Summary
Detta protokoll beskriver en musmodell av salmonella driven intestinal fibros som liknar viktiga patologiska kännetecken för Crohns sjukdom inklusive transmural inflammation och fibros. Denna metod kan användas för att utvärdera värd faktorer som förändrar fibrotiska resultat med muterade möss upprätthålls på en C57Bl/6 genetisk bakgrund.
Abstract
Vävnad fibros kännetecknas av patologiska ansamling av extracellulär matris såsom kollagen är resultatet av ihållande inflammation och dysreglerad reparation. Vid inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) leder fibros till återkommande striktur formationer för vilka det inte finns någon effektiv behandling annat än kirurgisk resektion. På grund av dess sena debut, de processer som driver fibros är mindre studeras och till stor del okända. Därför, fibrotiska komplikationer utgör en stor utmaning i IBD. I detta protokoll beskrivs en robust in vivo-modell av intestinal fibros där streptomycin förbehandling av C57Bl/6-möss följt av oral Sonda med vaccin klass salmonella typhimurium ΔAroA Mutant leder till ihållande patogen kolonisering och fibros i blindtarmen. Metoder för beredning av S. Typhimurium ΔAroA för ympning, kvantifiering av patogen laster i blindtarmen och mjälte, och utvärdera kollagen deposition i tarm vävnader förklaras. Denna experimentella sjukdoms modell är användbar för att undersöka värd faktorer som antingen förstärker eller förvärerar CD-liknande tarm fibros.
Introduction
Ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD) är de två stora formerna av IBD och kännetecknas som kroniska ochskovvis inflammatoriskasjukdomar i mag-tarmkanalen 1,2. Dessa sjukdomar har en stor inverkan på livskvaliteten för patienter. Symtom på IBD inkluderar buksmärtor, diarré, illamående, viktminskning, feber, och trötthet3. Nyligen genomförda studier har identifierat genetiska och miljömässiga faktorer som bidrar till sjukdomens patogenes; Det är tänkt att sådana riskfaktorer bidrar till störningen av epitelbarriären vilket resulterar i flyttning eller översampling av luminala antigener4. Som en följd, detta initierar en avvikande inflammatorisk reaktion på kommensaler Flora medierad av intestinala immunceller4. Dragen av IBD-associerade komplikationer kan utsträckas till platser bortom mag-tarmkanalen påverkar olika organ inklusive leder, hud, och lever1,2. Kännetecken av UC inkluderar svår och diffus inflammation typiskt lokaliserad i tjocktarmen1. Sjukdoms patologi påverkar slemhinnan och submucosa i tarmen vilket resulterar i ytliga slemhinnor ulcerationer1. Däremot kan CD påverka någon del av magtarmkanalen även om tecken på sjukdom är vanligt förekommande i tjocktarmen och distala ileum2. Dessutom, inflammationen i CD är transmural, påverkar alla skikt av tarmväggen2.
Flera IBD känslighet gener som har identifierats skulle tyda på att dysreglering av epitelbarriären eller immunitet är kritiska bidragande till sjukdomsprogression5. Mutationer i nukleotid oligomerisering domän 2 (NOD2) uttryckt av monocyter konstaterades vara förknippade med ökad känslighet för CD; Detta belyser en koppling mellan förändrad medfödda immun upptäckt av bakteriella komponenter och sjukdomen6. Nyare genomomfattande Associations studier (GWAS) har avslöjat ytterligare vägar som kan vara involverade i patogenesen för IBD, inklusive genetiska variationer hos: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R beroende vägar kopplad till adaptiv immunitet , MUC1, MUC19, och PTGER4 i tarmbarriären underhåll, och ATG16L-medierad autofagi7,8,9. Medan dessa populationsbaserade genetik studier har förstärkt vår förståelse av IBD, känslighet alleler ensamt är sannolikt otillräckliga för att initiera och upprätthålla kronisk sjukdom3. Andra icke-genetiska faktorer inklusive förändringar i Gut mikrobiomet sammansättning och en minskning av mångfalden har förknippats med intestinal inflammation. Emellertid, det är oklart om gut dysbios föregår eller är följden av dysreglerade immunsvar3. Även etiologin av IBD förblir oklar, vår förståelse av patogenesen av sjukdomen har förbättrats genom experimentella musmodeller av tarminflammation10,11. Dessa modeller representerar inte helt komplexiteten hos den mänskliga sjukdomen, men de är värdefulla för att belysa patofysiologiska vägar som kan vara relevanta för IBD och för validering av preliminära terapeutiska strategier10, 11. Sådana musmodeller förlitar sig vanligtvis på initiering av inflammation genom kemisk induktion eller infektion, immun cells överföring, eller genetisk manipulation. Dessutom, dessa strategier involverar ofta störningar i epitelial integritet eller modulering av medfödd eller adaptiv immunitet.
Salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar är intestinala patogener som kan infektera människor och möss. Efter intag, salmonella kan kolonisera tarmen genom direkt invasion av epitelia, M celler, eller antigen presenterande celler12. Möss infekterade oralt med S. Typhimurium resultat i koloniseringen främst av systemiska platser såsom mjälte och mesenteriska lymfkörtlar med relativt lågt överflöd i magtarmkanalen12. Emellertid, förbehandling av möss med streptomycin ökar effektiviteten av salmonella kolonisering av tarmen genom att minska värd skyddande effekterna av den normala bakterieflora13. Patologiska funktioner i denna modell inkluderar störning eller sår av epitelbarriären, granulocyt rekrytering, och svår ödem13. Alternativt, infektion med vaccin klass S. Typhimurium ΔAroA Mutant leder till kronisk kolonisering av blindtarmen och tjocktarmen som kvarstår upp till dag 40 efter infektion14. Den S. Typhimurium ΔAroA stam har en defekt i biosyntesen av aromatiska aminosyror; Detta gör den muterade stammen Avirulenta och kan utnyttjas som en mycket effektiv vaccin15. Oral infektion hos möss leder till en Th1-och Th17-cytokin associerade inflammatoriska svar, omfattande vävnad remodeling, och kollagen deposition. Vävnads patologi är förknippad med förhöjda nivåer av Pro-fibrotiska faktor såsom TGF-β1, CTGF, och IGF14. Den transmural fibrotiska ärrbildning rapporteras i denna modell påminner om striktur formationer ofta observerats i IBD. Induktion av fibros genom salmonella kräver virulens kodat av salmonella pathogenicitetsöar (SPI)-1 och 2 12. Viktigt, detta S. Tymphimurium ΔAroA infektion modell är ett användbart system för studiet av fibrotiska svar i muterade möss upprätthålls på en C57/Bl6 bakgrund. C57/Bl6-stammen är extremt känslig för S. Typhiumurim SL1344 infektion på grund av en förlust-av-funktion mutation i genen kodning av naturliga resistensassocierade makrofagprotein (nramp)-116,17. Vi har funnit att Il-17a och rorα-beroende medfödda lymfoida celler är viktiga bidragande till patogenes i denna modell18.
En stor komplikation av CD är den dysreglerade och överdriven deposition av extracellulära matrix (ECM) inklusive kollagen2,19. Även om magtarmkanalen har en relativt hög kapacitet för förnyelse, fibrotisk ärrbildning kan uppstå på grund av olösta sårläkning svar som är förknippade med kronisk och svår inflammation20,21. I CD, detta resulterar i skadliga effekter på vävnads arkitektur leder till betydande organskada21,22. Den transmural karaktären av inflammationen observerats i CD i slutändan föregår förtjockning av tarmväggen i samband med symtomatisk stenos eller striktur formation21. Om en tredjedel av CD-patienter kräver intestinal resektion för denna komplikation22. Det finns inga effektiva anti-fibrotiska terapier i IBD med tanke på att användningen av immunsuppressiva medel såsom azatioprin eller anti-TNFα Biologics inte har någon effekt eller endast blygsamt minskat behovet av kirurgiska ingrepp19,23 . Medan fibros är tänkt vara följden av kronisk inflammation, celler av mesenkymala ursprung såsom fibroblaster och pericyter tros vara den primära cellulära källor av ECM i fibrotisk ärrbildning21,24. Kronisk S. Typhimurium ΔAroA infektion är en robust musmodell av intestinal fibros som kan erbjuda insikter i patogenesen av CD-liknande funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur protokoll godkändes av djur hälso nämnden vid University of British Columbia.
