Summary
В пробирке модели коронарного ангиогенеза могут быть использованы для открытия клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза. В пробирке эксплантные культуры синусовых веносов и эндокардийных тканей демонстрируют устойчивый рост в ответ на VEGF-A и демонстрируют аналогичную схему выражения COUP-TFII, как in vivo.
Abstract
Здесь мы описываем анализ культуры in vitro для изучения коронарного ангиогенеза. Коронарные сосуды питают сердечную мышцу и имеют клиническое значение. Дефекты в этих сосудах представляют серьезную опасность для здоровья, например, при атеросклерозе, что может привести к инфарктам миокарда и сердечной недостаточности у пациентов. Следовательно, ишемическая болезнь сердца является одной из ведущих причин смерти во всем мире. Несмотря на его клиническую важность, относительно незначительный прогресс был достигнут в том, как регенерировать поврежденные коронарные артерии. Тем не менее, в последнее время был достигнут прогресс в понимании клеточного происхождения и путей дифференциации развития коронарных судов. Появление инструментов и технологий, которые позволяют исследователям флуоресцентно маркировать клетки-прародителя, следить за их судьбой и визуализировать потомство in vivo сыграли важную роль в понимании развития коронарных сосудов. Исследования In vivo являются ценными, но имеют ограничения с точки зрения скорости, доступности и гибкости в экспериментальном дизайне. Кроме того, точные модели в пробирке коронарного ангиогенеза могут обойти эти ограничения и позволить исследователям быстро и гибко изопрашивать важные биологические вопросы. Отсутствие соответствующих систем моделей in vitro, возможно, препятствовало прогрессу в понимании клеточных и молекулярных механизмов роста коронарных сосудов. Здесь мы описываем систему культуры in vitro для выращивания коронарных сосудов из синусового веноза (SV) и эндокардия (Endo), двух тканей-прародителей, из которых возникают многие коронарные сосуды. Мы также подтвердили, что культуры точно резюмируют некоторые из известных механизмов in vivo. Например, мы показываем, что ангиогенные ростки в культуре от SV downregulate COUP-TFII выражение аналогично тому, что наблюдается in vivo. Кроме того, мы показываем, что VEGF-A, известный ангиогенный фактор in vivo, активно стимулирует ангиогенез как из Культуры СВ, так и из эндо. В совокупности мы разработали точную модель культуры in vitro для изучения коронарного ангиогенеза.
Introduction
Кровеносные сосуды сердца обычно называют коронарных сосудов. Эти сосуды состоят из артерий, вен и капилляров. Во время разработки сначала устанавливаются высокоразветвленные капилляры, которые затем переделываютв коронарные артерии и вены1,2,3,4. Эти первоначальные капилляры построены из эндотелиальных клеток-прародителей, найденных в проэпикардии, синусвенных веносах (SV) и эндокардии (Эндо)тканей 1,6,7,8. SV является органом притока эмбрионального сердца и Эндо является внутренней подкладкой просвет сердца. Эндотелиальные клетки-прародители, найденные в SV и Endo, создают большинство коронарных сосуд, в то время как проэпикардий способствует относительно небольшой его части2. Процесс, при котором капиллярная сеть коронарных сосудов растет в сердце из уже существующих клеток-предшественников, называется коронарным ангиогенезом. Ишемическая болезнь сердца является одной из ведущих причин смерти во всем мире, и все же эффективного лечения этого заболевания не хватает. Понимание подробных клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза может быть полезно при разработке новых и эффективных методов лечения для ремонта и регенерации поврежденных коронарных артерий.
В последнее время резкое понимание того, как развиваются коронарные сосуды, частично было достигнуто за счет разработки новых инструментов и технологий. В частности, маркировка линии in vivo и передовые технологии визуализации были очень полезны при раскрытии клеточного происхождения и путей дифференциации коронарных сосудов9,10,11,12. Несмотря на преимущества этих инструментов in vivo, существуют ограничения с точки зрения скорости, гибкости и доступности. Таким образом, надежные системы моделей in vitro могут дополнять системы in vivo для выяснения клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза высокой пропускной способностью.
Здесь мы описываем в пробирке модель коронарного ангиогенеза. Мы разработали систему культуры эксплантирования в пробирке для выращивания коронарных сосудов из двух тканей-прародителей, SV и Endo. С помощью этой модели мы показываем, что в экстракорпоральной ткани explant культур расти коронарных ростков сосудов, когда стимулируется средой роста. Кроме того, культуры эксплантов быстро растут по сравнению с контролем, когда стимулируется сосудистым эндотелиальным фактором роста A (VEGF-A), очень мощным ангиогенным белком. Кроме того, мы обнаружили, что ангиогенные ростки из культуры SV проходят венозную дедифференицицию (потеря экспрессии COUP-TFII), механизм, похожий на SV ангиогенез in vivo1. Эти данные свидетельствуют о том, что система культуры экстракорпорального экспланта точно восстанавливает ангиогенные события, происходящие в vivo. В совокупности, в пробирке модели ангиогенеза, которые описаны здесь идеально подходят для зондирования клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза в высокой пропускной способностью и доступным способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование всех животных в этом протоколе следовало руководящим принципам Комитета по институциональному уходу и использованию животных (IACUC).
