Summary
与传统RT-PCR技术相比，我们提出了一种RT-LAMP测定方法，用于在相对较短的时间内使用简单的仪器检测罗非鱼中的TiLV。该议定书可能有助于控制TiLVD的流行传播，特别是在发展中国家。
Abstract
罗非鱼湖病毒病（TiLVD）是罗非鱼湖病毒（TiLV）引起的罗非鱼病毒病，是水产养殖业的一个长期挑战，导致世界许多地区罗非鱼的大规模发病率和死亡率。因此，有必要对TiLV感染进行有效、快速和准确的诊断检测，以检测最初的感染并防止该病在水产养殖中传播。本研究提出了一种高度灵敏、实用的逆转录环介导的等温放大（RT-LAMP）方法，以检测鱼组织中的罗非鱼湖病毒。对受感染样本的RT-qPCR和RT-LAMP检测的比较显示，63（100%）有阳性结果和 51 （80.95%）样本。此外，对未感染样本的分析表明，所有63个未受感染组织均对RT-qPCR和RT-LAMP检测均产生阴性结果。使用RT-LAMP评估了罗非鱼中5种病原体的交叉反应，所有测试均显示阴性结果。从受感染的鱼获得的肝脏和粘液样本均显示使用RT-LAMP方法的可比结果，表明粘液可用于RT-LAMP作为非致命性检测，以避免杀死鱼。结果表明，该检测结果表明，在1小时内对罗非鱼组织进行TiLV检测提供了一种有效的方法。因此，该方法推荐作为农场的筛选工具，用于快速诊断TiLV。
Introduction
罗非鱼湖病毒病（TiLVD）是罗非鱼病毒性疾病，据说在世界许多地区，包括亚洲1、2、2非洲和美国，导致罗非鱼死亡。1该病于2009年在以色列罗非鱼大规模死亡期间首次得到确认，金内雷特湖的野生罗非鱼数量从每年257吨急剧下降到8吨。这种疾病是由罗非鱼湖病毒（TiLV）引起的，该病毒已被分配给安农韦里达家族作为一种新的属罗拉平病毒和新物种罗非鱼罗拉平病毒3。TiLV的基因特征表明，该病毒是一种新型的包络、负感、单链RNA病毒，具有10个片段编码10个蛋白质1,1、2、4。,4各种品种的罗非鱼属萨罗罗罗登，奥利奥米米，和提拉平和其他温水鱼（如，巨型葫三（奥斯罗莫斯戈拉米）已被证明易受TiLV22，5。5目前，这种病毒继续在全球传播，可能通过受感染的活鱼66，77的运动，而通过冷冻罗非鱼或其产品传播病毒的风险是有限的8。由于TiLV感染造成的大量死亡率有可能对罗非鱼行业产生重大有害的经济影响。例如，埃及夏季死亡率综合征与TiLV感染有关的经济影响计算为1亿美元。因此，必须开发一种快速和适当的诊断方法，以促进在养鱼场控制这种疾病。
到目前为止，TiLVD的诊断一直基于分子检测、病毒隔离和组织病理学。不同的PCR协议和引素已经开发为TiLV诊断10，11。10,例如，一种基于SYBR的绿色反向转录定量PCR（RT-qPCR）方法，其检测灵敏度为仅两个拷贝/μL，用于TiLV检测10。其他用于TiLV检测的PCR方法包括TaqMan定量PCR11、RT-PCR2、嵌套RT-PCR12和半嵌套11RT-PCR13。1213然而，这些方法需要先进的实验室设备和相对较长的时间来产生结果，由于反应的复杂性，这使得它们不适合现场应用。
循环介导的等温放大（LAMP）测定是一种快速、简单、实用的场内应用14、15。14,该技术采用绞线位移反应原理，而扩增反应在等温条件下运行，没有复杂和昂贵的热循环器14，15。14,因此，放大的LAMP产品或RT-LAMP产品在阶梯状带中进行分析，使用加糖凝胶电泳，带有荧光染色，以安全可视化DNA或RNA14，或用肉眼观察是否存在浊度或白色沉淀物16、17、18。,17,18由于这些原因，该技术已用于现场检测不同的鱼类病原体17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27本研究的目的是建立一个快速，敏感和准确的RT-LAMP检测的TiLV检测。RT-LAMP测定在30分钟内提供鱼样中TiLV的筛选。该技术可应用于TiLVD的诊断和监测。
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Protocol
这项涉及使用动物组织的实验，得到了泰国曼谷卡塞萨特大学机构动物护理和使用委员会的批准（协议号为ACKU61-VET-009）。
1. 组织收集
- 使用过量的丁香油（即超过3 mL/升）对罗非鱼进行安乐死。三氯苯甲烷硫化剂可用作丁香油的替代品。
