Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Extraktion von murinen hirnebralen Pericyten. Basierend auf einer antibiotikafreien Anreicherungs-orientierten Pericyt-Extraktion ist dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien, die eine hohe Reinheit und hohe Ausbeute bieten und somit die Anzahl der verwendeten Versuchstiere verringern.
Abstract
In den letzten Jahren sind zerebrale Pericyten in den Fokus umfangreicher Forschungen in der Gefäßbiologie und Pathologie geraten. Die Bedeutung von Pericyten in der Bildung und Physiologie von Blut-Hirnbarrieren ist nun nachgewiesen, aber ihre molekulare Grundlage bleibt weitgehend unbekannt. Da die pathophysiologische Rolle von zerebralen Pericyten bei neurologischen Erkrankungen faszinierend und von großer Bedeutung ist, sind die In-vitro-Modelle nicht nur ausreichend geeignet, sondern auch in der Lage, verschiedene Techniken für diese Studien zu integrieren. Mehrere Methoden wurden als In-vitro-Modelle für die Extraktion von zerebralen Pericyten vorgeschlagen, obwohl ein antibiotikafreies Protokoll mit hoher Leistung wünschenswert ist. Am wichtigsten ist, dass eine Methode, die die Leistung pro Extraktion erhöht hat, den Einsatz von mehr Tieren reduziert.
Hier schlagen wir eine einfache und effiziente Methode zur Extraktion von zerebralen Pericyten mit ausreichend hoher Leistung vor. Das Maushirngewebe wird mit einer BSA-Dextran-Lösung zur Trennung von Gewebeablagerungen und mikrovaskulärem Pellet gemischt. Wir schlagen eine dreistufige Trennung mit anschließender Filtration vor, um ein mikrogefäßreiches Filtrat zu erhalten. Bei dieser Methode reicht die Menge der mikrovaskulären Fragmente, die von 10 Mäusen gewonnen wurden, aus, um 9 Brunnen (je 9,6 cm2) einer 6-Well-Platte auszusäen. Am interessantesten ist, dass der Benutzer mit diesem Protokoll 27 pericyte reiche Brunnen (je 9,6 cm2) in Durchgang 2 erhalten kann. Die Reinheit der Pericytkulturen wird durch den Ausdruck klassischer Pericytmarker bestätigt: NG2, PDGFR-B und CD146. Diese Methode zeigt ein effizientes und praktikables In-vitro-Tool für physiologische und pathophysiologische Studien an Pericyten.
Introduction
Zerebrale Pericyten sind ein wesentlicher Bestandteil der neurovaskulären Einheit (NVU), die eine funktionelle Einheit mit den zerebralen Endothelzellen der Bluthirnschranke (BBB), Gliazellen, extrazellulären Matrix und Neuronen umfasst. Pericyte sind ein wichtiger Bestandteil der regulierten Funktion des Zentralnervensystems (ZNS), da sie als eine der Schnittstellen für den Austausch molekularer und zellulärer Informationen dienen.
Zerebrale Pericyten sind in die abluminale Seite der Hirnmikrogefäße eingebettet und sind für die Etablierung von1 und die Aufrechterhaltungvon 2 der BBB-Physiologie unerlässlich. Mehrere neuere Arbeiten haben auch die Rolle der zerebralen Pericyten in der Angiogenese3 und Gefäßreifung4,Endothelial Morphogenese5 und Überleben6, und bei der Kontrolle des Cholesterinstoffwechsels des Gehirns7hervorgehoben. Wichtig ist, dass die Dysregulation in einem dieser Prozesse ätiologische Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen sind.
In der Tat sind Pericyte eine funktionelle Notwendigkeit für die normale BBB-Funktion und ihren Schutz gegen das Fortschreiten mehrerer neurologischer Erkrankungen. Degenerierende Physiologie und Verlust von Pericyten sind häufige Nenner im Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit8, neuronaler Verlust während der Weißen Materie Dysfunktion9, Multiple Sklerose10, septische Enzephalopathie11, akute Phase ischämischen Schlaganfall12 und bei anderen neurologischen Erkrankungen. Perizyten sind auch bei der Tumormetastasierung13hilfreich. Interessanterweise haben Pericyte auch gezeigt, dass eine rettende Rolle nach neurologischen Trauma und Störungen zeigen: bei der Remyelination im Gehirn1,ischämischer Schlaganfall, Rückenmarksverletzung14 und Förderung der Angiogenese15. Die Anfälligkeit von Pericyten, um die pathophysiologische Manifestation neurologischer Traumata und Störungen zu verstärken, macht sie zu einem potenziellen therapeutischen Ziel16.
