本文介绍了一种建立啮齿类动物脑损伤模型的技术。该方法利用激光照射，以运动皮层为靶区。
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摘要
摘要
在实验性啮齿类动物模型中诱导脑卒中的常用技术是通过导管对大脑中动脉（MCA）进行短暂性（通常记为MCAO-t）或永久性（记为MCAO-p）阻塞。尽管该技术被广泛接受，但仍存在一些局限性，从而限制了其广泛应用。采用该方法诱导脑卒中常表现出缺血区域位置和大小的高度变异性、出血事件的周期性发生以及较高的死亡率。此外，无论是短暂性还是永久性操作的成功实施均需要专业技术，且通常耗时约30分钟。本方案介绍了一种激光照射技术，可作为在啮齿类动物模型中诱导和研究脑损伤的替代方法。
与对照组和MCAO组的大鼠相比，激光诱导所致的脑损伤在体温、梗死体积、脑水肿、颅内出血及死亡率方面表现出更小的变异性。此外，激光诱导损伤仅对运动皮层的脑组织造成损害，而在MCAO实验中则可观察到运动皮层和纹状体组织均受到破坏。
本研究的结果表明，激光照射可作为一种替代且有效的方法，用于诱导运动皮层脑损伤。该方法还缩短了操作时间，且无需专业操作人员。
引言
在全球范围内，脑卒中是导致死亡的第二大原因，也是导致残疾的第三大原因1。脑卒中还会导致严重残疾，常常需要医护人员和亲属提供额外照护。因此，有必要深入了解与该疾病相关的并发症，并提高获得更积极预后的可能性。
使用动物模型是了解疾病的第一步。为了确保最佳的研究结果，理想的模型应具备操作简便、成本低廉、可重复性高以及变异性最小等特点。缺血性脑卒中模型的评价指标包括脑水肿体积、梗死面积、血脑屏障（BBB）破坏程度，以及通常通过神经功能缺损评分来评估的功能障碍2。
在啮齿类动物模型中，最常用的卒中诱导技术是暂时性或永久性阻塞大脑中动脉（MCA）3。该技术所产生的卒中模型与人类卒中相似：具有围绕梗死区域的半暗带，可重复性高，并可调控缺血持续时间和再灌注过程4。然而，MCAO 方法存在一些并发症。该技术易导致颅内出血、同侧视网膜损伤以及视觉皮层功能障碍，且常伴随高热，这些因素常引发额外的不良结果5,6,7。其他局限性还包括所诱导卒中的变异性较大（可能由于缺血扩展至非目标区域，如颈外动脉区域）、MCA 阻塞不完全以及过早再灌注。此外，不同品系和体型的大鼠表现出不同的梗死体积8。除上述所有缺点外，MCAO 模型无法在深部脑区诱导小而孤立的卒中，因其在技术上受限于导管插入所需的最小血管尺寸。这使得开发替代模型的需求尤为迫切。另一种方法——光化学血栓法，可作为 MCAO 的一种潜在替代方案，但在效率方面并未显著改善9。该技术利用光照靶向诱导卒中，相较于先前模型有一定改进。然而，光化学血栓法需要进行侵入性开颅手术，可能引发继发性并发症9。
鉴于上述局限性，本文介绍了一种可用于在啮齿类动物中诱导脑损伤的可行替代性激光技术。该激光技术的作用机制基于激光对活体组织产生的光热效应，即生物组织吸收光束并将其转化为热能。使用激光技术的优势在于其安全性和操作简便性。激光能够产生热量以止血，这使其在医学领域具有重要意义；同时，激光能够在特定交汇点放大不同光束的特性，确保其避免破坏周围健康的组织 方式 的 靶点10本方案中使用的激光束能够穿过低液体介质（如骨骼）而不释放其能量或造成任何损伤。一旦到达高液体介质（如脑组织），便会耗尽其能量以破坏目标组织。因此，该技术仅可在脑部特定区域诱导脑损伤。
本文介绍的技术在调节照射剂量方面表现出极强的能力，能够产生从最初设计时就预定的脑损伤程度变化。与影响皮层和纹状体的原始MCAO方法不同，该激光技术能够调控脑损伤的影响范围，仅在目标运动皮层诱导损伤。本文提供了激光诱导脑损伤的操作方案，以及在大鼠大脑皮层实施该操作的代表性结果概要。
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方案
以下实验程序遵循欧洲共同体实验动物使用指南进行。本实验亦获得内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。
1. 动物选择与准备
- 选择65只体重为300至350 g、无明显病理特征的雄性Sprague-Dawley大鼠用于本实验。体型过小会给大脑中动脉阻塞（MCAO）手术带来技术上的困难。
- 每笼分配3只大鼠，使其适应环境至少3天。
2. MCAO 手术操作
- 选择25只大鼠进行大脑中动脉阻塞（MCAO）实验，以应对与该操作相关的10—20%死亡率11。
- 采用标准技术进行大脑中动脉阻塞（MCAO），具体操作步骤如先前文献详细描述12。
3. 激光诱导脑损伤实验步骤
- 将20只大鼠分配至激光组，另20只大鼠分配至对照组（假手术组）。
- 以50J × 10 点的参数对激光组大鼠进行激光照射，操作步骤如下：
- 使用2%异氟烷与氧气混合气体对大鼠进行麻醉，维持自主呼吸。用镊子夹捏尾巴以检查麻醉深度，确认无回缩反射。
- 在整个实验过程中，使用直肠温度调控加热垫维持大鼠核心体温在37 °C。
