상에 유지되는 돌연변이 마우스에서 섬유성 반응의 연구에 유용한 시스템이다. C57/Bl6 스트레인은 S에 매우 민감합니다. Typhiumurim SL1344 감염 때문에 자연 저항 관련 대 식 단백질을 코딩 하는 유전자에서 기능의 손실 돌연변이 (NRAMP)-116,17. 우리는 IL-17A 및 RORα 의존성 선천적 림프세포가 이 모델18에서병인에 중요한 기여한다는 것을 발견하였다.
CD의 주요 합병증은 콜라겐2,19를포함하는 세포외 매트릭스(ECM)의 이질및 과도한 침착이다. 기관은 재생에 대한 상대적으로 높은 용량을 가지고 있지만, 섬유성 흉터는 만성 및 심한 염증과 관련된 해결되지 않은 상처 치유 반응으로 인해 발생할 수 있습니다20,21. CD에서, 이것은 중요한 기관 손상으로 이끌어 내는 조직 건축에 해로운 효력 결과21,22. CD에서 관찰되는 염증의 경막특성은 궁극적으로 증상 협착 또는 협착형성(21)과관련된 장벽의 두껍게 하기 선행한다. CD 환자의 대략 1/3은 이 합병증을 위한 장절제술을 요구합니다 22. 아자티오프린 또는 항 TNFα 생물학적 제제와 같은 면역 억제제의 사용이 외과 적 개입의 요구 사항을 적당히 감소시켰거나 단지 겸손하게 감소했다는 점을 감안할 때 IBD에는 효과적인 항 섬유성 치료법이 없습니다19,23 . 섬유증은 만성 염증의 결과라고 생각되지만, 섬유아세포 및 회구와 같은 중간엽 기원의 세포는 섬유성흉터21,24에서ECM의 1차 세포 공급원으로 생각된다. 만성 S. 티피무리움 ΔAroA 감염은 CD와 같은 특징의 병인에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 장 섬유증의 강력한 마우스 모델입니다.
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Protocol
모든 동물 프로토콜은 브리티시 컬럼비아 대학의 동물 관리 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 생쥐의 구강 관념을 위한 살모넬라 티피무리움 ΔAroA 배양준비
- S의 냉동 글리세롤 주식에서. 티피무리움 ΔAroA, 멸균 접종 루프와 100 μg / mL 연쇄상 구균을 포함하는 LB 한천을 사용하여 줄무늬 플레이트를 준비합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양. 줄무늬 플레이트는 4°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있습니다.
- 감염 하루 전에 2.5 mL의 물에 연쇄상 구균 0.5 g을 용해시켜 항생제를 준비하십시오. 필터 살균 연쇄상 구균 균증 용액 후, 구두로 전구 팁 22G gavage 바늘과 1 mL 주사기를 사용하여 마우스를 게이지 100 스트렙 토 마이신 용액의 100 μL (20 mg 스트렙토 마이신 / 복용량). 접종 루프를 사용하여 단일 콜로니가있는 배양 튜브에서 LB 국물 (50 μg / mL 연쇄상 구균)의 3 mL을 접종합니다. 37°C에서 밤새 200 RPM에서 흔들어 서 살모넬라 배양물을 에어로비액으로 배양하였다.
- 감염 당일, 멸균 PBS에서 하룻밤 살모넬라 배양물의 2회 연속 1/10 희석을 수행하여 최종 감염 용량을 준비합니다. 이것은 대략 3 x 106 CFU를 포함하는 100 μL 접종을 초래할 것이다.
- 전구 팁 22G 게이지 바늘과 1 mL 주사기를 사용하여, 제조 된 살모넬라의 100 μL로 각 마우스를 위배.
참고 : 무균 기술을 사용하여 살모넬라 문화를 준비하십시오. 살모넬라균의 최종 접종 농도는 스트렙토마이신을 함유한 LB 한천에서 직렬 희석제를 도금함으로써 확인할 수 있다. S. 티피무리움 ΔAroA 균주는 교수 맥나그니 (kelly@brc.ubc.ca)에 연락하여 얻을 수 있습니다.
2. 조직의 살모넬라 부담 평가
- 멸균 PBS 1mL와 오토클레이브 스테인리스 스틸 비드로 2 mL 안전 잠금, 둥근 바닥 마이크로튜브를 준비합니다. 조직 수집 전에 튜브를 미리 계량합니다.
- 이산화탄소 노출에 의해 안락사된 마우스로부터 세칼 및 비장 조직을 절제합니다. 별도의 튜브에 개별 동물에서 조직을 수집합니다. 튜브를 계량하여 조직 분동을 결정합니다.