1. Создание мышь заводчиков и обнаружение вагинальных втыковок для приурочен беременности
- Настроили клетку для разведения мышей с дикими самцами и самками мышей. Убедитесь, что возраст размножения мышей составляет от 6 до 8 недель. Навязаните либо пару (1 мужчина и 1 женщина), либо в трио (1 мужчина и 2 женщины) для разведения.
- Проверьте вагинальный штепсельную вилку на следующее утро. Используйте угловой металлический зонд для обнаружения глубокой вилки, вставив его в вагинальное отверстие. Назначить утро положительной вагинальной вилки, чтобы быть эмбриональным днем 0.5 (e0.5).
ПРИМЕЧАНИЕ: вагинальный штепсельная вилка может быть либо поверхностной (которая легко видна, см. Рисунок 1)или глубоко (что не легко видно). Наличие глубокой вилки будет блокировать полную вставку зонда в то время как отсутствие вилки позволит полной вставки без сопротивления. - Поддерживайте приуроченную беременность до тех пор, пока эмбрионы не достигнут e11.5, при котором они будут собраны. Чтобы подтвердить беременность перед сбором эмбрионов, запишите вес самок мышей между e7.5 и e11.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневное увеличение веса матери будет означать успешную беременность, в то время как никакие изменения в весе будет означать неудавшуюся беременность.
2. Сбор эмбрионов у беременных мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что следующее оборудование и реагенты: CO2 эвтаназии камеры, 70% этанола, бумажные полотенца, регулярные щипцы, тонкие щипцы, ножницы, 1x стерильный фосфат буферный солен (PBS), 10 см стерильных блюд Петри, контейнер со льдом, перфорированная ложка, дефиле стереомикроскоп.
- Поместите e11.5 беременной мыши в чистой камере эвтаназии CO2, чтобы пожертвовать ею. Закройте крышку камеры, чтобы мышь не сбегала.
- После того, как мышь закреплена в камере эвтаназии, включите CO2. Убедитесь в том, чтобы регулировать скорость потока CO2 на рекомендации IACUC (т.е. 10-30% перемещения в минуту). После того, как мышь полностью усыпщена, выполните вывих шейки матки, чтобы обеспечить смерть.
- Спрей мыши с 70% этанола. Поднимите кожу над животом с помощью щипков, сделать небольшой разрез с помощью ножниц и расширить разрез боковой. Увеличить разрез перед диафрагмой и подвергать маточный рог, содержащий эмбрионы(рисунок 2).
- Вытяните строку эмбрионов (маточный рог и эмбрионы), схватив матку и разрезая его бесплатно. Поместите строку эмбрионов в ледяной стерильной 1x PBS.
- Рассекать отдельные эмбрионы из рога матки, отслаивая мышцы матки, желток и амнион один за одним(Рисунок 3A-F) под стереомикроскопом. Перенесите очищенные эмбрионы перфорированной ложкой в чашку Петри, содержащую стерильные 1x PBS на льду. Убедитесь в том, чтобы сохранить эмбрионы холодными.
3. Изолирование сердец от e11.5 Эмбрионы
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что иметь следующее оборудование и реагенты: регулярные щипцы, тонкие щипцы, 1x стерильные PBS, 10 см стерильной чашкой Петри, 6 см стерильной чашкой Петри, контейнер со льдом, перфорированная ложка, рассечение стереомикроскопкопа.
- Настройка нового блюда Петри с ледяной стерильной 1x PBS под стереомикроскоп. Перенесите эмбрион со ступени 2.5 в чашку Петри, чтобы вскрыть сердце.
- Удалить голову эмбриона с помощью щипц. Во-первых, сожмите голову между щипками одной рукой, а затем снимите голову, соскребая ее с другой стороны, используя закрытые щипц(рисунок 4A-C).
- После удаления головы, сориентировать эмбрион с его брюшной стороной вверх, держа эмбрион с щипками на животе с одной стороны (Рисунок 4D).
- С другой стороны, открыть грудную стенку эмбриона, сначала сделав небольшой разрез в груди немного выше диафрагмы с помощью тонких щипц. Затем, увеличить разрез очень осторожно, вставив закрытые щипцы и разрывая грудную стенку, открывщив щипцы. Убедитесь в том, чтобы не тяги слишком глубоко, которые могут повредить сердце. С помощью щипцы, держать грудную стенку широко открытыми, чтобы разоблачить сердце и легкие в грудной полости(Рисунок 4E).
