生物灵感软机器人与合并微电极

摘要

生物启发的脚手架由软光刻技术使用机械坚固和导电水凝胶制成。微型水凝胶提供定向心肌细胞对齐，从而形成量身定制的驱动方向。柔性微电极还集成到支架中，为自驱动心脏组织提供电气可控性。

摘要

使用工程肌肉组织和生物材料模仿生物的生物机器人的生物灵感软机器人系统正在彻底改变当前的生物机器人模式，特别是在生物医学研究中。重建人工生命般的驱动动力学对于软机器人系统至关重要。然而，对驱动行为的精确控制和调谐仍然是现代软机器人系统的主要挑战之一。此方法描述了一种低成本、高度可扩展且易于使用的程序，用于制造具有栩栩如生的运动、通过微模式刺痛的心肌组织收缩激活和控制的电动可控制软机器人射线状水凝胶支架。使用软光刻方法，可以成功地将多个组件集成到软机器人系统中，包括微型水凝胶基支架与碳纳米管 （CNT） 嵌入式明胶甲酰胺 （CNT-GelMA），聚（乙二醇）二甲酸酯（PEGDA）、柔性金（Au）微电极和心肌组织。特别是，水凝胶对齐和微模式设计模仿刺痛射线的肌肉和软骨结构。导电的CNT-GelMA水凝胶作为细胞支架，改善心肌细胞的成熟和收缩行为，而机械坚固的PEGDA水凝胶为整个软机器人提供结构软骨样的支持。为了克服金属基微电极的坚硬和脆性，我们设计了一种具有高灵活性的蛇形图案，可以避免阻碍心肌细胞的跳动动力学。结合的柔性Au微电极为软机器人提供电刺激，使控制心脏组织的收缩行为更加容易。

引言

现代最先进的软机器人可以模仿许多生物的层次结构和肌肉动力学，如水母^1，2，刺射线^2，章鱼^3，细菌⁴和精子^5。模拟自然系统的动力学和结构，在能量和结构效率方面提供更高的性能^6。这与自然组织的柔软性（例如，皮肤或肌肉组织与杨的模量在10⁴×10⁹ Pa之间）的内在相关，与标准工程执行器相比，这允许更高的自由度和优越的变形和适应性（例如，Young 的模量通常在 10⁹+ 10¹² Pa 之间）⁶。心脏肌肉为基础的软执行器，特别是，表现出卓越的能源效率，由于其自我驱动，以及他们的自动修复和再生的潜力相比，机械为基础的机器人系统^7。然而，软机器人的制造具有挑战性，因为需要将具有不同物理、生物和机械特性的不同组件集成到一个系统中。例如，工程合成系统需要与活生物系统集成，不仅为他们提供结构支持，而且影响和调节其驱动行为。此外，许多微加工方法需要苛刻/细胞毒性工艺和化学品，这些工艺和化学品会降低任何活部件的生存能力和功能。因此，有必要采用新的方法来增强软机器人的功能，并控制和调节它们的行为。

为了成功地将活部件与良好的生存能力集成，水凝胶基架是创建软机器人机身的极好材料。水凝胶的物理和机械特性可以很容易地调整，为生物成分，如肌肉组织^8，9创建微环境。此外，它可以很容易地采用各种微加工技术，从而创建具有高保真度^1、2、10的分层结构。柔性电子设备可以融入软机器人，通过电刺激控制其行为。例如，利用光技术设计电原细胞（例如心肌细胞），这种细胞具有光依赖性电生理活化，已用于开发一种基于二甲基硅氧烷（PDMS）的软机器人刺射线，该射线在光线引导下能够重现鱼在体外²的不可调节运动。虽然光遗传学技术表现出了优异的可控性，但所展示的工作采用电刺激，这是一种传统的、传统的模拟方法。这是因为通过柔性微电极进行电刺激与光遗传学技术相比是简单易行的，光遗传学技术需要大量的开发过程^11。使用柔性电子设备可以允许长期刺激和标准/简单的制造过程，以及可调的生物相容性和物理和机械特性^12，13。