- 使用无菌的梅奥剪刀和钳子切开死后罗非鱼的腹部，切除约30-50毫克的肝脏组织，或使用显微镜盖玻璃，通过纵向刮鱼皮层（从前到后）到1.5mL微离心管收集100μL粘液。
- 立即进入RNA提取步骤，或将采集的样品保持在+80°C，直到实验。由于完整的RNA比DNA更敏感，因此在RNA提取过程中使用无RNase材料和试剂。
2. RNA 提取
- 要从肝脏组织中提取RNA，将30~50毫克的罗非鱼组织加入1.5mL微离心管中，该管含有600~1000μL的亚硫酸-苯酚萃取试剂（材料表），然后用手持组织均质器粉碎样品，直到均匀化。组织样本需要大约10%的硫酸-苯酚萃取试剂。对于粘液样品，仅使用300μL的硫酸-苯酚萃取试剂（3：1）。
注意：甲酸-苯酚萃取试剂有毒;因此，处理必须谨慎进行。必须佩戴安全眼镜、实验室长袍和安全手套等防护设备。 - 在室温下将均质样品在 10，000 x g下 30 s 进行离心机，并将上清液转移到新的无菌 1.5 mL 微离心管中。
- 在管子中加入95%乙醇的同等体积，搅拌均匀。
- 将溶液转移到一个自旋柱（材料表），放置在收集管和离心机在10，000 x g在室温下30s。丢弃流通，并将旋转柱传输到新的收集管。
- 在室温下，在10，000 x g下加入400 μL的RNA预洗试剂（材料表），在30s下在30s下离心。再次重复此步骤。
注：要制备RNA预洗涤，将10 mL的95%乙醇加入40 mL的RNA预洗涤浓缩物。 - 在室温下，将700μL的RNA洗涤缓冲液（材料表）添加到柱中，并在10，000 x g下离心2分钟。将柱转移到无菌的 1.5 mL 微离心管中。
注：要制备RNA洗涤缓冲液，在RNA洗涤缓冲液浓缩物的12 mL中加入52 mL的95%乙醇。 - 在旋转柱基质中捕获的RNA样品，在室温下用100 μL的无核酸酶和离心机在10，000 x g下30s。
- 使用微量分光光度计测量提取的RNA的浓度，并使用无核酸酶将RNA稀释到所需的浓度。
注：OD260/OD280 的合格吸收值范围从 1.6 到 1.9，指示 RT-LAMP 测定可接受的 RNA 纯度。 - 立即继续下一步，或将样品保持在 +80°C，直到使用为止。
3. 引素设计
- 使用引版资源管理器版本 4 设计 RT-LAMP 的特定引版。转到网站，https://primerexplorer.jp/e/，然后单击 PrimerExplorer V4 按钮。
- 选择包含 FASTA 格式的 TiLV 段 3 序列的文件，然后单击"引版设计"按钮。
注： 从 GenBank 加入编号 KX631923 检索 FASTA 格式的序列，该编号表示罗非鱼湖病毒 TV1 段 31。 - 要设计引素，输入以下基本参数：
- GC 含量为 40%~60%
- 280 对碱基对的安培（bp）
- 底漆中相似熔融温度 （Tm），最大差值为 5 °C
注：引信不能相互补充- 避免序列区域容易形成二次结构。
- 选择最小 ±3.5 的二角底漆分析，以获得最佳 μG 的最佳设计，并选择最大 +4 的底漆端，以便为较小的 μG 设计最佳设计。
- 单击"生成"按钮。
注： 软件完成输入数据处理后，将显示引信结果（图 1）。
4. RT-LAMP测定
- 制备RT-LAMP主混合物，含有2.5μL的1x SD II反应缓冲液，3 μL的64mM MgSO 4，1.4 μL的1.4 mM dNTP集，4 μL的0.8M贝塔因，1.3 μL0.052m卡辛混合物，1 μL 1.6μM TiLV-F3底漆， 1 μL 1.6 μM TiLV-B3 底漆，1 μL 0.2 μM TiLV-BIP 底漆，1 μL 0.2 μM TiLV-FIP 底漆，1 μL 0.3 U Bst DNA 聚合酶，1 μL 0.1 U AMV 逆转录酶，以及 3.8 μL 无核酸酶水。
注：准备至少占总反应量10%的过量主混合物。 - 将 RT-LAMP 主混合物的 22 μL 分配到无菌的 1.5 微离心管中。
- 在反应管中加入3μL的提取RNA，并通过涡旋混合样品。对于负控制，使用蒸馏水代替RNA材料。
- 在65°C下孵育反应60分钟，然后80°C10分钟终止反应。
- 孵育后，用肉眼目视观察色度变化。阳性结果将显示为荧光绿色。