- Используя тонкие щипцы, осторожно двигайте сердце перед (90 ") и разоблачить дорсальную аорту/вену. Вытяните сердце / легкие передним путем захвата дорсальной аорты / вены у основания сердца (Рисунок 4F-H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте нежны, вытаскивая сердце / легкие, чтобы избежать разрыва SV, который находится на стороне доза. - Промыть сердце / легкие с холодной 1x PBS для удаления клеток крови.
- Повторите шаги 3.1-3.6 для удаления сердца/легких из оставшихся эмбрионов. Убедитесь в том, чтобы держать изолированное сердце / легкие на льду.
4. Изолирование SVs и ventricles от e11.5 Эмбриональные сердца мыши
- Поместите чашку Петри с сердцем / легкие от шага 3.7 под стереомикроскоп, чтобы изолировать SVs и целые желудочки. Очистите прикрепленные доли легких один за 1 от их корня с помощью тонких щипцы.
- Оснаните сердце на его стороне доза и удалите предсердие и прилегающую ткань, которая окружает SV переднюю, не разрывая SV. Удалите левую и правую притязания из сердца, держа на своей базе и соскабливая его с помощью тонких щипц(рисунок 5B). Удалите прилегающую ткань, окружающую СВ, используя аналогичную технику(рисунок 5C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что правое предсердие прилагается к SV, так что будьте осторожны, чтобы только удалить предсердие. - Чтобы изолировать SV, сначала сориентируйте сердце с его содовой стороной вверх (потому что SV находится на стороне дорастиченного) и держите сердце все еще в этом положении, мягко держа сердце в желудочках с щиптом с щипцыми.
ПРИМЕЧАНИЕ: SV является органом притока эмбрионального сердца, который находится между притязаниями на донской стороне сердца. - Удалите SV, тщательно снимая его с сердца, где он прилагается или удерживая SV у основания его вложения с тонкими щипками и соскабливания его с закрытыми щипками(Рисунок 5D, E).
- Перенесите изолированный SV в новую 6-сантиметровую чашку Петри с ледяной стерильной 1x PBS на льду с помощью стерильной передачи пипетки и обозначьте блюдо Петри как SV.
- Чтобы изолировать целые желудочки, удалите отток тракта (аорты и легочного ствола) из сердца после удаления СВ(рисунок 5F,G).
- Перенесите все желудочки в новую 6-сантиметровую чашку Петри, содержащую стерильные 1x PBS на льду с помощью стерильной передаваемых пипетки и обозначьте блюдо Петри как желудочки. Держите изолированные SV и желудочки на льду.
- Повторите шаги 4.1-4.7 для изоляции SVs и желудочков от оставшихся сердец.
5. Установка пластин культуры тканей с вставками и внеклеточным матричным покрытием
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что иметь следующее оборудование и реагенты: коммерческие внеклеточные матричные решения (ECM; например, Matrigel), 8,0 м м полиэтилен терефталат (ПЭТ) культуры вставок, 24 хорошо пластины, 37 КК, 5% CO2 инкубатора.
- Пусть решение ECM оттаивает на льду. Держите решение ECM на льду, чтобы избежать затвердевания.
- Поместите ПЭТ мембраны культуры вставки (пор размерю 8,0 мкм, область фильтрации 0,3 см2, диаметр фильтра 6,5 мм) в колодцы не-ткани культуры обработаны 24 хорошо пластин. Пометьте пластины как SV или желудочки для SV или эндокардиальный ангиогенез анализы, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка вставки в отдельные пластины для SV и желудочков при выполнении обеих культур одновременно. Убедитесь в том, чтобы создать достаточное количество скважин для всех экспериментальных образцов и элементов управления. - После того, как раствор ECM размораживаются, немедленно разбавить ECM 1:2 в предварительно охлажденной базальной среде (т.е. базальной среде EBM-2, см. Таблица материалов)до достаточного объема (100 л/вставить х количество вставок).
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если есть шесть вставок, то общий объем будет 100 л х 6 600 л. Добавить 200 л ECM в 400 л базальной среды. - Пальто вставки с 100 л свежеразбавленного ECM, добавив его непосредственно на верхней части мембраны. Инкубировать пластину при 37 градусах По Цельсию в течение по крайней мере 30 минут, чтобы позволить ECM затвердеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть выполнено под ламинаром ткани потока ткани капюшон, чтобы избежать загрязнения.
6. SVs и целые культуры ventricles
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что иметь следующее оборудование и реагенты: 70% этанола, передачи пипетки, стереомикроскоп, щипцы, ламинар ткани ткани ткани капюшон, микрососудистые эндотелиальные клетки дополнение комплекта (Таблица материалов), базальная среда, 1x стерильные PBS). На рисунке 6 показан рабочий процесс культуры SV и желудочков.
- Оттепель из содержимого дополнения комплект на льду. Подготовка полной среде, добавив все содержимое комплекта дополнения в 500 мл базальной среде под сертифицированным ламинаром ткани ткани капота. Смешайте средний хорошо и распространять в 50 мл aliquots.