- 使用剃毛器去除局部毛发，并用70%酒精和0.5%葡萄糖酸氯己定进行消毒。重复消毒步骤两次。
注：手术切口大小应约为3 cm。切口周围至少2 cm范围内的毛发均应去除。 - 将大鼠以俯卧位固定于立体定位仪头部固定装置上，做一条3 cm长的切口，将头皮向侧方翻起，暴露前囟（Bregma）与后囟（Lambda）之间的区域。
- 通过鼻罩持续维持麻醉状态。
- 使用掺钕钇铝石榴石（Nd-YAG）激光器（峰值波长1064 nm），在右侧大脑半球颅骨暴露区域进行照射，参数为50J × 10 点，脉冲持续时间为1 s。
- 确保激光装置的激光发射端距离暴露区域2 mm，以形成激光束。50J × 10 点的参数是经过对不同能量/面积组合仔细评估后选定的。该组合效率较高，且在照射时间少于1秒时不会导致颅骨骨质破坏10。
注：2 mm指激光束末端（即激光通过光纤后输出端）与颅骨之间的距离。若使用聚焦透镜，应根据透镜的倾斜角度计算距离，以确保激光束聚焦于目标损伤区域。使用激光设备时须确保安全，包括接受适当培训并佩戴眼部防护装置。 - 将大鼠从装置中取出，使用3-0丝线外科缝合线缝合头皮。
- 停止麻醉，将大鼠放回笼中恢复。手术结束后立即局部注射0.1 mL 0.25%布比卡因，以减轻术后疼痛。
注：若操作正确，整个过程应少于5分钟。
- 观察大鼠在麻醉后恢复期间是否有任何痛苦迹象。在大鼠苏醒前，给予0.01 mg/kg肌内注射布伦诺啡以进行术后镇痛，并每12小时重复给药一次，至少持续48小时。
- 对照组大鼠接受相同处理，但不进行激光照射。
4. 神经系统严重程度评分（NSS）
- 在激光诱导脑损伤后24小时，使用43分制神经功能缺损评分评估神经功能严重程度13。对动物进行神经功能缺损、行为异常、平衡木实验和反射测试，根据功能障碍的严重程度赋予更高的评分，具体评分方法此前已有详细描述13。
5. 损伤后操作
- NSS评估后，通过吸入20%氧气和80% CO2对大鼠实施安乐死，并用肝素化磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.9% NaCl）进行心脏灌注。
注意：确保 CO2 根据机构动物护理和使用委员会指南，以预定速率给药。此步骤也可在5%异氟烷麻醉下进行。 - 收获脑组织并按照先前的实验方案进行后续处理11.
- 通过肉眼检查从颅骨中分离出的完整脑组织来评估蛛网膜下腔出血（SAH）。如有必要，可使用显微镜或放大镜进行观察。
6. 脑损伤的评估
- 通过 TTC 染色测定脑梗死体积和脑水肿
注意：2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色是一种用于检测脑梗死的简便方法11。- 将获取的脑组织切成6个冠状切片，每个厚度为2 mm。
- 将每只动物脑组织的切片组在0.05% TTC溶液中于37 °C孵育30分钟。
- 染色后，使用分辨率为1600 × 1600 dpi的光学扫描仪对切片进行扫描。
- 固定后的脑切片中未染色区域定义为梗死区域12。
- 使用图像处理软件（例如免费软件 Image J）测量每个冠状切片的未染色梗死面积以及同侧和对侧半球面积。
- 将梗死体积计算为全脑体积的百分比：
- 使用Kaplan方法计算脑水肿：
- 测定血脑屏障（BBB）破坏程度
注意：在激光诱导脑损伤后24小时，按以下步骤评估血脑屏障破坏情况：- 通过插管尾静脉向大鼠静脉注射2%伊文思蓝与4 mL/kg生理盐水的混合液，并使其循环1小时。
- 在最后一次NSS处理后24小时，如前所述13，通过吸入20%氧气和80% CO2对大鼠实施安乐死。
- 按以下步骤收集血管内定位的染料：
- 使用手术镊子和手术剪打开大鼠胸腔。
- 通过左心室以110 mmHg压力灌注冷却的0.9%生理盐水，直至右心房流出液变为无色。
- 取出脑组织，并沿前后方向切成2 mm厚的切片。
- 将左侧脑切片与右侧部分分离，以便分别评估受损和未受损半球。
- 称重后，使用研钵和研杵匀浆，然后将脑组织在50%三氯乙酸中孵育24小时。
- 将匀浆后的脑切片在10,000 × g 条件下离心20分钟。
- 取1 mL离心后的上清液与1.5 mL 96%乙醇按1:3比例混合，使用荧光检测仪在激发波长620 nm（带宽10 nm）、发射波长680 nm（带宽10 nm）条件下检测血脑屏障破坏情况。
注意：两组大鼠均采用相同方案测定血脑屏障破坏。
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结果
对照组和实验组均未记录到死亡或蛛网膜下腔出血（表1）。MCAO组的死亡率和蛛网膜下腔出血发生率均为20%。
尽管两组大鼠的变异性存在差异，但两组大鼠的相对体温变化也相似（表1）。
与假手术对照组（1 ± 0.3）相比，激光组（16 ± 1.1）和MCAO组（20 ± 1.5）的神经功能缺损评分（NSS）显著更差； 表1；p<0.01).