In-vitro-Forschungsmodelle von Pericyten im BBB sind wichtige Instrumente, um umfangreiche Studien durchzuführen. Diese Modelle bieten eine Plattform für ausgefeiltere Studien, indem sie Arbeitsmodelle der BBB und mehr darstellen. Zum Beispiel können diese Modelle verwendet werden, um die zelluläre Physiologie innerhalb von Pericyten und unter anderen Zelltypen der NVU zu verstehen. Auch In-vitro-Modelle sind aus erster Hand Untersuchungswerkzeuge, um den pharmakologischen Einfluss neuer Medikamente und Moleküle auf Pericyten zu testen. Diese Modelle können auch verwendet werden, um die pathophysiologische Rolle von Pericyten in Bezug auf neurologische Störungen zu verstehen. Dennoch erfordert die Entwicklung von In-vitro-Modellen eine höhere Produktion, um experimentelle Freiheit zu ermöglichen. Diese Modelle sollten einfach und schnell sein und die Anzahl der verwendeten Versuchstiere reduzieren. Darüber hinaus ist die Möglichkeit, solche Modelle zu einem Doppel- und Dreizellkulturmodell zu entwickeln, wünschenswert.
Es gibt viele Protokolle, die entwickelt wurden. Die Protokolle, die von Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20, und Crouch und Doetsch21 vorgeschlagen wurden, sind lobenswerte Ansätze, die die meisten Notwendigkeiten befriedigen. Alle diese Methoden liefern effektive Ergebnisse, aber die Abhängigkeit von einer großen Anzahl von Versuchstieren bleibt ein gemeinsamer Nenner für diese Protokolle. Daher wird es obligatorisch, eine High-Output-Methode zu entwickeln, die Pericyten mit maximaler Effizienz isolieren und reinigen kann. In diesem Protokoll wird die Reinheit der Zellen, die nach einer zweiten Passage erhalten wurden, mit mehreren Pericytes-Markern überprüft. Wir überprüften auf Platelet-Derived Growth Factor Receptor--A (PDGFR-, das als klassischer Marker der Pericyte17verwendet wird, und auf NG2 (neuron-glial Antigen 2), das ein Marker für pericyte vermittelte Vaskuläre Morphogenese22 und Vaskularisation23ist. Wir überprüften auch auf Differenzierungscluster 146 (CD 146), der als eines der Moleküle berichtet wurde, die in den Pericyten17,18exprimiert wurden.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Extraktion von primären Pericyten von Mäusen (Wildtyp oder Transgenen) vor, das alle oben genannten Anforderungen mit hoher Leistung erfüllt. Wir verwenden eine antibiotika- und immunpanning freie Selektionsmethode der Proliferation für die primären zerebralen Pericyten, die sich als effizientes Modell für die Durchführung von In-vitro-Studien erweisen wird.
Protocol
Alle Experimente wurden nach den Richtlinien des Instituts für den Einsatz und Umgang mit Tieren durchgeführt. Gemäß den französischen Rechtsvorschriften wurde die Tieranlage der Universität Artois von den örtlichen Behörden genehmigt (Referenz: B62-498-5). In Übereinstimmung mit den Rechtsvorschriften der Europäischen Union (Richtlinie 2010/63/EU) wurden alle Verfahren vom lokalen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Nord-Pas-De-Calais, Referenz: C2EA 75) und dem französischen Forschungsministerium (Referenz: 2015090115412152) genehmigt.
1. Vorbereitung von Lösungen
- 500 ml Waschpuffer A (WBA): 10 mM HEPES Lösung in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Bei 4 °C lagern.
- 500 ml Waschpuffer B (WBB): 0,1% Rinderserum Albumin (BSA) mit 10 mM HEPES Lösung in HBSS vorbereiten. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 300 ml 30% Dextran-Lösung in WBA vor, indem Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur mischen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 110 °C für 30 min vor Gebrauch. Nach dem Autoklavieren die Lösung bei Raumtemperatur für 2-3 h ruhen lassen. Die Lösung bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 100 ml 0,1% BSA-Lösung in kalter Dextran-Lösung vor. 3-4 min kräftig schütteln und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie komplette Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Kulturmedien vor, indem Sie 20% Kalbsserum, 2 mM Glutamin, 50 g/ml Gentamycin, 1% Vitamine, 2% Aminosäuren Basal Medium Eagle (BME) in Basal DMEM Medien auflösen und bei 4 °C lagern. Fügen Sie vor der Anwendung 1 ng/ml Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) hinzu.