- Стерилизовать основание стереомикроскопа и прилегающую рабочую зону с помощью 70% этанола.
- Получить пластины культуры ткани от шага 5.4. С помощью переноса пипетки, тщательно переложить экстенсы со ступени 4.7 на верхней части вставки мембраны. Под стереомикроскопом и с помощью чистых щипцы, положение explants в центре вставки, чтобы они не застряли в углу вставки или прилагается к боковых стен.
- После того, как экспланты помещаются и по центру на вставках, тщательно удалите любые дополнительные PBS из вставок и закройте крышки пластин.
- Под ламинаром ткани потока ткани капота, добавить 100 злител до конца среды на верхней части вставок и 200 Зл в колодцы для культуры explants на воздушно-жидком интерфейсе так, что базальная поверхность вставки находится в контакте со средой , но верхняя поверхность подвергается воздействию воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы настроить громкость для получения воздухожидкого интерфейса при использовании различных размеров вставки / хорошо пластин. - Добавьте 300 л PBS в неиспользованные скважины 24 скважины и накройте крышкой. Инкубировать пластину в 37 градусов По Цельсию, 5% CO2 инкубатор, и расти культур в течение 5 дней.
- В последующие дни, регулярно наблюдать культур под перевернутым световым микроскопом для оценки состояния explant культур. Убедитесь, что explants экспонат сократительных избиения и что все explants прикреплены к нижней части мембраны встроенных с ECM. Принять к сведению любые плавающие explants.
ПРИМЕЧАНИЕ: Периодическое сокращение explants указывает, что они живы. Плавающие экспланты должны быть исключены из анализа. - После оценки культурного статуса, положить культурную плиту обратно в инкубатор и продолжать расти культуры до 5 дней.
7. Лечение культур с помощью VEGF-A (Позитивный контроль)
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что есть следующее оборудование и реагенты: ламинарный поток ткани культуры капот, 1x PBS, базальная среда no 1% сыворотки крупного рогатого скота (FBS), базальная среда - VEGF-A, пипетки, и пипетки советы.
- Подготовьте базальную среду 1% FBS и базальную среду - VEGF-A.
- Для подготовки базальной среды 1% FBS, сначала определить количество контрольных скважин, необходимых. Например, если есть три контрольные скважины, то 300 Л/уэлл х 3 х 900 Л - это общий объем, необходимый. Добавьте 9 л FBS в 891 Л базальной среды, чтобы сделать базальную среду 1% FBS.
- Для подготовки базального среднего - VEGF-A сначала определите общее количество скважин, нуждающихся в среде VEGF-A. Если есть три скважины, то 300 Л/хорошо х 3 х 900 л - это общий объем и 50 нг/хорошо х 3 и 150 нг VEGF-A. Добавьте 150 нг VEGF-A в 900 л базальной среды, чтобы сделать базальную среду veGF-A.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите это решение в большем объеме, чем рассчитано, чтобы застраховать достаточное количество меньших aliquots для каждого эксперимента.
- На второй день удалите носители из обеих камер (вставки и колодцы). Вымойте культуры с 300 зл 1x PBS, добавив 100 зл. Твердо закружить пластины несколько раз и удалить PBS.
- Добавьте 300 л базальной среды и 1% FBS (100 л в вставку и 200 л в скважины), чтобы голодать культур в течение 24 ч.
- На 3-й день, после голодания, добавляйте 300 л базальной среды и 1% FBS (100 л в вставку и 200 л в скважины) в контрольные скважины и базальную среду - VEGF-A (50 нг/хорошо) в очистные скважины, соответственно.
- После лечения продолжайте выращивать культуры в инкубаторе.
8. Фиксация и иммуностоирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что следующее оборудование и реагенты: 4% параформальдегид (PFA), 1x PBS, первичные и вторичные антитела, шейкер, 0,5% неионический сурфактант в PBS (PBT).
- На шестой день культивирования, удалить средних и мыть культур ы с 1x PBS при комнатной температуре (RT).
- Исправьте культуры, добавив 200 qL 4% раствора PFA в скважины и 100 qL в вставки. Исправьте культуры в 4 кК в течение 20 минут во время качания.
- После 20 мин фиксации, удалить PFA из культур в дым капота и мыть культуры с 1x PBS, добавив 200 кЛ в колодцы и 100 кл в вставки.
- Повторите моет 3x, 10 минут каждый, в то время как качалки. Затем приступайте к проведению иммунодефицита.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги мыть выполняются на скамейке на RT.
- Разбавить первичные антитела (анти-VE-Cadherin, анти-ERG 1/2/3) в блокирующем растворе (5% сыворотки осла, 0,5% ПБТ). Добавьте 300 л первичного раствора антитела (200 л в нижних колодцах и 100 л в вставки). Инкубировать культуры в первичных антител ночь на 4 градуса по Цельсию во время качания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-VE-Cadherin используется для обозначения эндотелиальной клеточной мембраны и анти-ERG 1/2/3 используется для обозначения эндотелиальных ядер клеток для того, чтобы визуализировать ангиогенные ростки эндотелиальных клеток. - На следующий день, мыть и рок культуры пластин 10x в 0,5% PBT, изменение PBT каждые 10 минут.