- 30 Hz에서 15 분 동안 믹서 밀 장치를 사용하여 균질화. 96 웰 2 mL 메가 블록에서 웰 당 PBS의 900 μL을 전송합니다. 피펫 100 μL의 조직균질은 제1 웰내로 균질화되고, 잘 혼합되고, 100 μL을 후속 웰에 첨가하여 100 μL을 첨가하여10-6 희석이 얻어질 때까지 직렬 희석을 수행한다. 플레이트 10 μL 100 μg/mL 스트렙톰신을 함유하는 LB 한천상에 삼중 희석의 각 희석.
- 1000 μL 샘플의 10 μL이 도금되고, 적절한 희석 인자를 가하고, 그 이후 평균 CFU를 100의 인자를 곱하고 곱하였다. 조직 무게 총 CFU를 조직 중량별로 나누어 조직의 그램당 CFU를 결정합니다.
참고: 모든 시료를 얼음 이나 조직 처리 중 4 °C에 보관하십시오. 조직 균질성으로 직렬 희석을 수행할 때 넓은 오리피스 파이펫 팁을 사용하십시오. PBS를 포함하는 96웰 메가블록을 미리 준비한다.
3. 피크로시리우스 레드 염색 및 콜라겐 정량화.
- 10% 버퍼링된 포르말린에서 하룻밤 동안 세칼 조직을 고치고 파라핀 을 삽입할 준비를 하십시오. 앞서 설명한 대로 피크로시리우스 레드 염색에 대한 5-μm 섹션을 잘라25.
- 밝은 시야 현미경으로 전체 세칼 단면의 합성 이미지를 캡처합니다.
- 피지(ImageJ)를 열고 .tif 이미지 파일을 도구 모음에 끌어 놓습니다.
- 메뉴 모음에서 이미지 > Type > RGB 스택을 선택하여 이미지를 빨간색, 녹색 및 파란색 채널로 분할합니다. 패널 하단의 가로 막대를 밀어 채널을 녹색으로 설정합니다.
- 이미지 > 조정 > 임계값 도구를 엽니다. 최소 및 최대 제한을 조정하여 배경 신호를 제거합니다. 원하는 임계값이 설정되면 임계값 도구를 닫고 분석 > 측정 설정으로 이동합니다. 영역, 영역 분수, 임계값으로 제한및 레이블 표시를 선택합니다.
- 프리핸드 선택 또는 다각형 선택 도구를 사용하여 조직 섹션을 게이트하고 분석 > 측정을클릭하여 콜라겐에 대한 %영역 을 측정합니다.
- 조직 부위에 콜라겐 염색에 대해 양수 절대 영역을 정상화합니다.
참고 : 피지 (ImageJ)는 https://fiji.sc 다운로드 할 수있는 오픈 소스 프로그램입니다. 동일한 캡처 조건(예: 밝기 및 초점)을 가진 이미지는 정확한 정량화를 위해 동일한 임계값 제한을 가져야 합니다. 선택한 조직 내에 배경 얼룩이있는 경우 절대 영역을 측정하고 전체 조직에서 콜라겐에 대한 양성 영역에서 빼내.
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Representative Results
S를 가진 경구 감염에 선행된 연쇄상 구균 성미 증 처리. 티피무륨 ΔAroA는 특히 맹장에서 강력한 장 염증 및 섬유증을 유발합니다(그림 1). 일반적인 병원균 부담은 1g의 삼장당 10 8~10CFU, 비장 1g당 104 CFU의 감염동물로부터 회복될 수 있다(그림2). 피로시리우스 적색 스테인드 세칼 섹션에서 섬유증의 평가는 감염 후 21일 동안 피크 섬유증을 나타내며 병리학의 대부분은 42pi(그림 3 및 그림 4)에의해 해결된다. 콜라겐 증착은 점막의 섬유증이 온화하면서 장의 점막에서 가장 두드러집니다.
그림 1. 운동학, 살모넬라 부담 평가 및 사이토카인 정량화를 위한 세칼 절편도.
세칼 팁을 나타내는 세그먼트 1은 유전자 발현 분석을 위해 사용될 수 있고 세그먼트 2는 10% 완충포르말린에서 고정될 것이고 세그먼트 3은 세균 열거를 위해 균질화될 것이다.
그림 2. 병원균은 세카와 비장의 부담.
살모넬라 균 감염 과정 동안 조직의 무게 당 CFU. 이 수치는 Lo 등 에서수정되었습니다. 26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 피크로시리우스 붉은 장 조직의 단면.