- Bereiten Sie komplette Pericyte-Medien vor, indem Sie Pericyt-Wachstumsergänzungen (mit den Pericyt-Medien) und 20% Fetal Calf Serum (FCS) in Pericyte-Kultur-Basalmedien und speichern bei 4 °C hinzufügen.
2. Hirngewebe Erholung und Entfernung von Meningen
- Für Konsistenz, verwenden Sie Mäuse ähnlichen Alters und gleiches Geschlecht in jeder Charge der Extraktion. Nutzen Sie ein pathogenfreies Tierheim und bieten Sie ad libitum Zugang zu Wasser. Um Effizienz und minimalen Einsatz von Tieren zu gewährleisten, vermeiden Sie den Verlust von Gewebematerial.
- Euthanize C57BL/6J, 4-6 Wochen alt, männliche Mäuse (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Frankreich).
- Schnell verbrauchen das Gehirngewebe in sterilen Bedingungen, vermeiden Sie Schäden am Gewebe. Das Gewebe vorsichtig in 40 ml kalter Phosphatgepufferte Saline (PBS) legen.
- Übertragen Sie das Hirngewebe in kalten PBS in eine Petrischale (100 mm x 15 mm).
- Legen Sie das Hirngewebe auf ein steriles trockenes fusselfreies Tuch und mit gekrümmten Spitzenzangen, entfernen Sie Das Kleinhirn, Striatum und okzipitale Nerven.
- Entfernen Sie alle sichtbaren Meningen mit einem Wattestäbchen. Stellen Sie das Hirngewebe auf den Kopf und öffnen Sie die Lappen mit einem Wattestäbchen mit äußeren leichten Strichen. Entfernen Sie alle sichtbaren Blutgefäße.
- Legen Sie die Meningen frei Hirngewebe in eine Petrischale (100 mm x 15 mm) mit 15 ml kaltem WBB.
3. Homogenisierung
- Übertragen Sie das Gewebe auf ein Dounce Gewebeschleifer Mörtelrohr und fügen Sie 3-4 ml WBB mit Zange.
- Das Gewebe mit einem "lockeren" Stößel 55 Mal zerkleinern. Spülen Sie den "lockeren" Stößel mit WBB. Jetzt hacken Sie die Gülle mit einem "engen" Stößel 25 Mal.
- Teilen Sie die Gülle gleichmäßig in zwei 50 ml Rohre und fügen Sie 1,5x Volumen von kalten 30% BSA-Dextran, kräftig schütteln die Rohre, um die Gülle zu mischen.
4. Isolierung der Gefäßfraktion
- Nach kräftigem Schütteln der Rohre zentrieren Sie die Rohre 25 min bei 3.000 x g und 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand (zusammen mit der oberen Myelinschicht) auf 2 neue Rohre und zentrifugieren Sie die Rohre für 25 min bei 3.000 x g und 4 °C. Bewahren Sie die Pellets aus der ersten Zentrifugation auf, indem Sie 3 ml kalteWBB hinzufügen (das Pellet bei 4 °C halten).
- Wiederholen Sie Schritt 4.2 und bewahren Sie die Pellets sorgfältig aus der 2nd Zentrifugation auf.
- Entsorgen Sie den Dextran und das Myelin mit Gewebeablagerungen aus den Rohren ab Schritt 4.3. Bewahren Sie die Pellets in kaltem WBB auf.
- Den Inhalt von Rohr 1 und Rohr 2 ab Schritt 4.1 bündeln und bis zum Endvolumen von 10 ml mit kaltem WBB aufstellen.
- Wiederholen Sie diesen Schritt für Rohre aus Schritt 4.2 und Schritt 4.3.
HINWEIS: Schließlich gibt es 3 Rohre aus 3 Zentrifugationen. - Dissoziieren Sie das Pellet mit 6 Auf- und Abschlägen mit einer 10 ml Pipette, bis keine sichtbaren Klumpen der Pellets übrig sind.