与假手术对照组相比，激光诱导的脑损伤也导致目标半球的梗死体积显著增加（2.4% ± 0.3 vs 0.5% ± 0.1；表2 和 图1A；Mann-Whitney U 检验，p<0.01）。然而，与MCAO技术相比，激光模型的梗死体积较小（2.4% ± 0.3 vs 9.9% ± 2.9）。
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讨论
可以合理地认为，激光技术具有最小的侵入性，因为在激光组中未发生死亡或蛛网膜下腔出血（SAH）。死亡和SAH的主要原因是血管损伤导致颅内压（ICP）升高，这在原始的MCAO技术中已有显示10。激光组中未出现死亡和SAH，可能是由于激光的特定作用：激光不会直接损伤血管，并且在发生渗漏时可诱导凝血。较小的梗死体积和脑水肿也有助于将死亡风险降至最低。鉴于传统的MCAO技术在诱发卒中（无论是暂时性还是永久性）时已被证实会导致死亡和SAH6，因此使用激光应被视为一种能够以最少不良结局诱导脑损伤的适宜技术。
激光组中发现的低体温现象表明，激光技术不会像传统的MCAO那样阻塞调节体温的下丘脑动脉7，这支持了激光技术具有更高靶向性的理论。各项参数的整体变异性较低，说明使用激光诱导脑损伤具有良好的一致性，但这种精确结果在很大程度上依赖于功率的选择。适当的功率可达到理想效果，而功率过低或过高则可能导致作用不足或过度，无论哪种情况均会产生不利影响。尽管如此，由于该...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢索罗卡大学医学中心麻醉科以及内盖夫本-古里安大学实验室工作人员在本实验实施过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 | SIGMA - ALDRICH | 298-96-4 | |
| 50% 三氯乙酸 | SIGMA - ALDRICH | 76-03-9 | |
| 大脑 &与组织基质 | SIGMA - ALDRICH | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 1.83604×10¹¹ | |
| Sigma 2-16P 离心机 | SIGMA - ALDRICH | Sigma 2-16P | |
| 紧凑型分析天平 | SIGMA - ALDRICH | HR-AZ/HR-A | |
| 电子天平 | SIGMA - ALDRICH | 4,000 卢比 | |
| 解剖剪 | SIGMA - ALDRICH | Z265969 | |
| Eppendorf 移液器 | SIGMA - ALDRICH | Z683884 | |
| Eppendorf 管 | SIGMA - ALDRICH | EP0030119460 | |
| 乙醇 96 % | ROMICAL | 易燃液体 | |
| 伊文思蓝 2% | SIGMA - ALDRICH | 314-13-6 | |
| 荧光检测器 | Tecan, Männedorf 瑞士 | Infinite 200 PRO 多功能酶标仪 | |
| 带温度计的加热器 | 加热板-1 | 型号：HEATINGPAD-1/2 | |
| 输注袖带 | ABN | IC-500 | |
| 异氟烷，USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 | |
| 多集合 | TEVA 医药 | 998702 | |
| 奥林巴斯 BX 40 显微镜 | Olympus | ||
| 光学扫描仪 | 佳能 | Cano Scan 4200F | |
| 培养皿 | SIGMA - ALDRICH | P5606 | |
| 11号手术刀片 | SIGMA - ALDRICH | S2771 | |
| Sharplan 3000 Nd:YAG（掺钕钇铝石榴石）激光仪 | Laser Industries Ltd | ||
| 立体定位头架 | KOPF | 900LS | |
| 无菌注射器 2 ml | 布劳恩 | 4606027V | |
| 27 G 注射器针头 | 布劳恩 | 305620 |
参考文献
- World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, Geneva. (2014).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats
Posted by JoVE Editors on 2/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Dmitri Frank
to
Dmitry Frank