- Разбавить вторичные антитела (осел анти-крыса Alexa Fluor 488 и осла анти-кролик Alexa Fluor 555) в блокирующем растворе. Добавьте 300 qL вторичных антител, как в шаге 8.2 и инкубировать культуры на ночь при 4 градусах Цельсия во время качания. На следующий день, мыть вторичные антитела 10x в ПБТ, изменение ПБТ каждые 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вымойте минимум 10 x, но больше моет лучше. После того, как мойки завершены, культуры могут храниться с 1x PBS, пока они не установлены на слайды.
9. Монтаж культур на слайды, изображения и анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, убедитесь, что иметь следующее оборудование и реагенты: тонкие щипцы, слайды, монтаж среды с 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), крышки, и конфокальный микроскоп. После вторичного окрашивания антител, смонтировать культуры на слайды для визуализации, используя следующие шаги.
- Очистите от мембраны тщательно от вставки с помощью тонких щипцы и передать его на слайды, поставив мембраны стороны вниз и размещения explant культур вверх. Поместите образцы репликации в те же слайды и пометьте слайды как контроль или VEGF-A. Добавьте несколько капель монтажной среды с DAPI непосредственно на мембрану и накройте слайды крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы избежать пузырьков воздуха при размещении крышки. - Уплотнение края слайдов с четким лаком для ногтей и дайте высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут храниться в -20 градусов по Цельсию для длительного хранения. - Слайды изображения с помощью конфокального микроскопа.
- Выполните анализ для измерения длины ангиогенных наростов. Количественное огениогенное увеличение длины роста путем измерения расстояния эндотелиальных клеток (Ve-Cadherin/ERG 1/2/3") простирается от внутренней границы ERG 1/2/3 "клеток в желудочка холестерол культур и из центра С. explants в SV культур.
- Для выполнения количественной оценки с помощью FIJI/ImageJ, сначала скачать программное обеспечение FIJI.
- Откройте файлы изображений в FIJI: перейдите в файл Открыто (ru) Фолдер Файлимя Открыто.
- Перейти к анализу Набор измерений Выберите периметр.
- Выберите инструмент «Прямая линия» из основного окна.
- Нарисуйте линию по всей длине ростка, как это предлагается в шаге 9.4.
- Перейти к анализу Мера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения длины отображаются в новом окне. - Выполните количественную оценку в изображениях, которые представляют по крайней мере три случайно выбранных поля зрения. Усреднете измерения длины ростка и сообщите о них как о среднем и стандартном отклонении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одна из самых ярких особенностей SV ангиогенез in vivo является то, что она следует определенным образом и включает в себя ячейки обезличения и реразличения событий, которые происходят в стереотипные времена и позиции1. По мере того как начальные клетки SV растут на желудочк сердца, они останавливают производить венозные маркеры such as COUP-TFII (Рисунок 7). Впоследствии коронарные ростки принимают два пути миграции, либо над поверхностью сердца, либо глубоко внутри миокарда. Поверхностные сосуды в конечном итоге становятся венами, в то время как вторгшиеся сосуды становятся артериями и капиллярами1,6,7. Это различие сохраняется по мере роста сердца и расширения коронарных сосуд.
Для облегчения открытия молекулярных основ коронарного развития, мы разработали в пробирке модель прорастания SV, которые могут быть использованы для потери функции и усиления функции экспериментов. SV ткани из эмбриональных сердца мыши вскрыты, помещены на верхней части разбавленной ECM (который является коммерчески доступным, см. Таблица материалов),и поддерживается в воздухожидком интерфейсе в эндотелиальной среде роста клеток. Миокард SV продолжает бить на протяжении всего периода культуры. После 2 дней в культуре, эпикардиальные клетки, которые выстраиваются ткани оставить explant и мигрировать на матрицу. После 5 дней, SV эндотелиальных клеток прорастают и мигрируют на эпикардиальной ткани(Рисунок 8A, черные наконечники стрел). В совокупности этот процесс резюмирует ангиогенные аспекты коронарного развития.
Культурные ростки С. Также подвергаются венозной дедифференциации. Как и в эмбриональном сердце, выражение COUP-TFII уменьшается по мере того, как сосуды мигрируют от СВ(рисунок 8B, по сравнению с рисунком 7). Контроль сосудов, таких как пуповина или желток мешок артерий и вен может производить прорастающих сосудов. Тем не менее, они меньше в количестве и короче по длине и не меняют их артериальной или венозной идентичности (не показано). Таким образом, венозное перепрограммирование характерно для прорастания СВ, а не является общей особенностью ангиогенеза или реакцией на компоненты ECM. Эти данные также указывают на то, что типы клеток, содержащиеся в самом СВ, необходимы и достаточны для того, чтобы вызвать различение.