- Mit Hilfe einer Vakuumfilterbaugruppe und des Nylonnetzfilters filtern Sie die Zellsuspensionen jedes Rohres.
HINWEIS: Dieser Filterschritt ist wichtig, um längere/größere Gefäße über den Netzfilter zu entfernen. - Die Kapillaren wiederherstellen und wieder aussetzen, indem Sie den Filter mit Hilfe einer flachen Spitzenzange oder eines Schabers in WBB bei Raumtemperatur kratzen. Filtern Sie die Suspension mit einem frischen Filter, um mehr Kapillaren zurückzugewinnen
- Teilen Sie das Filtrat gleichmäßig in zwei Rohre und Zentrifuge für 7 min bei 1.000 x g und RT.
HINWEIS: Bereiten Sie in diesem Zentrifugationsschritt die enzymatische Lösung vor. Bestimmen Sie das benötigte WBB-Volumen entsprechend der Anzahl der verwendeten Tiere (siehe Materialtabelle). 1x DNase 1 und 1x Tosyl-L-Lysyl-Chlormethanhydrochlorid (TLCK) (siehe Materialtabelle)in WBB hinzufügen und auf 37 °C vorwärmen. - Sammeln Sie die Pellets ab Schritt 4.10 in einer Röhre mit vorgewärmten WBB mit Enzymen. Vorgewärmte 1x Kollagennase/Dispase hinzufügen. Legen Sie das Rohr in das Schütteltisch-Wasserbad bei 37 °C für genau 33 min.
- Stoppen Sie die Enzymreaktion, indem Sie 30 ml kalteWBB hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Suspension für 7 min bei 1.000 x g und RT.
- Entsorgen Sie den Überstand sorgfältig und lösen Sie das Pellet in WBB mit 6 Auf- und Abschlägen mit einer 10 ml Pipette. Dieser Schritt sollte weniger rigoros und vergleichsweise schneller sein.
- Zentrifugieren Sie die Suspension für 7 min bei 1.000 x g und RT.
HINWEIS: Entsorgen Sie in diesem Schritt die Beschichtung aus den Kulturgerichten und spülen Sie sie einmal mit DMEM bei Raumtemperatur ab. Mantel Zellkultur Gerichte für mindestens 1 h bei RT. - Entsorgen Sie den Überstand aus dem Rohr, das bei Schritt 4.14 erhalten wurde, und dissoziieren Sie das Pellet in neuen kompletten DMEM-Medien, platten Sie die Zellen (Tag 0, P0) in 9 Brunnen mit 6-Well-Platten (1 Brunnen von je 9,6 cm2).
5. Proliferation von zerebralen Pericyten
- Bewahren Sie die Zellkulturen bei 37 °C und 5%CO2 in einem sterilen Inkubator auf. Ersetzen Sie die Kulturmedien nach 24 h (Tag 1) der Beschichtung der Zellen, indem Sie die Trümmer sorgfältig entfernen. Nach Tag 1, ändern Sie die Kulturmedien in allen 48 h.
- Beobachten Sie die Zellkultur für mindestens 7-8 Tage. Zu diesem Zeitpunkt sollte das zelluläre Wachstum an der Spitze des endotheliaalen Eintöters beobachtbar sein.
- Durchfahrt der Zellen am Tag 8-10 (je nach Zusammenfluss) im Pericytenkulturmedium bis Durchgang 1 (P1) auf gelatinebeschichteten Kulturplatten. Ändern Sie die Kulturmedien in allen 2 Tagen. Beobachten Sie die Zellen für 6-7 Tage. Die Zellen werden am Tag 17 [und Durchgang 3 (P3) an Tag 24 nur bei Bedarf wieder nacheinander auf Durchgang 2 (P2) aufgeteilt, das in Pericytmedium in gelatinebeschichteten Platten angebaut wird.
ANMERKUNG: Die Zellen müssen bei einer Konfluenz von fast 80-90 % für Experimente/Beobachtungen bereit sein.
Representative Results
Dieses Protokoll (Abbildung 1) liefert zum Zeitpunkt der Aussaat bei P0 effizient 9 Bohrungen (von 6-Well-Platten)(Abbildung 2A (P0: Tag 1)).