1. beredning av salmonella typhimurium ΔAroA kulturer för oral Sonning av möss
- Från en fryst glycerol lager av S. Typhimurium δaroa, Förbered en strimma plattan med lb agar som innehåller 100 μg/ml streptomycin med en steril vaccinera loop. Inkubera över natten vid 37 ° c. Strimma plattor kan förvaras upp till en vecka vid 4 ° c.
- En dag före infektionen, Förbered antibiotika genom att lösa upp 0,5 g streptomycin i 2,5 mL vatten. Efter filtersteriliserande streptomycin lösning, oralt sonderande möss med en glödlampa-tippas 22G sondnål och 1 mL spruta med 100 μL av streptomycin lösning (20 mg streptomycin/dos). Använd en vaccinera loop, Inokulera 3 ml lb buljong (50 μg/ml streptomycin) i ett kultur rör med en enda koloni. Inkubera salmonella kulturen aerobt vid 37 ° c över natten med skakning vid 200 RPM.
- På dagen för infektion, Förbered slutlig infektions dos genom att utföra 2 på varandra följande 1/10 utspädningar av natten salmonella kulturer i steril PBS. Detta skulle resultera i en 100 μl inokulum som innehåller cirka 3 x 106 CFU.
- Använd en Bulb-tippad 22g sondnål och en 1 ml spruta, sondmatning varje mus med 100 μl av den beredda salmonella.
Anmärkning: Förbered salmonella kulturer med aseptisk teknik. Slutlig inympning koncentration av salmonella kan verifieras genom plätering seriella utspädningar på LB agar med streptomycin. S. typhimurium ΔAroA stammen kan erhållas genom att kontakta professor McNagny (kelly@brc.ubc.ca).
2. bedömning av salmonella bördor i vävnader
- Förbered 2 ml Safe-lock, rund botten mikrorör med 1 ml steril PBS och en autoklav rostfrittstål pärla. Förväga rören före vävnads uppsamling.
- Återförsäld cecal och mjältvävnad från möss som euthanized genom koldioxid exponering. Samla vävnad från enskilda djur i separata rör. Väg rören för att bestämma vävnads vikter.
- Homogenisera med en mixer fräs apparat i 15 min vid 30 Hz. överför 900 μL PBS per brunn i en 96-brunn 2 mL megablock. Pipettera över 100 μL vävnad homogena i den första brunnen, blanda väl och utför seriella spädningar genom att tillsätta 100 μL till efterföljande brunnar tills en 10-6 utspädning erhålls. Platta 10 μL av varje spädning i tre exemplar på LB-agar innehållande 100 μg/mL streptomcyin.
- Räkna och multiplicera Genomsnittligt CFU med en faktor 100 eftersom 10 μL av provet på 1000 μL var pläterat, och lämplig utspädningsfaktor. Dividera vävnad vikt totalt CFU av vävnad vikter för att bestämma CFU per gram vävnad.
Obs: Förvara alla prover på is eller vid 4 ° c under vävnads bearbetningen. Använd pipettspetsar med breda munstycken när du utför seriella utspädningar med vävnads homogena. Förbered 96-brunnen megablock som innehåller PBS i förväg.
3. picrosirius rödfärgning och kvantifiering av kollagen.
- Fix cecal vävnader över natten i 10% buffrad formalin och förbereda för paraffin inbäddning. Skär 5-μm sektioner för Picrosirius rödfärgning som beskrivits tidigare25.