在这里，我们提出了一种创新的方法，以制造生物灵感的软机器人，通过跳动工程心肌组织来驱动，并通过嵌入式柔性Au微电极通过电刺激控制。软机器人设计模仿刺射线的肌肉和软骨结构。与其他游泳物种相比，刺射线是一种相对容易模仿结构和运动的有机体。通过在导电水凝胶微模式上播种心肌细胞，在体外重建肌肉。如前所述，在GelMA水凝胶中加入CNT等导电纳米颗粒不仅改善了心脏组织的电耦合，而且诱导了优良的体外组织架构和排列^8、9。然后，使用机械坚固的 PEGDA 水凝胶模式模拟软骨接头，该模式充当整个系统的机械坚固基板。具有蛇形图案的柔性 Au 微电极嵌入 PEGDA 模式，以局部和电刺激心脏组织。

方案

这项研究是严格按照国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》中的建议进行的。该协议得到了布里格姆和妇女医院动物护理和使用机构委员会（IACUC）的批准。

1. 凝胶合成

1. 在 50°C 下使用磁性搅拌器将 10 克明胶溶解在 100 mL 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中。
2. 缓慢加入8 mL的甲基丙烯酸氢化物，同时在50°C搅拌明胶预聚物溶液2小时。在50°C下用预热的DPBS稀释反应明胶溶液。
3. 将稀释溶液转移到透析膜中（分子量截止 = 12-14 kDa），并将其放入去离子化 （DI） 水中。在40°C下进行透析约1周。
4. 使用无菌过滤器过滤透析GelMA前聚合物溶液（孔径 = 0.22 μm），并将溶液的25或30 mL转移到50 mL管中，并在-80°C下储存2天。
5. 使用冷冻干燥机冷冻干燥冷冻凝胶前聚合物溶液5天。

2. 制备聚（乙二醇）丙烯酸酯（PEGDA）预聚合物溶液

1. 在DPBS的1 mL中溶解PEGDA（MW = 1，000）的200mg（总溶液的200%）（总溶液的0.5%）2-羟基-4-（2-氢氧乙烷）2-甲基丙酮（光开射器，PI）。
2. 在80°C孵育预聚合物溶液5分钟。

3. 制备凝胶涂层CNT分散库存溶液

1. 在 4 mL DPBS 中溶解 80 mg GelMA（用作生物活性剂），然后将 20 mg 的 COOH 功能化多壁碳纳米管 （MWCNTs） 加入 GelMA 预聚合物溶液中。
2. 将MWCNT载载GelMA预聚合物溶液用于1小时（0.66Hz，100瓦）。
   注:在声波过程中，溶液必须浸入水浴室，温度为+15°C，以防止溶剂因温度升高而蒸发。

4. 制备含有5%GelMA预聚合物溶液的1mg/mL CNT

1. 在80°C下在0.8 mL的DPBS中溶解50mg的GelMA和5mg（总溶液的0.5%）10分钟。
2. 添加 0.2 mL 的制备 CNT 库存解决方案（步骤 3）。涡旋，在80°C孵育溶液10分钟。

5. 制备3-（三氧西基）丙烯酰（TMSPMA）涂层玻璃玻片

1. 用纯乙醇清洗玻璃玻片（厚度 = 1 毫米，尺寸 = 5.08 厘米 x 7.62 厘米）。
2. 将清洁的幻灯片垂直堆叠在 250 mL 烧杯中，并使用注射器将 3 mL 的 TMSPMA 涂在上面。用铝箔盖住烧杯，防止TMSPMA蒸发。
3. 在 80°C 烤箱中孵育幻灯片 1 天。
4. 将涂覆的玻璃玻片浸入纯乙醇中，然后干燥，将其清洗。
5. 在室温 （RT） 下将包裹在铝箔中的涂层玻璃玻片储存起来。
   注:尽量尽量减少接触 TMSPMA 涂层玻璃玻片的表面。

6. 柔性Au微电极的制造

1. 使用计算机辅助设计设计阴影蒙版 （补充文件 3.
2. 制作并购买阴影蒙版。
3. 用丙酮清洗玻璃滑块（厚度 = 1 mm，尺寸 = 3 厘米 x 4 厘米），用压缩空气枪擦干。
4. 使用双面胶带将阴影掩膜连接到玻璃基板，然后将它们放入 E-梁蒸发器中，直到腔室压力达到至少^10-6 Torr。
   注:两块胶带被手动放置在支架上，距离足够短，足以承载玻璃，足够大，足以容纳整个图案。此步骤大约需要 45-60 分钟。
5. 通过 E-beam 蒸发器沉积 200 nm 厚的 Au 层（例如，使用大成 EE-4，真空 = 10^-6 Torr，功率 = 2.6%，速率 = 2 °/s），并使用切片锯机切割制造微电极（电极尺寸 = 7.38 mm x 8.9 mm x 200 nm）。