Von P0 bis P2 gibt es spezifische morphologische Merkmale, mit denen Endothelzellen (durch weiße Pfeile angezeigt) und eine allmähliche Zunahme der Pericyten (angezeigt durch schwarze Pfeile) beobachtet werden können. In P0 sind die länglichen Endothelzellen, die sich aus Mikrogefäßen entwickeln, im Überfluss vorhanden(Abbildung 2A, P0: Tag 3), während die Häufigkeit solcher länglichen Zellen in P1 reduziert wird und in P2 fehlt. Im Gegenteil, die Pericyten erscheinen als vierseitige Zellen, die in P2 reichlich vorhanden sind (Abbildung 2A, P2: Tag 18).
Um die Reinheit der Perizytenkultur in P2 zu bestätigen, überprüften wir die Expression von NG2, CD146 und PDGFR-beta als Pericytmarker mit quantitativer PCR (Abbildung 2B), Immunzytochemie (Abbildung 2C) und Western Blot ( Abbildung3). Pericyte in P2 drücken höhere Konzentrationen von CD146, NG2 und PDGFR---B im Vergleich zur Expression im gesamten Maushirnextrakt (Frau Br) aus. Als Kontrolle wurden auch die Expression der Endothelmarker Occludin und CD31, des Astrozytenmarkers Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) und des Mikrogliamarkers CD11b in P2 beobachtet.
Abbildung 1: Zusammenfassung des Protokolls. Dieser Umriss stellt kritische Schritte für die Pericytextraktion dar, die mit dem Zerfall des Gewebes mit Glaspestleschleifer beginnt, gefolgt von einer 3-stufigen Trennung in Dextran und Filtration. Dieses Protokoll verwendet einen 33 min Enzymverdauungsschritt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zellenmorphologie und Markerausdruck. (A) Phasenkontrastbilder von Pericyten in P0-, P1- und P2-Stadien der Proliferation. Reiche Endothelzellen in P0 werden durch weiße Pfeile angezeigt. Ihre Zahl ging in P1 zurück und sie sind in P2 verschwunden. Pericytes werden durch schwarze Pfeile angezeigt. (B) Analyse der CD146-, NG2- und PDGFR--Expression durch PCR in Pericyten in P2 mit Pericyten in P1- und Maushirnproben (Frau Br). (C) Repräsentative Bilder von Pericyten in P2 mit positiver Immunostainierung von CD146, PDGFR-Nr und, NG2. Maßstabsbalken: 50 m (20-fache Vergrößerung) und 20 m (40-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Reinheit der Zellkulturen. Analyse der CD146-, PDGFR-, NG2-, Occludin-, GFAP-, CD31-, CD11b- und Tubulin-Expression durch western blotting in Pericyten in P2- und Maushirn-Proben (Frau Br). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentativer Vergleich verschiedener Methoden der Gewebezerfall, Reinigung, Anreicherung und enzymatischen Verdauung. Jedes veröffentlichte Protokoll wird mit Angaben über die Anzahl der für jedes Protokoll verwendeten Tiere zusammengefasst. Die Ausgänge werden auch in Bezug auf die Anzahl der Brunnen angegeben, die bei der Aussaat erhalten wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Zerebrale Pericyten sind integraler Bestandteil der NVU und spielen eine aktive Rolle bei der Induktion und Wartung der BBB24. Ebenso ist die Rolle dieser Zellen bei den verschiedenen neurodegenerativen Störungen und Gefäßpathologien faszinierend. Daher wird ein effizientes primäres Pericytzellmodell mit hoher Leistung eine effiziente Plattform für In-vitro-Studien bieten.
Es gibt verschiedene Protokolle, die für die Isolierung von primären Pericyten vorgeschlagen wurden (Abbildung 4). Tigges et al.17 schlugen eine Methode vor, die kortikale Gewebe mit Hirnhäuschen. Dieser Ansatz ist die Zartisierung von Gewebe von 6 Mäusen (eine 37 °C, 70 min Verdauung mit Papain/DNase-Enzymen), gefolgt von einem Zerfallsschritt über 21 G- und 18 G-Nadeln. Dieses Protokoll schlägt eine einstufige Trennung (Zentrifugation in 22% BSA/PBS-Lösung) vor, die mindestens 2 Kollagen-I-beschichtete Brunnen einer 6-Well-Platte ergibt. Die Zellen werden in endothelialeZellwachstumsmedium (ECGM) bis Durchgang 3 und später in Pericyt Growth Medium (PGM) für Passaging-Zellen gehalten, um die Pericyt-Proliferation zu fördern. In einem anderen ähnlichen Ansatz schlugen Chen et al.18 eine Gewebedissoziation vor, indem sie das Gewebe mit einer sterilisierten Rasierklinge und Gewebeverdauung mit Kollagenase/DNase für 90 min bei 37 °C würfelten. Nach einer einstufigen Trennung (Zentrifugation in 22% BSA) der Zellen wird die Myelinschicht entfernt und das Pellet zweimal in ECGM gewaschen. Die Mikrogefäße sind in 3 Brunnen eines Kollagens plattiert, das ich 6-Well-Platten beschichtet habe. Nach dem Erreichen des Zusammenflusses werden die Zellen zweimal durchdrungen und später in PGM aufrechterhalten. Am Ende, wenn Zellen im Verhältnis 3 übergeben werden, können wir 27 Brunnen von 6-Well-Platten nur bei der Verwendung von 10 Mäusen am Anfang des Protokolls erhalten.