- Fånga sammansatta bilder av hela cecal tvärsnitt på ett brightfield Mikroskop.
- Öppna Fiji (ImageJ) och dra och släpp. tif-avbildningsfilen till verktygsfältet.
- På menyraden väljer du bild ≫ typ > RGB-stacken för att dela upp bilden i röda, gröna och blåa kanaler. Skjut den vågräta stapeln längst ned på panelen för att ställa in kanalen på grön.
- Öppna bild ≫ justera ≫ tröskel verktyg. Justera minimi-och maximigränser för att eliminera eventuella bakgrunds signaler. När du har angett önskad tröskel stänger du tröskel verktyget och går till analysera ≫ inställda mätningar. Markera område, områdes fraktion, gränsvärde och visningsetikett.
- Grinden vävnad avsnitt med antingen FreeHand val eller polygon val verktyget och mäta% området positivt för kollagen genom att klicka analysera > mått.
- Normalisera det absoluta området positivt för kollagen färgning till vävnads området.
Obs: Fiji (ImageJ) är ett open-source program som kan laddas ner på https://fiji.sc. Bilder med samma inspelningsförhållanden (t. ex. ljusstyrka och fokus) måste ha identiska tröskel gränser för korrekt kvantifiering. Om det finns någon bakgrunds färgning inom den valda vävnaden, Mät det absoluta området och subtrahera det från området positivt för kollagen från hela vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling med streptomycin följt av oral infektion med S. Typhimurium ΔAroA leder till robust tarminflammation och fibros särskilt i blindtarmen (figur 1). Typiska patogen bördor på 108 till 109 CFU per 1 g blindtarmen och 104 CFU per 1 g mjälte kan återvinnas från smittade djur (figur 2). Bedömning av fibros i picrosirius röd färgade cecal avsnitt indikerar topp fibros 21 dagar efter infektion medan mycket av patologi löses av dag 42 PI (figur 3 och figur 4). Kollagen deposition är mest uttalad i submucosa i tarmen medan fibros i slemhinnan är mildare.
Figur 1. Diagram över cecal-snittning för histologi, bedömning av salmonella bördan och kvantifiering av cytokin.
Segment 1 som representerar cecal Tip kan användas för gen uttrycks analys medan segment 2 kommer att fastställas i 10% buffrad formalin för histologi och segment 3 kommer att homogeniseras för bakteriell uppräkning.
Figur 2. Bördan för patogener i Ceca och spleens.
Salmonella CFU per vikt av vävnad under infektionsförloppet. Denna siffra har modifierats från Lo et al.26. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Picrosirius röda färgade tvärsnitt av tarm vävnad.
Ljusa fält bilder av Ceca från icke-infekterade djur och djur 21 och 42 dagar efter S. Typhimurium ΔAroA infektion. Skalbar, 200 μm. Denna siffra har modifierats från Lo et al.26.
Figur 4. Kvantifiering av kollagen deposition genom morphometriska analyser.