7. 制造Au微电极集成微模式多层水凝胶脚手架

注:此过程的结果是，在底层有一个微图案的PEGDA水凝胶，一个微图案的CNT-GelMA水凝胶在顶部，Au微电极位于两层之间。这种配置可确保电极具有更好的灵活性，并限制断裂的风险。

1. 设计和制作两个光掩膜，以创建微图案PEGDA（^第1个光掩膜）和CNT-GelMA水凝胶（^第2个光掩膜）层。请参阅补充文件 2_3。设计可以使用CAD软件完成。
   注:参见图2B，E。
2. 将 50 μm 垫片堆叠在 TMSPMA 涂层玻璃上，将一层商业隐形胶带（厚度:50 μm）制成。将 15 μL 的 20% PEGDA 预聚合物溶液倒在 TMSPMA 涂层玻璃上，然后用金色微电极覆盖。将玻璃滑动（微图案 PEGDA）的第一个光掩膜（微图案 PEGDA）放在金色微电极顶部，并将整个结构暴露在紫外线下（200 W 汞蒸气短弧灯，带 320–390 nm 过滤器），强度为 800 mW，距离为 8 厘米，为 110 s。
   注:参见图1A。
3. 在 5-10 分钟后，添加 DPBS 以环绕玻璃滑块，将微图案 PEGDA 水凝胶与 Au 微电极一起小心地从未涂布的玻璃基板上分离，以获得具有具有 Micro 型 PEGDA 水凝胶的玻璃滑块。微 电极。
   注:参见图1B。由于 TMSPMA 涂层，该结构从未涂布的玻璃基板转移到 TMSPMA 涂层基板。小心拆卸，因为Au微电极在此步骤中很容易断裂（图3）。
4. 将两层商业透明胶带（厚度 = 50 μm）堆叠在培养皿底部，将 100 μm 垫垫制成。在垫片之间沉积一滴 20 μL CNT-GelMA 预聚合物溶液，然后翻转 7.3 中获得的玻璃滑块，然后用胶带将其固定在盘子上。
5. 将设备倒置旋转，并将第 2^个照片蒙版放在玻璃幻灯片的顶部。在800 mW的强度和 8 厘米距离下以 200 s 的紫外线照射。
   注:参见图1C。对齐第二个蒙版非常重要。
6. 用DPBS和包括10%胎儿牛血清（FBS）的细胞培养基液清洗获得的脚手架。
7. 在播种细胞之前，将它们留在37°C培养箱中过夜。

8. 新生儿大鼠心肌细胞隔离与培养

1. 根据该研究所动物护理委员会⁸批准的协议，将心脏从2天大的斯普拉格-道利大鼠中分离出。
2. 在HBSS的冷室中，将心脏碎片放在摇摇器上过夜（约16小时），在0.05%胰蛋白酶中，没有EDTA。
3. 用移液器枪收集心脏碎片，尽量减少胰蛋白酶的量，然后将它们放入50 mL管中，管中装有10 mL的温心介质（10%FBS，1%P/S，1%L-谷氨酰胺）。
4. 在 37°C 水浴中缓慢旋转（约 60 rpm），7 分钟。用 10 mL 移液器小心地从管中取出介质，并将心脏片留在管中。
5. 在 HBSS 中加入 7 mL 的 0.1% 胶原酶 2 型，在 37°C 水浴中旋转 10 分钟。
6. 与 10 mL 移液器轻轻混合 10 倍，以扰乱心脏碎片。用 1 mL 移液器从管中取出介质。
7. 在 HBSS 中加入 10 mL 的 0.1% 胶原酶类型 2，在 37°C 水浴中快速旋转（±120~180 rpm），10分钟，然后检查心脏片是否溶解。
8. 与 10 mL 移液器混合，然后用 1 mL 移液器重复以折断最后一块心片。
9. 一旦溶液看起来均匀，将70μm细胞过滤器放在新的50 mL管上，在滤网上一次移液1 mL。
10. 在37°C下，在180 x g下将心脏细胞溶液离心5分钟。
    注:如果仍有一些心脏片或粘液未溶解，请再次重复步骤8.7~8.9。
11. 小心地取出细胞颗粒上方的所有液体，并在2 mL的心脏介质中重新悬浮细胞。
12. 从管壁上小心地加入2 mL的心脏介质，以重新悬浮细胞，避免破裂。
13. 将悬浮细胞加入T175瓶中，加热心脏介质一滴一滴。将烧瓶放入 37°C 培养箱中 1 小时，使心脏成纤维细胞附着在底部。
    注:在此预镀步骤中，心脏成纤维细胞将附着在烧瓶上，而心肌细胞则保持在悬浮介质中。
14. 从装有心肌细胞的烧瓶中收集介质，并将其放入 50 mL 管中。
15. 计数细胞，然后在260 x g下在37°C下离心5分钟。
16. 在步骤 7 中，将细胞重新悬浮在制造软机器人顶部并播种。将心肌细胞以1.95×10⁶细胞/mL的浓度将特定体积的心脏介质滴到设备的整个表面上。
17. 在37°C下孵育样品，在播种后的第一天和第二天用2%FBS和1%L谷氨酰胺用5mL细胞培养基改变培养基。每次介质颜色移动时更改介质。