5. 阿加罗斯凝胶电泳
- 通过在 40 mL 的 1x TAE 缓冲液中悬浮 0.6 g 的琼脂粉，制备 1.5% 的 a/v 琼脂糖凝胶。在微波炉中加热3~5分钟，直到琼脂完全溶解，然后旋转混合混合物，将混合物熔化。
- 让琼脂冷却，直到温度达到 65 °C。将 40 mL 的琼脂溶液倒入凝胶托盘，并在凝胶模具中加入梳子。
- 让琼脂胶在室温下设置 20~30 分钟，直到完全凝固。然后取出梳子，将凝胶放入凝胶罐中。
- 添加运行缓冲液以覆盖凝胶罐中的凝胶表面。
- 将 RT-LAMP 样品的 10 μL 和 2 μL 的 6x 凝胶加载缓冲液添加到每个井中。将 5 μL 的 1 kb DNA 梯级添加到参考通道。
- 插入连接到阴极和连接到电源的阳极的盖子。打开电源，将其设置为恒定 100 V，然后运行 40 分钟。
- 完成凝胶分离后，从凝胶托盘中取出凝胶。然后用溴化二苯（EtBr）浓度在10mg/mL的浓度下染色排空凝胶7分钟，并将其留在蒸馏水中5分钟。
注意：EtBr是有毒的，被认为是一种致癌物质;因此，使用此代理时要小心。 - 使用带子出现的凝胶文档系统将凝胶暴露在紫外线下，并拍摄凝胶的照片。
6. 补充DNA（cDNA）合成
- 制备含有2 μL 5x RT缓冲液、0.5 μL底漆混合物、0.5 μL RT酶和2 μL无核酸酶的cDNA合成主混合物。
注：准备多余的主混合物，包括1倍的反应，由于潜在的损失在移液期间。 - 将5μL的主混合物分配到无菌的1.5mL微离心管中。
- 将稀释后的提取RNA（从步骤2.8获得）的100纳克加入反应管，混合并向下旋转，将所有混合物移到容器底部。
- 在42°C下孵育反应60分钟，随后在PCR机器中孵育98°C5分钟。将 cDNA 储存在 +20 °C，直到使用。
7. RT-qPCR
- 制备含有0.3 μL 10μM反向底漆、0.3 μL 10 μM正向底漆、5 μL 2x SYBR绿色DNA聚合酶和0.4 μL无核酸酶水的TiLV qPCR主混合物。使用以下引素和控件：
前进引物（TiLV-112F）：5'-CTGAGCTAGAGATGGATT-3'
反向引物 （TiLV-112R）： 5'-CGGCGTACTTTAGTCTCT-3' - 将 TiLV qPCR 主混合物的 6 μL 分配到与所用实时热循环器兼容的 qPCR 条的每个井中。
- 加入4 μL的cDNA模板，负对照（无核酸酶），正控制（10 pg/μL），和pTiLV（质粒）10或连续稀释的TiLV质粒到井中，并通过轻拂混合每个样品。以三脚三联的方式执行每个样品。
- 将 qPCR 反应放入编程的实时热循环器中。将qPCR程序设置为在95°C下进行孵育3分钟，然后40个周期95°C，10 s和60°C，在熔融曲线步骤之前，温度需要在0.5°C/5的增量下从65°C增加到95°C。
- 通过评估放大曲线和熔融曲线进行数据分析，然后使用序列稀释的质粒从数据中获取的标准曲线计算 TiLV 拷贝的数量。
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Representative Results
在这项研究中，开发了RT-LAMP检测，以检测罗非鱼的TiLV感染。2015年至2016年间，从泰国不同地区的14个农场采集了经测试的样本。受感染和未感染的鱼主要根据身体诊断和有症状的TiLVD的出现进行分组。TiLV感染随后在收集过程后使用RT-PCR得到确认。选择阿加罗斯凝胶电泳和发光绿色检测作为LAMP安培的评估方法（图2）。受感染和未感染的罗非鱼的肝脏和粘液的特点是TiLV疾病症状的临床出现，包括皮肤侵蚀、皮肤发红、外皮和腹部肿胀。以前的报告已经证明，在分子诊断检测中使用肝脏样本来确定存在TiLV35。或者，粘液在测定中可能是有益的，因为它可以帮助避免杀死动物。结果显示，受感染鱼类的肝脏和粘液样本中具有阶梯状DNA带图案和荧光绿色（图2），未在未受感染动物组织的RT-LAMP混合物中未观察到DNA带和黄黄黄（图2）。有趣的是，从马来西亚的一个农场采集的受TiLV感染的罗非鱼样本也被诊断为使用这种RT-LAMP测定呈阳性;然而，观察到PCR产品与从泰国当地农场采集的样本相比，其尺寸存在差异（图2）。