Хорошо известно, что сосудистый эндотелиальный фактор роста А (VEGF-A) является мощным индуктором ангиогенеза7,13,14,15,16,17,18. Предыдущие исследования показали, что миокард VEGF-A стимулирует эндокардиальный ангиогенез для выращивания коронарных сосудов7. Кроме того, коронарные эндотелиальные клетки были показаны, чтобы выразить VEGF-A рецептор, и SV полученных коронарных сосудов в миокарде может расти в ответ на VEGF-A in vivo2. Чтобы показать, что наша модель коронарного ангиогенеза в пробирке верно реагирует на VEGF-A, мы стимулировали культуры СВ и Эндо с помощью VEGF-A. Как и ожидалось, наши результаты показали, что и SV, и Endo очень чутко реагируют на VEGF-A. Культуры, стимулируемые VEGF-A, показывают повышенный рост ангиогенных ростков как по плотности, так и подлине (рисунок 9A,C). SV культур стимулируется VEGF-A показать почти 3-кратное увеличение длины ростка по сравнению с контролем(Рисунок 9B). Эти результаты показывают, что эндотелиальные ростки из SV и Endo реагируют на аналогичные сигналы, которые известны in vivo.
В совокупности наши данные свидетельствуют о том, что эти экстракорпоральные экзат-культуры имеют аналогичные клеточные и молекулярные события, происходящие во время коронарного развития in vivo, включая венозную дедифференциацию и устойчивый рост в ответ на стимуляцию VEGF-A. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что эти модели культуры explant полезны для изучения коронарного ангиогенеза in vitro.
Рисунок 1: Идентификация вагинальной вилки. (A) Вагинальная вилка (белое пятно). (B) Увеличенный вид коробочного региона, включая вагинальную вилку (указано стрелой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Доступ к зародышевой строке в матке беременной мыши. Усыпленная беременная мышь расположена с ее брюшной поверхностью и распыляется с 70% этанола для влажной кожи для вскрытия. Кожа подтягивается в области таза с помощью щипков и небольшой разрез производится. Разрез продлевается слажено. Дополнительный разрез делается перед диафрагмой. В матке видна вереница эмбрионов (показанная наконечниками стрел). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Рассечение и удаление эмбрионов из матки. (A) Изображение, показывающее матку, содержащую строку эмбрионов. Мембрана на стороне вдовства эмбриона (напротив той стороны, где расположена плацента) снимается. (B) Эмбрион в желтком мешке становится видимым после пилинг от матки мембраны. (C,D) Эмбрион, прикрепленный к плаценте с пуповиной, виден после слезсы от желточного мешка. Амнион снимается, если все еще присутствует. (E) Изображение, показывающее эмбрион, прикрепленный к плаценте пуповиной. (F) Изображение, показывающее отсоединение эмбриона от плаценты, потянув за пуповину (Umb. Корд) с помощью щипков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Удаление сердца/ легких срывать из эмбрионов. (A, B) Голова удаляется из эмбриона, захватывая шею и соскребая ее. (C) Изображение, показывающее удаление головы из тела. (D) Правильное позиционирование эмбриона для вскрытия сердца. Эмбрион расположен с брюшной стороной вверх, чтобы иметь легкий доступ к грудной полости для удаления сердца. Как только эмбрион позиционируется как показано в D, грудная полость открывается щипками. (E) Изображение, показывающее открытую грудную полость с сердцем, выставленным на его брюшной стороне. (F) Чтобы удалить сердце, не повреждая SV, сердце переворачивается передним, и дорсальная аорта становится видимым. (G) Изображение, показывающее положение у основания сердца / легких, где дорсальная аорта / вены захваченщиц с щипками и сердце / легкие срывается вытащил передним. (H) Изображение показывает e11.5 сердце / легкие срывать удалены из эмбриона. V. сердце и брюшное сердце; d. сердце и рзальное сердце; d. аорта и дорсальная аорта; Лос-Анджелес - левое атриум; РА - правое предсердие; LV - левый желудочек; Р.В. и правый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Изоляция SV и желудочков из эмбриональных сердец. (A) Изображение, показывающее торсальный вид изолированного сердца/легких, срывающих сярот из эмбриона e11.5. Местонахождение С.