9. 用于对齐分析的细胞染色

1. 在 RT 下取下介质并用 DPBS 清洗 5 分钟。
2. 在RT处使用4%甲醛（PFA）修复细胞20分钟。然后在 RT 用 DPBS 清洗 5 分钟。
3. 在RT处用0.1%三吨在DPBS中孵育细胞1小时，用PBS在RT处清洗3次5分钟。
4. 在RT的DPBS中用10%山羊血清孵育细胞1小时。
5. 在DPBS中的10%山羊血清中孵育细胞，在4°C为+14~16小时。
6. 在RT处用DPBS洗涤3倍5分钟，在RT的DPBS中用10%山羊血清中的第二次抗体孵育细胞1小时。
7. 在 RT 用 DPBS 洗涤 3 分钟，然后在 DI 水中（1:1，000）中用 4'，6-二甲苯-2-苯胺醇 （DAPI） 对反染色细胞 10 分钟，在 RT. 洗涤 3x 与 DPBS 在 RT 上 5 分钟。
8. 使用倒置激光扫描共聚焦显微镜拍摄荧光图像。

10. 执行器测试和行为评估

1. 软机器人上心肌细胞的自发跳动
   1. 在 37°C 下孵育生物激励执行器 5 天，并在第 1 天和第 2 天以及必要时（即介质变为黄色时）刷新介质。使用倒置光学显微镜每天拍摄图像（5 倍和/或 10 倍）。在收缩活动开始时（通常在第 3 天左右），使用显微镜实时窗口上的视频捕获软件以每秒 20 帧（5 倍和/或 10 倍）的速度记录细胞运动。
   2. 在第 5 天，用盖滑从边缘轻轻提起来分离膜。
      注:如果细胞表现出强烈的跳动行为，膜将自行分离，由于收缩的机械作用。
2. 批量电信号刺激
   1. 使用 3 厘米间距的 PDMS 作为支架，在充满心脏介质的 6 厘米培养皿中用铂 （Pt） 线固定两个碳棒电极。然后小心地将软机器人转移到培养皿中。
   2. 应用脉冲宽度为 50 ms、直流偏移值 0 V 且峰值电压振幅介于 0.5 和 6 V 之间的方波形。频率在 0.5、1.0 和 2.0 Hz 之间变化，占空比分别为 2.5%、5% 和 10%。使用市售摄像机记录宏观收缩。
3. 使用Au微电极的电刺激
   1. 制造Au微电极集成多层水凝胶支架后，使用银浆将两根铜线连接到Au电极外部方形端口。
   2. 用一层薄薄的PDMS在80°C预固化5分钟覆盖银膏。然后将样品置于45°C的热板上5小时，以完全交联PDMS。
   3. 播种心肌细胞后，在具有直流偏移值 1 V、峰值电压振幅介于 1.5 和 5 V 以及频率分别为 0.5、1.0 和 2.0 Hz 的铜线上应用方波电刺激。

结果

开发Au微电极结合生物启发式软机器人的步骤的流程图
软机器人设计的目的是构建一个能够以最小的复杂性推动游泳运动的膜。结构必须能够持续反复的强柔韧性（约1赫兹），并能够保持其形状，同时实现强大的跳动。通过使用光掩膜选择性地将聚合物进行光交联，我们构建了由微图案 PEGDA 水凝胶层、柔性 Au 微电极层和微图案 CNT_GelMA 水凝胶层组成的分层结构支架。图1显示了协议中描述的软机器人制造过程的示意图和实际图像。简单地说，生物启发软机器人有三个主要的制造步骤，嵌入Au微电极:首先，利用第一个光掩膜（图1A，B），通过紫外线交联获得一种微图案PEGDA水凝胶，并结合Au微电极。其次，由Au微电极、微图案CNT-GelMA和PEGDA水凝胶组成的多层结构，由第二光掩膜（图1C）用紫外线交联制成。最后，将心肌细胞植入了构建的三层结构上，为软机器人提供驱动（<...