为了验证RT-LAMP测定的敏感性和特异性，使用RT-LAMP和RT-qPCR测定共分析了63个受TiLV感染组织和63个未受感染组织（表1）。对受感染样本的RT-qPCR和RT-LAMP检测的比较显示，63（100%）呈阳性。和 51 （80.95%）样本的分别。此外，对未感染样本的分析表明，所有63个未受感染组织均使用RT-qPCR和RT-LAMP测定结果均为阴性（表1）。该分析证明了RT-LAMP检测用于初级TiLV检测的可靠性。为了测试RT-LAMP测定的特异性，从感染了其他致病菌和病毒的鱼类组织，包括链球菌和病毒，包括链球菌腺炎，弗朗西斯菌诺图尼西斯，弗拉沃菌柱，阿罗莫纳斯水亲病，和伊里多病毒被用作RT-LAMP和RT-qPCR分析的模板。RT-LAMP和RT-qPCR底漆均产生阴性结果，没有色度变化，在任何被测试样品中没有荧光信号（表2）。此外，使用从受TiLV感染的鱼类中提取的RNA模板的连续10倍稀释，评估了RT-LAMP测定的敏感性。相比之下，RT-qPCR测定比RT-LAMP测定更敏感，因为RT-qPCR测定的检测极限为10-8，而RT-LAMP方法需要10-7倍稀释才能检测TiLV基因组（表2）。
图 1.本研究中使用的六种RT-LAMP底漆的核苷酸序列是专门用于检测TiLV的。每个引底器的位置在TiLV基因组的第3段（加入编号KX631923）上对齐。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2.通过荧光可视化，分析从1.5%阿加罗斯凝胶电泳和（B）中从TiLV感染和未感染的样品（A）中获得的RT-LAMP安培。M = 1 kb DNA 梯子，1⁄2 = 来自受 TiLV 感染的鱼肝的 RNA，3⁄4 = 受 TiLV 感染的鱼的 cDNA，5⁄6 = 来自受 TiLV 感染的鱼粘液的 RNA， 7+8 = 受TiLV感染的鱼的细胞系，9 = 来自TiLV感染鱼类肝脏的RNA（马来西亚），10 = 非TiLV感染鱼类肝脏的RNA，11 = 非TiLV感染鱼类的cDNA，12 = 非TiLV感染鱼类的粘液的RNA，13 = 无模板控制，请点击这里查看此图的较大版本。
| 样本类型 | 样本数 | 检测有效性 （%） | |
| RT-qPCR | RT-LAMP | ||
| 受感染的样本 | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| 未感染样本 | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
表1.使用RT-qPCR和RT-LAMP验证RT-LAMP在受感染和未受感染的鱼样本中检测TiLV
| 特 异性 | S.a. | F.n. | F.c. | A.h. | 注射。 | |||||
| qPCR | 灯 | qPCR | 灯 | qPCR | 灯 | qPCR | 灯 | qPCR | 灯 | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| 灵敏度 | 方法/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| 稀释 | ||||||||||
| qPCR | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| 灯 | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
表2.与RT-qPCR相比，RT-LAMP测定的特异性和灵敏度。对于特异性评估，从感染其他细菌或病毒的鱼组织中获得的RNA，包括链球菌腺炎（S.a.）、弗朗西斯拉诺阿图尼西斯（F.n.）、弗拉沃菌柱（F.c.）、航空水亲病（A.h.）和伊里多病毒（I.v.），被用作RT-qPCR和RT-LAMP的模板。在敏感性评估中，从受TiLV感染的鱼类获得的RNA从100 ng连续稀释10倍至1fg，并用作RT-qPCR和RT-LAMP的模板。* 和 # 符号分别表示正和负结果。
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Discussion
