大鼠运动皮层激光诱导脑损伤

摘要

本文介绍了一种建立啮齿类动物脑损伤模型的技术。该方法利用激光照射，以运动皮层为靶区。

摘要

在实验性啮齿类动物模型中诱导脑卒中的常用技术是通过导管对大脑中动脉（MCA）进行短暂性（通常记为MCAO-t）或永久性（记为MCAO-p）阻塞。尽管该技术被广泛接受，但仍存在一些局限性，从而限制了其广泛应用。采用该方法诱导脑卒中常表现出缺血区域位置和大小的高度变异性、出血事件的周期性发生以及较高的死亡率。此外，无论是短暂性还是永久性操作的成功实施均需要专业技术，且通常耗时约30分钟。本方案介绍了一种激光照射技术，可作为在啮齿类动物模型中诱导和研究脑损伤的替代方法。

与对照组和MCAO组的大鼠相比，激光诱导所致的脑损伤在体温、梗死体积、脑水肿、颅内出血及死亡率方面表现出更小的变异性。此外，激光诱导损伤仅对运动皮层的脑组织造成损害，而在MCAO实验中则可观察到运动皮层和纹状体组织均受到破坏。

本研究的结果表明，激光照射可作为一种替代且有效的方法，用于诱导运动皮层脑损伤。该方法还缩短了操作时间，且无需专业操作人员。

引言

在全球范围内，脑卒中是导致死亡的第二大原因，也是导致残疾的第三大原因¹。脑卒中还会导致严重残疾，常常需要医护人员和亲属提供额外照护。因此，有必要深入了解与该疾病相关的并发症，并提高获得更积极预后的可能性。 

使用动物模型是了解疾病的第一步。为了确保最佳的研究结果，理想的模型应具备操作简便、成本低廉、可重复性高以及变异性最小等特点。缺血性脑卒中模型的评价指标包括脑水肿体积、梗死面积、血脑屏障（BBB）破坏程度，以及通常通过神经功能缺损评分来评估的功能障碍²。

在啮齿类动物模型中，最常用的卒中诱导技术是暂时性或永久性阻塞大脑中动脉（MCA）³。该技术所产生的卒中模型与人类卒中相似：具有围绕梗死区域的半暗带，可重复性高，并可调控缺血持续时间和再灌注过程⁴。然而，MCAO 方法存在一些并发症。该技术易导致颅内出血、同侧视网膜损伤以及视觉皮层功能障碍，且常伴随高热，这些因素常引发额外的不良结果^5,6,7。其他局限性还包括所诱导卒中的变异性较大（可能....

方案

以下实验程序遵循欧洲共同体实验动物使用指南进行。本实验亦获得内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。

1. 动物选择与准备

1. 选择65只体重为300至350 g、无明显病理特征的雄性Sprague-Dawley大鼠用于本实验。体型过小会给大脑中动脉阻塞（MCAO）手术带来技术上的困难。
2. 每笼分配3只大鼠，使其适应环境至少3天。

2. MCAO 手术操作

1. 选择25只大鼠进行大脑中动脉阻塞（MCAO）实验，以应对与该操作相关的10—20%死亡率¹¹。
2. 采用标准技术进行大脑中动脉阻塞（MCAO），具体操作步骤如先前文献详细描述¹²。

3. 激光诱导脑损伤实验步骤

1. 将20只大鼠分配至激光组，另20只大鼠分配至对照组（假手术组）。
2. 以50J × 10 点的参数对激光组大鼠进行激光照射，操作步骤如下：
   1. 使用2%异氟烷与氧气混合气体对大鼠进行麻醉，维持自主呼吸。用镊子夹捏尾巴以检查麻醉深度，确认无回缩反射。
   2. 在整个实验过程中，使用直肠温度调控加热垫....

结果

对照组和实验组均未记录到死亡或蛛网膜下腔出血（表1）。MCAO组的死亡率和蛛网膜下腔出血发生率均为20%。

尽管两组大鼠的变异性存在差异，但两组大鼠的相对体温变化也相似（表1）。

与假手术对照组（1 ± 0.3）相比，激光组（16 ± 1.1）和MCAO组（20 ± 1.5）的神经功能缺损评分（NSS）显著更差； 表1；p<0.01).

与假手术对照组相比，激光诱导的脑损伤也导致目标半球的梗死体积显著增加（2.4% ± 0.3 vs 0.5% ± 0.1；表2 和 图1A；Mann-Whitney U 检验，p<0.01）。然而，与MCAO技术相比，激光模型的梗死体积较小（2.4% ± 0.3 vs 9.9% ± 2.9）。

讨论

可以合理地认为，激光技术具有最小的侵入性，因为在激光组中未发生死亡或蛛网膜下腔出血（SAH）。死亡和SAH的主要原因是血管损伤导致颅内压（ICP）升高，这在原始的MCAO技术中已有显示¹⁰。激光组中未出现死亡和SAH，可能是由于激光的特定作用：激光不会直接损伤血管，并且在发生渗漏时可诱导凝血。较小的梗死体积和脑水肿也有助于将死亡风险降至最低。鉴于传统的MCAO技术在诱发卒中（无论是暂时性还是永久性）时已被证实会导致死亡和SAH⁶，因此使用激光应被视为一种能够以最少不良结局诱导脑损伤的适宜技术。

激光组中发现的低体温现象表明，激光技术不会像传统的MCAO那样阻塞调节体温的下丘脑动脉⁷，这支持了激光技术具有更高靶向性的理论。各项参数的整体变异性较低，说明使用激光诱导脑损伤具有良好的一致性，但这种精确结果在很大程度上依赖于功率的选择。适当的功率可达到理想效果，而功率过低或过高则可能导致作用不足或过度，无论哪种情况均会产生不利影响。尽管如此，由于该.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	SIGMA - ALDRICH	298-96-4
50% 三氯乙酸	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
大脑 &与组织基质	SIGMA - ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604×10¹¹
Sigma 2-16P 离心机	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
紧凑型分析天平	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
电子天平	SIGMA - ALDRICH	4,000 卢比
解剖剪	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf 移液器	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf 管	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
乙醇 96 %	ROMICAL		易燃液体
伊文思蓝 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
荧光检测器	Tecan, Männedorf 瑞士	Infinite 200 PRO 多功能酶标仪
带温度计的加热器	加热板-1	型号：HEATINGPAD-1/2
输注袖带	ABN	IC-500
异氟烷，USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
多集合	TEVA 医药	998702
奥林巴斯 BX 40 显微镜	Olympus
光学扫描仪	佳能	Cano Scan 4200F
培养皿	SIGMA - ALDRICH	P5606
11号手术刀片	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG（掺钕钇铝石榴石）激光仪	Laser Industries Ltd
立体定位头架	KOPF	900LS
无菌注射器 2 ml	布劳恩	4606027V
27 G 注射器针头	布劳恩	305620