(A) PSR + färgning normaliserad till vävnads området. Signifikans bestäms av enkelriktad ANOVA Kruskal-Wallis test med Dunns post test. * *, P < 0,01, ns, s > 0,05. Denna siffra har modifierats från Lo et al.26. B) exempel på kvantifiering av kollagen i cecal-vävnad med Fiji. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår förståelse av patogenesen för IBD har förbättrats kraftigt genom musmodeller av tarminflammation. Även om sådana enskilda modeller inte recapitulate alla funktioner i komplexa och multifaktoriell mänskliga sjukdomen, de har varit användbara för att identifiera viktiga funktioner i sjukdomsprogression. Fibrotiska strikturer i samband med IBD förblir ett stort icke tillgodosedda kliniskt behov eftersom nuvarande behandlingar är ineffektiva i att vända sjukdomsutveckling. Dessutom är intestinal fibros svårt att studera i laboratoriemiljö på grund av begränsningar i nuvarande djurmodeller. Kronisk exponering för TNBS i Balb/c möss har visat sig inducera robust kollagen deposition i tjocktarmen som drivs av Il-13 och TGF-B1 signalering27,28. Emellertid, intestinal fibros är inte vanligt förekommande i andra rutinmässigt används laboratorium modeller av kolit såsom DSS behandling, IL-10-brist, eller adoptiv T cell transfer modeller. Grassl et al. visat att kronisk gastrointestinal infektion av C57Bl6 med den försvagade δaroa Mutant salmonella stam resulterar i robust fibros i slemhinnor och submukosala regioner i blindtarmen12. De rapporterade att Peak fibros inträffade tre veckor efter infektion och förknippades med Th1 och Th17 immunitet och förhöjda Pro-fibrotiska faktorer TGF-B1, CTGF, och IGF-112. Denna patologi påminner om CD eftersom den svåra inflammationen och fibros är transmural. Medan IBD är typiskt progressiv, en viktig begränsning av kronisk salmonella infektion modellen är övergående natur fibrotiska immunopatologi. I C57Bl/6 möss, tarmsjukdom är typiskt lösas av vecka sex efter infektion. Trots denna brist, de senare stadierna av denna infektions modell kan utnyttjas för att identifiera faktorer eller processer som deltar i att främja sjukdoms remission26.
Även bakteriell patogen-driven modeller av kolit är väl studerade, det finns inget samband mellan salmonella och CD. Emellertid, det har föreslagits att omfattningen av fibrotisk sjukdom under de senare stadierna av kronisk salmonella kolonisering inte direkt korrelerar med patogen bördor som tyder på att patologi är "själv förökningsmaterial" en gång svår intestinal inflammation initieras av salmonella29. I motsats, den anhängare-invasiva Escherichia coli (AIEC) pathovar har varit starkt kopplad till utvecklingen av CD på grund av dess höga prevalens i ileal slemhinnan hos patienter30. Dessutom, ihållande AIEC kolonisering (upp till 9 veckor) av ileum, blindtarmen och kolon av flera möss stammar inklusive C57Bl/6 leder till robust matris ackumulering i tarmen via flagellin uttryck vilket visar den fibrogena induktion potentialen av denna pathobiont31,32. Den senaste utvecklingen av infektionsstyrda modeller av intestinal fibros har gett robusta experimentella modeller av IBD. Dessa har gett nya system för att dissekera sambandet mellan enteriska bakteriearter inklusive deras virulensfaktorer, och värd känslighet faktorer som kan förbättra vår förståelse av IBD-associerad fibros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Ingrid Barta för histologi tjänster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 ml round bottom safe lock tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| Large-Orifice Pipet Tips | Fisher | 2707134 | |
| 2 mL megablock plates | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| Gavage needles | FST | 18061-22 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Mixer mill | Retsch | MM |
References
- Danese, S., Fiocchi, C.
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome. Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).
- Ogura, Y., et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease. Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Rivas, M. A., et al. Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease. Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).
- Rioux, J. D., et al. Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis. Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).
- Uhlig, H. H., Powrie, F. Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease. European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Grassl, G. A., Finlay, B. B.
- Barthel, M., et al. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance. Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).
- Valdez, Y., et al. Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice. Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).
- Lo, B. C., et al. The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease. Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).
- Burke, J. P., et al.
- Hogan, B. L., et al. Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function. Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).
- Fiocchi, C., Lund, P. K. Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).
- Rieder, F., Fiocchi, C. Intestinal fibrosis in IBD—a dynamic, multifactorial process. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).
- Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. Surgery for adult Crohn's disease: what is the actual risk? Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).
- Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
- Lo, B. C., et al. IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection. Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).
- Fichtner-Feigl, S., et al. Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis. Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).
- Fichtner-Feigl, S., et al. IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis. Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).
- Johnson, L. A., et al. Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a "Top-Down" approach to intestinal fibrosis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).
- Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
- Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. Persistent infection with Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis. Nature Communications. 4, 1957 (2013).
- Imai, J., et al. Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. , (2019).