水产养殖业不断受到病毒感染的威胁，造成直接经济损失99、23、28。23,28例如，世界上许多地区的罗非鱼生产国对罗非鱼生产国构成重大1,6,威胁。到目前为止，还没有特定的治疗药物可用于预防TiLVD。虽然疫苗的开发正在进行中，但高效疫苗在可用于商业目的之前将需要大量时间。鉴于这些情况，在养鱼场必须进行严格的生物安全测量，例如使用消毒剂，以防止TiLVD29、30,30的传播。目前，减少TiLV传播的最有效控制措施之一是筛查幼鱼和成人是否存在TiLV31。出于筛查目的，诊断工具需要快速、灵敏和具体，以便有助于消除受感染人群并防止疾病的进一步传播。然而，目前对TiLV的分子测定很难在现场实施。首先，他们需要熟练的研究人员和昂贵的设备。其次，可能需要几天时间才能获得实验室结果，这使得疾病难以及时控制和,预防传播。
为了克服这些问题，Notomi等人14于2000年建立了一种新的核酸基扩增测定，称为循环介导等温放大（LAMP）。自该反应成功应用于,16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、32、33、34,17等多种鱼类病毒的检测中。,18,19,20,21,22,23,24,2526,32,33,34在这项研究中，我们开发了一种RT-LAMP协议来检测罗非鱼样品中的TiLV。虽然RT-LAMP方法的灵敏度比RT-qPCR低10倍，但RT-LAMP检测可以检测存在低至100 fg的TiLVRNA基因组，这足以在临床病害鱼类34中检测TiLV。值得注意的是，RT-LAMP测定在60分钟内产生结果，只需要一个简单的水浴或热块仪器34，而RT-qPCR测定需要更多的时间，需要更昂贵的实时PCR设备进行分析15，34。,34此外，通过荧光染料的颜色从浅黄色变为荧光绿色，观察到RT-LAMP的最终产物，使得肉眼可见，无需任何精密设备34。这些优点使RT-LAMP适合现场诊断。此外，研究结果还表明，肝脏和粘液都可用于使用RT-LAMP进行TiLV检测。与以前的研究类似，使用粘液的非致命样本允许在不杀死鱼或有价值的育雏35的情况下诊断TiLV。最近，开发了一种RT-LAMP测定，用于检测中国和泰国在1段（S1区域）中分离的TiLV核苷酸序列，使用一组6个引物36。本研究表明，与使用相同底漆集的RT-PCR相比，开发的RT-LAMP测定诊断出TiLV感染的假阴性信号为27.78%。进一步比较，与RT-PCR相比，检测TiLV段3时，假阴性结果相对较少，为19.05%。在比较病毒检测方法的效率与其他报告时，我们以80.95%的感染率检测出TiLV感染，而其他工程则以72.22%36%和3682.89%37检测37出病毒。总之，可以推测RT-LAMP测定的不同成分，例如，不同的引底器集和TiLV基因组的不同靶段是影响测定有效性的重要因素。
虽然RT-LAMP测定是一个强大的工具，疾病筛查，并有几个明显的好处，这项研究并非没有限制。RT-LAMP 测定的关键点之一是设计一个适当的引漆集，包括四到六个引漆。为了促进PCR产物的茎环结构的形成，靶向基因或核苷酸序列的适当长度需要长到500bp左右，而RT-PCR测定的目标基因必须相对较短，范围为50-150 bp 14、38、39。14,38,39
总之，开发的RT-LAMP测定是快速，成本效益，敏感，特定于TiLV检测。与 RT-qPCR 测定的 4-5 小时相比，分析可在 1 小时内完成。值得注意的是，RT-LAMP测定对于现场条件是实用的，因为可以用肉眼观察阳性结果，而无需使用精密设备。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由泰国研究基金（TRF）赠款号RDG6050078和泰国曼谷卡塞萨特大学高级研究所农业和食品高级研究中心资助，泰国高等教育研究促进和国立研究大学项目，高等教育委员会办公室，泰国教育部。这项研究部分由卡塞萨特大学研究生院研究生课程奖学金提供支持。作者要感谢KwanraweeeSirikanchana博士对这段视频的叙述和对皮亚瓦萨拉·西卡林编辑视频的叙述。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
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