讨论

使用这种方法，我们能够成功地制造出一个类似巴比的鱼类生物启发软机器人，在多层结构支架上集成了自激活的心脏组织，由嵌入式Au微电极控制。由于由PEGDA和CNT_GelMA水凝胶制成的两种截然不同的微模式水凝胶层，生物激发的脚手架表现出良好的机械稳定性和理想的细胞对齐和成熟。PEGDA图案层作为骨骼结构在刺射线中的软骨关节，为整个机器人身体提供机械支撑。具体来说，它在心脏组织收缩和放松期间保持机械稳定性，同时允许有效跳动，因为它能够在收缩后释放膜张力。此外，微电极（200nm）的纳米厚度及其蛇形图案使其足够灵活，不会阻碍或影响心脏组织的收缩（图2）。为了在水凝胶表面轻松转移微电极而不造成任何破损，Au 微电极在玻璃上制造，没有任何粘附层，如钛，通常用于在玻璃和 Au 之间产生强附着力。同时，CNT-GelMA层，为心肌细胞附着和对准提供支持，其图案垂直于PEGDA水凝胶图案的方向（图3）。成熟后，顶层的心肌细胞为整个支架提供自我驱动。通过结合Au柔性微电极的局部电刺激，我们可以调节机器人的跳动频率，而不会伤害其心脏组织。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
250 mL 烧杯	PYREX	1000-250CNEa
2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮	Sigma-Aldrich	410896
3-（三甲氧基硅烷基）甲基丙烯酸丙酯	Milipore	M6514
37°;水浴	VWR	W6M
4'，6-二脒基-2-苯吲哚 （DAPI）	Sigma-Aldrich	D9542
50mL 锥形离心管	Falcon	14-959-49A
70 µm 细胞过滤器	Falcon	352350
80° 培养箱	VWR	1370GM
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG （H+L）	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG （H+L）	Invitrogen	A11037
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Invitrogen	A12379
抗生素/抗真菌剂解决方案	ThermoFisher Scientific	15240062
抗连接蛋白 43/GJAI 抗体	Abcam	ab11370	兔多克隆
抗肌节 &α;-肌动蛋白	Abcam	ab9465	小鼠单克隆
台式冷冻干燥机	Labconco	77500-00 K
生物安全柜	Sterilgard	A/B3
碳棒电极	SGL Carbon Group	6971105
离心机	Eppendorf	5804
CO2 培养箱	Forma Scientific	3110
胶原酶，II 型，粉末	Gibco	17-101-015
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 880
COOH 功能化碳纳米管	NanoLab	PD30L5-20-COOH
切片机	Giorgio Technology	DAD-321
DMEM，高葡萄糖	Gibco	11-965-118
DPBS，不含钙和镁	Gibco	14-190-144
电子束蒸发器	CHA	57367
胎牛血清	Gibco	10-437-028
明胶	Sigma-Aldrich	G9391	B 型，300 猪皮开花
载玻片	VWR	48382-180
不含钙、镁或酚红的 HBSS	Gibco	14-175-079
倒置光学显微镜	奥林巴斯	CK40
磁性加热板	康宁	PC-420
甲基丙烯酸酐	Sigma-Aldrich	276695	含有 2,000ppm 托潘醇 A 作为抑制剂
Nunc EasYFlask 175cm2	ThermoFisher Scientific	159910
耳镜	Siglent	SDS1052DL+
多聚甲醛水溶液 -16%	电子显微镜科学	15710
PDMS SYLGARD 184	Sigma-Aldrich	761036
Photomask	Mini 微模板公司
铂丝	Alfa Aesar	AA43014BU
聚乙二醇二甲基丙烯酸酯	Polysciences Inc.	15178-100
再生纤维素透析管	Fisherbrand	21-152-14
银环氧树脂胶粘剂	MG Chemicals	8330S
Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统	Millipore	S2GPU02RE
超声波仪	Qsonica	Q500
紫外线固化系统	OmniCure	S2000
涡旋混合器	Scientific Industry	SI-0246A
波形发生器	Agilent	33500B
包装铝箔	Reynolds	N/A