В. в сердце указано. (B) Изображение сердца после легких почки были удалены. (C) Атрия и прилегающих тканей, окружающих SV удаляются, выявление аорты. Расположение SV помечено. (D) Изображение, показывающее удаление SV. Используя щипцы, SV сжат на своей базе и соскребается от сердца. (E) SV удалены из сердца показано вместе с остальными ткани сердца. Аорта и легочной ствол (ПТ), коллективно называемый отток тракта (OFT), становятся видимыми в сердце после SV удаляется. SV будет использоваться для культуры in vitro, как описано на рисунке 6 (левая панель). (F) Позиция OFT, которая будет расчленена, отмечена пунктирной белой линией. (G) Аорта/ПТ (отток тракта) удаляется из желудочков путем вскрытия в положении, показанном в панели F. Остальные желудочки без OFT используются для культур желудочков, как показано на рисунке 6 (правая панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Схема, показывающая рабочий процесс культуры СВ и желудочков. Слева: Процедура для культуры СВ. Во-первых, SV удаляется из e11.5 сердца и помещается на культурную вставку. Вставка содержит пористую мембрану внизу (8 мкм пор) и покрыта фактором роста, уменьшенным ECM. Вставки помещаются в колодцы 24 колодца. Средний добавляется как в нижней, так и в верхней камере, не покрывая эксплант. Культура выращивается в течение 5 дней. Через 5 дней мембрана удаляется из вставки и устанавливается на слайды для визуализации и анализа. Справа: Процедура культуры желудочка. Ventricles без SV, предсердий и OFT удаляются из e11.5 сердца и культивируются, как описано выше для SV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: ВЫРАЖЕНИЕ COUP-TFII теряется в ростках SV in vivo. (A) Дорсальный вид e11.5 сердец. Конфокальный образ эндотелиального маркера (красный), который маркирует синусовый венос (SV), коронарные ростки (cs, пунктирная линия) и эндокардий (эндо) подкладка просвет сердца. (B) Венозный производитель COUP-TFII (зеленый), коэффициент транскрипции вен (trx), выраженный в SV постепенно теряется, как ростки оставить SV и расти на желудочек. Справа: Более высокое увеличение коронарного ростка, показанное в коробочном регионе панели A. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: In vitro модели венозной идентичности и перепрограммирования. (A) Брайтфилд изображение культивации Ткани SV. Сосудистые ростки (наконечники стрел) вырастают из оригинального экспланта (черная пунктирная линия) над субстратом ECM. (B) Иммунофлуоресценция культур SV помечены антителами, которые отмечают эндотелиальной поверхности клеток (VE-Cadherin), эндотелиальных ядер клеток (ERG 1/2/3), и вены и эпикардиальных ядер (COUP-TFII). Ядра являются положительными как для ERG 1/2/3 и COUP-TFII на SV, но ERG 1/2/3 только в ростках мигрируют над ECM. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: SV и эндокардиум отвечают VEGF-A in vitro. (A) Конфокальный образ 5-дневного управления и VEGF-A лечение SV explant культуры. Эндотелиальные клетки иммунозапятнаны VE-кадерин (зеленый), эндотелиальных ядер клеток окрашенных ERG 1'2/3 (красные) антитела, и ядра клеток с DAPI (синий). (B) Ангиогенный рост эндотелиальных клеток количественно путем измерения длины расширения ростка (расстояние мигрировали ERG 1'2/3 "эндотелиальных клеток от экспланта, указывается белыми сплошными линиями в нижних панелях (A). (C) Конфокальный образ 5-дневной культуры контроля и VEGF-А обработанных желудочков. Эндотелиальные клетки иммунозапятнаны VE-кадерин (зеленый) и эндотелиальных клеточных ядер окрашены ERG 1'2/3 (синий) антител. Точки являются индивидуальными измерениями, а бары ошибок являются средними - SD. Шкала бар 200 мкм (A,C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Некоторые из наиболее важных шагов для успешного выращивания коронарных сосудов из тканей SV и Endo-прародителя: 1) Правильное выявление и изоляция ткани СВ для культуры СВ; 2) использование желудочков эмбрионов в возрасте от e11-11.5 для точной культуры эндо; 3) поддержание стерильных состояний в течение всего периода вскрытия и поддержание тканей холодными во все времена; и 4) сохранение эксплансов, прикрепленных к мембране с покрытием ECM, чтобы избежать плавающей ткани в среде.
Во-первых, изоляция SV ткани может быть сложной задачей. Важно понимать, что SV лежит на стороне сердца между левой и правой предсердий скрыты в легочных лобули. Поэтому трудно отделить и изолировать. Вместо этого, все сердце / легкие срывать должны быть извлечены в первую очередь. SV затем изолированы от срыва путем тщательного удаления легочных лобул и очистки смежных тканей с помощью тонких щипцов. Кроме того, нужно быть очень осторожным при очистке смежных тканей, чтобы не потерять SV.
Во-вторых, для точного эндокардиального ангиогенеза важно культурировать желудочки из эмбрионов не старше e11.5. В e12.5 и более старых эмбрионах коронарные клетки Из СВ превращаются в значительную долю желудочков. Таким образом, коронарные сосуды, которые растут из старых желудочков могут состоять из СВ- и Эндо полученных коронарных сосудов1,2,10,19,20. По этой причине, чтобы точно проверить рост коронарных сосудов от Эндо, имеет решающее значение для культуры желудочков (минус SV и оттока тракта) от e11.5 эмбрионов20. Кроме того, SV является относительно большим и легче изолировать на e11.5.