감염되지 않은 동물 및 동물로부터의 세카의 밝은 필드 이미지 21 및 42 일 후 S. 티피무리움 ΔAroA 감염. 스케일 바, 200 μm. 이 수치는 Lo 등 에서수정되었습니다. 26.
그림 4. 형태 측정 분석에 의한 콜라겐 증착의 정량화.
(A)PSR+ 염색이 조직 부위로 정규화됩니다. 던스 포스트 테스트와 단방향 ANOVA 크루스칼- 월리스 테스트에 의해 결정 된 중요성. **, P < 0.01, N.S., P > 0.05. 이 수치는 Lo 등 에서수정되었습니다. 26. (B)피지를 이용한 세칼 조직에서 콜라겐 정량화의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
IBD의 병인에 대한 우리의 이해는 장 염증의 마우스 모델에 의해 크게 향상되었습니다. 이러한 개별 모델이 복잡하고 다인성 인간 질병의 모든 특징을 되풀이하지는 않지만 질병 진행의 주요 특징을 식별하는 데 유용했습니다. IBD와 관련 되 었던 섬유 성 협착 현재 치료는 질병 개발을 반전에 효과가 있기 때문에 주요 충족 되지 않은 임상 필요 남아. 더욱이, 장 섬유증은 현재 동물 모형에 있는 제한 때문에 실험실 조정에서 공부하기 어렵습니다. BALB/c 마우스에서 TNBS에 대한 만성 노출은 IL-13 및 TGF-B1 신호화27,28에의해 구동되는 결장에서 강력한 콜라겐 침착을 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, 장 섬유증은 DSS 처리, IL-10 결핍, 또는 입양 T 세포 전송 모형과 같은 대장염의 그밖 일상적으로 이용되는 실험실 모형에서 일반적으로 관찰되지 않습니다. Grassl 외. 약화된 ΔAroA 돌연변이 살모넬라 균주를 가진 C57Bl6의 만성 위장 감염이 12의 점막 및 점막 영역에서 강력한 섬유증을 초래한다는 것을 입증하였다12. 그(것)들은 피크 섬유증이 감염 후에 3 주 발생하고 Th1 및 Th17 면제 및 높은 pro 섬유성 요인 TGF-B1, CTGF 및 IGF-112와연관되었다는 것을 보고했습니다. 이 병리학은 심각한 염증과 섬유증이 교란기이기 때문에 CD를 연상시킵니다. IBD는 전형적으로 진보적인 동안, 만성 살모넬라 감염 모형의 1개의 중요한 제한은 섬유성 면역 병리학의 일시적인 본질입니다. C57Bl/6 마우스에서는, 장 질병은 일반적으로 감염 후에 주 6에 의해 해결됩니다. 이러한 결점에도 불구하고, 이 감염 모델의 후기 단계는 질병 완화 촉진에 관여하는 요인 또는 과정을 식별하기 위해 이용될 수 있다26.
대장염의 세균성 병원체 구동 모형은 잘 공부되더라도, 살모넬라와 CD 사이 아무 협회도 없습니다. 그러나, 만성 살모넬라 식민지의 후기 단계 도중 섬유성 질병의 크기는 병리학이 일단 가혹한 장 "자기 전파"이다는 것을 건의하는 병원체 부담과 직접 상관관계가 없다는 것을 제안되었습니다 염증은 살모넬라29에의해 시작됩니다. 대조적으로, 부착-침습성 대장균(AIEC) 병리는 환자의 장막 점막에서의 높은 유병률 때문에 CD의 발달과 강하게 연관되어 있다30. 또한, C57Bl/6를 포함한 여러 마우스 균주의 장, 묘지 및 결장의 지속적인 AIEC 식민지화(최대 9주)는 이의 섬유성 유도 전위를 입증하는 플래그넬린 발현을 통해 장에 강력한 매트릭스 축적을 유도합니다. 파토비온트31,32. 장 섬유증의 감염 구동 모형의 최근 발달은 IBD의 강력한 실험 모형을 제공했습니다. 이들은 그들의 독성 요인을 포함하여 장내 세균성 종 사이 관계를 해부하는 새로운 시스템을 제공하고, IBD 관련 섬유증의 우리의 이해를 강화할 수 있는 호스트 감수성 요인.
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Disclosures
저자는 공개 할 이익의 재정적 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 학비 서비스에 대한 잉그리드 바르타 에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 ml round bottom safe lock tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| Large-Orifice Pipet Tips | Fisher | 2707134 | |
| 2 mL megablock plates | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| Gavage needles | FST | 18061-22 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Mixer mill | Retsch | MM |
References
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