In Thomsen et al. schlagen die Autoren die Isolierung von zerebralen Pericyten über eine zweistufige Enzymverdauungvor 19. Meninges und weiße Materie werden entfernt, und Gehirnproben werden in kleine Stücke geschnitten. Die Gewebestücke durchlaufen die erste Enzymreaktion in Kollagenase/DNase I für 75 min bei 37 °C, nach einem Trennschritt in 20% BSA. Das Pellet wird in Kollagennase/Dispase/DNase I 50 min bei 37 °C gesammelt und weiter verdaut. Diesem Schritt folgt die Mikrogefäßtrennung in einem Percoll-Gradienten von 33 % und wird einmal weiter gewaschen. Die Mikrogefäße werden auf Kollagen IV/Fibronectin beschichteten 35 mm Schalen gesät. Die Proliferation von Pericyten wird von 10% FCS und Gentamicinsulfat in DMEM für 10 Tage begünstigt. In einem weiteren zweistufigen Enzymverdauungsansatz schlagen Yamazaki et al. vor, das ausgeschnittene Gewebe in kalten DMEM20zu schneiden. In der ersten Enzymreaktion werden Proben 75 min bei 37 °C mit Kollagenase/DNase I behandelt. Nach einem Schritt Zentrifugation wird das Pellet erneut einmal gewaschen und eine zweite Enzymreaktion in Kollagenase/Dispase für 60 min bei 37 °C eingeleitet. Nach einer einstufigen Trennung wird das Pellet in 22% BSA-Lösung resuspendiert und zentrifugiert. Schließlich wird das mikrovaskuläre Pellet resuspendiert und in eine 6-Well-Platte eintellert. Für 5 Mausgehirne kann 1 Brunnen einer 6-Well-Platte plattiert werden. Um die Pericyten zu erhalten, werden Endothelkulturen dreimal durchgelassen, während sie in der Maus Gehirn Endothelzelle (mBEC) Medium II beibehalten werden. Crouch und Doetsch20 suggerieren Pericyt-Reinigungsmethode durch FACS. Gewebeproben aus der Kortex- und ventrikulären subventrikulären Zone des Maushirns werden mit einem Skalpell mikroseziert und gründlich gehackt. Nach Kollagenase/Dispase-Enzym-Inkubation für 30 min bei 37 °C wird das verdaute Gewebe von Myelin getrennt und Trümmer in einer 22%v/v Percoll-Lösung zentrifugiert. Die Zellsuspension wird dann in fluoreszierend konjugierten Antikörpern für die FACS-Analyse und -Sortierung inkubiert. Die sortierten Zellen sind in kollagenbeschichteten Brunnen von 24 Brunnenplatten plattiert. Es wird vermutet, dass ein Kortex genügend Zellen für eine Beschichtung in einem Brunnen von 24-Well-Platte ergibt.
Selbst wenn sie produktiv sind, haben diese Methoden mehrere Einschränkungen, von der Verwendung einer hohen Anzahl von Tieren für die Isolierung von Einzelchargen bis hin zu einer sehr begrenzten Produktionsmenge.