В-третьих, поскольку протокол включает в себя значительный объем работы за пределами капота культуры тканей, крайне важно поддерживать стерильную рабочую среду. Важно стерилизовать инструменты вскрытия (щипцы, ножницы и т.д.) и пластины культуры тканей и избегать контакта с нестерильными областями в любое время. Важно распылить рабочую зону и рассеить область с 70% этанола. Чтобы избежать загрязнения, важно быстро выполнить процедуру вскрытия и свести к минимуму работу вне капота культуры тканей.
В-четвертых, для получения здоровых культур explant, важно, чтобы экспланты остаются привязанными к основанию мембраны во все времена. Плавающие экспланты в среде следует избегать, чтобы успешно расти explant культур. Чтобы избежать плавания, очень важно поддерживать воздушно-жидкий интерфейс, где базальная поверхность вставки находится в контакте со средой, но верхняя поверхность подвергается воздействию воздуха. Такой интерфейс получается, когда эксплант достаточно покрыт средой, но не полностью погружен в воду. Важно ежедневно следить за объемом среды, так как объем может быть потерян для испарения. Чтобы предотвратить это, культурная плита может быть увлажнена путем добавления PBS в неиспользованные колодцы культурных плит.
Подобные культуры explant SV и Endo описаны в другом месте20. В этих методах, explants были культивированы непосредственно в колодцы тканевых плит культуры, что ограничивает высокое разрешение конфокальной визуализации. Изображения, полученные в этой обстановке, являются относительно низкими по качеству по сравнению с предложенным здесь методом, ограничивающим подробный микроскопический анализ. Чтобы обойти это, мы использовали культурные вставки, из которых мембраны, содержащие культуру, могут быть сняты и установлены на стеклянные горки для визуализации. Это позволяет с высоким разрешением конфокальной визуализации, где клеточные детали, такие как шаблоны выражения и морфология могут быть просмотрены. Кроме того, культивирование непосредственно на пластинах требует отдельного протокола окрашивания для DAPI или других панъядерных маркеров окрашивания. Этот протокол не требует отдельных этапов окрашивания, поскольку слайды могут быть установлены с монтажной средой, содержащей DAPI. Кроме того, установка на слайдах позволяет долговременно хранить без флуоресцентного выцветания, в то время как культуры, хранящиеся в скважинах с жидкой средой, приведут к быстрому выцветанию и не поддаются долгосрочному хранению и визуализации.
Описанные здесь модели культуры in vitro идеально подходят для изучения клеточных и молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза с высокой пропускной способностью и доступной помощью. Эта система in vitro может быть использована для проверки потенциальных лекарств или молекулярных целей для оценки их влияния на коронарный ангиогенез. Кроме того, эта система может также использоваться для изучения усиления функции и потери функции различных генов для их автономной функции в коронарном ангиогенезе. Мы заметили, что коронарные ростки из SV следовали эпикардиальной миграции в наших культурах in vitro, предлагая важное взаимодействие между коронарными эндотелиальными клетками и эпикардиальными клетками. Хорошо известно, что эпикардий является богатым источником факторов роста коронарного ангиогенеза из СВ. Например, эпикардиальные факторы роста, такие как VEGF-C и ELABELA, ранее были показаны для регулирования SV-производных коронарного ангиогенеза2,19. Мы можем использовать эту систему культуры СВ для дальнейшего изучения взаимодействия эпикардия и коронарных эндотелиальных клеток и выявления новых молекулярных путей коронарного ангиогенеза, полученных из эпикардиального происхождения. Кроме того, наши данные in vivo свидетельствуют о том, что гипоксия миокарда может быть вовлечена в эндокардиальный ангиогенез19. Наша система культуры in vitro предлагает отличную модель для изучения роли гипоксии в эндокардиальном ангиогенезе путем инкубации культур в гипоксических или нормоксических условиях. Это трудные эксперименты для проведения in vivo, потому что это требует беременной мыши, чтобы быть помещены в контролируемой гипоксической камере. Исходя из нашего собственного опыта, очень сложно получить последовательные и надежные результаты экспериментов in vivo. Таким образом, наша в ипрутомодельная модель коронарного ангиогенеза обеспечивает надежную систему для изучения широкого спектра вопросов, связанных с клеточной и молекулярной биологией коронарного ангиогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят сотрудников лаборатории Шарма за создание благоприятной исследовательской среды. Мы хотели бы выразить особое спасибо Диане (Ди) Р. Хоффман, который поддерживает и заботится о нашей колонии мыши. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Филипа Смальдино и Каролин Ванн за тщательное коррективо рукописи и предоставление полезных комментариев. Эта работа была поддержана за счет средств из Балла государственный университет проректор управления и кафедры биологии в B.S., Индиана Академия наук старший научно-исследовательский грант средств B.S, и NIH (RO1-HL128503) и Нью-йоркской стволовой клетки Фонд средств К.Р.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