Bei der Entwicklung dieses vorgeschlagenen Protokolls gelang es uns, eine hohe Leistung zu erzielen: 9 Brunnen einer 6-Well-Platte von nur 10 Mäusen. Zu diesem Zweck, Entfernung von Meningen sorgt für die einstufige Entfernung von großen Gefäßen aus dem Gewebe. Der Dounce Gewebeschleifer ist besser geeignet für Weichteile wie das Gehirn. Es sorgt auch für Probenreduktion mit dem lockeren Stößel, Homogenisierung mit dem engen Stößel und verhindert unnötige Zellschäden. Eines der Hauptziele in primären Zellkulturprotokollen ist die minimale Verschwendung von Gewebe und die erweiterte Rückgewinnung der zerebralen Vaskulatur. Im vorgelegten Protokoll wird dies durch repetitive Zentrifugation des dextran-BSA infundierten Gewebehomogenats erreicht. Ein dreistufiger Zentrifugationsansatz hilft, große Mengen Vaskulatur aus dem Gewebehomogenat zurückzugewinnen. Dies ermöglicht eine 3x verbesserte Rückgewinnung von Mikrogefäßen. Nach der Trennung ist die Filtration der nächste wichtige Schritt, der den Ausschluss von glatten Muskelzellen assoziierten großen Gefäßen begünstigt. Wie bereits erwähnt, wurde eine Kombination verschiedener Enzyme für die enzymatische Verdauung vorgeschlagen. Während DNase und Kollagennase/Dispase verwendet werden, um Zellklumpen zu reduzieren bzw. Einzelzellen zu isolieren, ist es sehr wichtig, den Zelltod in einer solchen invasiven Umgebung zu verhindern und dies wird durch TLCK verhindert, was die Endausbeute erhöht. Zunächst darf im ersten Durchgang eine endotheliale Monolayer wachsen, die später das Wachstum von befestigten Pericyten auf dem Einlayer unterstützt. Da das Überleben der primären Endothelzellen bei der Passierung reduziert wird, erhöht es die Wahrscheinlichkeit für Pericyten-Retrieval. Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll eine weitere Passage, die die Vermeidung von Endothelzellkontamination sicherstellt. Es sollte beachtet werden, dass bei einer höheren Anzahl von Zellen aus P2 die Abhängigkeit von weiteren Passaging der Zellen reduziert wird. Darüber hinaus reduziert es die Möglichkeit des Perizytenwachstums, das von glatten Muskelzellen überholt wird, die sich bei viel höherer Rate vermehren.
Um eine höhere Leistung zu erreichen, gibt es mehrere Schritte, die kritisch sind und in Bezug auf Temperatur und Zeit genau ausgeführt werden sollten. Die Vermischung von Gewebehomogenat in BSA-Dextran sollte schnell erfolgen. Die Pelletdissoziation nach den Zentrifugationsschritten sollte schnell sein, um den Zelltod zu verhindern. Darüber hinaus sollten 33 min enzymatische Verdauung mit Präzision und Sorgfalt durchgeführt werden. Eine der Einschränkungen für dieses Protokoll ist die 7-8-Tage-Dauer, die endotheliale Einlayer wachsen und das Wachstum von Pericyten weiter erleichtern darf. Offensichtlich ist die Isolierung von Mikrogefäßen btter, das Wachstum der Einlayer ist schneller, und daher gibt es eine erhöhte Anzahl von Pericyten. Es wird empfohlen, nicht weniger als 10 Mäuse in jeder Extraktion zu verwenden, um eine ausreichende Anzahl von mikrovaskulären Fraktionen zu gewährleisten, um das Perizytenwachstum weiter zu unterstützen. Wenn die oben genannten Punkte sorgfältig befolgt werden, kann die gewünschte Zelldichte für zerebrale Pericytenkultur leicht erreicht werden.
In-vitro-Modelle bieten eine praktikable Plattform für die Entwicklung von Derivatemodellen, um mehr Informationen über die pathophysiologische Relevanz und Kommunikation zwischen den anderen Zellen der NVU bei neurologischen Störungen zu erhalten. Isolierte Pericyten können in eine bizelluläre Kultur (mit endotheliale oder gliale Zellen) und trizelluläre Kultur (Endothel- und Gliazellen) eingearbeitet werden. Die Entwicklung dieser Modelle wurde hier nicht diskutiert. Abschließend möchte ich sagen, dass dieses Protokoll einen Ansatz für die Isolierung von Primärzellen mit höherer Leistung und eine bessere Plattform für die In-vitro-Forschung im Zusammenhang mit der zerebralen Pericytbiologie bietet.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
LT und FG wurden von Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) im Rahmen des Gemeinsamen EU-Programms – Neurodegenerative Disease Research (JPND) für das Projekt SNOWBALL gewährt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
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