Summary
אנו מציגים שיטת RT-מנורה לגילוי של TiLV בדגים אמנון באמצעות כלים פשוטים על פני תקופה קצרה יחסית של זמן לעומת טכניקות RT-PCR קונבנציונאלי. פרוטוקול זה עשוי לעזור לשלוט על התפשטות המגיפה של TiLVD, במיוחד במדינות מתפתחות.
Abstract
אמנון וירוס מחלת האגם (TiLVD), מחלה נגיפית המתעוררים ב אמנון הנגרמת על ידי וירוס האגם אמנון (Tilvd), הוא אתגר מתמשך בתעשיית מידגה כי הביא את התחלואה ההמוני ואת התמותה של אמנון בחלקים רבים של העולם. יעילה, מהירה, ומדויקת אבחון מדויק עבור זיהום TiLV הוא אפוא הכרחי כדי לזהות את הזיהום הראשוני כדי למנוע את התפשטות המחלה בחקלאות מידגה. במחקר זה, לולאה הפוכה רגיש מאוד ומעשי לולאת איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטה מוצגת לזיהוי וירוס האגם אמנון ברקמת הדג. השוואה של rt-qpcr ו-rt-המנורה בחני של דגימות נגוע חשף תוצאות חיוביות ב 63 (100%) ו 51 (80.95%) דגימות, בהתאמה. יתר על כן, ניתוח של דגימות נגוע הראו כי כל 63 רקמות נגוע הניבו תוצאות שליליות הן RT-qPCR ו-RT-המנורה assays. החוצה הפעילות הצולבת עם חמישה פתוגנים ב אמנון הוערך באמצעות RT-מנורה, וכל הבדיקות הראו תוצאות שליליות. הן הכבד והן דגימות ריר שהתקבלו מדגים נגועים הראו תוצאות דומות באמצעות RT-המנורה שיטה, רומז כי ריר ניתן להשתמש RT-מנורה כמו שיטת לא קטלני כדי למנוע הריגת דגים. לסיכום, התוצאות הראו כי הציג RT-מנורה שיטת מספק שיטה יעילה לזיהוי TiLV ברקמת אמנון בתוך 1 h. לפיכך, השיטה מומלצת ככלי הקרנה בחוות לאבחון מהיר של TiLV.
Introduction
אמנון וירוס מחלת האגם (tilvd) היא מחלה נגיפית ב אמנון (oreochromis spp.) כי הדיווחים גורם מקרי מוות אמנון באזורים רבים של העולם, כולל אסיה1,2, אפריקה, ואמריקה. המחלה הוכרה לראשונה בתקופת התמותה ההמונית של האמנון ב-2009 בישראל, כאשר מספר האמנון הפראי באגם כנרת צנח באופן דרמטי מ-257 ל -8 טון בשנה2. המחלה נגרמת על ידי וירוס באגם האמנון (TiLV), אשר הוקצה המשפחה האמריתיים כסוג חדש tilapinevirus ו אמנון מיני חדש tilapinevirus3. האפיון הגנטי של tilv הראה כי הווירוס הוא הרומן עטוף, שלילי-הגיון, יחיד תקוע וירוס RNA כי יש 10 מקטעים קידוד 10 חלבונים1,2,4. מינים שונים של אמנון בסוג סרטרדון, oreochromis, ו tilapine ודגי מים חמים אחרים (למשל, גורמי ענק (osphronemus גוראמי) הוכחו להיות רגישים כדי tilv2,5. כיום, וירוס זה ממשיך להתפשט ברחבי העולם, אולי דרך התנועה של הנגועים דגים חיים6,7, בעוד הסיכון של שידור נגיפי דרך אמנון קפוא או המוצר שלה הוא מוגבל8. תמותה ניכרת בשל זיהום TiLV יש את הפוטנציאל יש השפעה כלכלית מזיקה משמעותית על תעשיית האמנון. לדוגמה, ההשפעה הכלכלית של תסמונת תמותת הקיץ במצרים המשויכת לזיהום TiLV חושבה להיות $100 מיליון9. לכן, חשוב לפתח שיטת אבחון מהירה ונאותה כדי להקל על השליטה במחלה זו בחוות הדגים.
עד עכשיו, האבחנה של TiLVD התבססה על מולקולרית הספר, בידוד נגיפי, ו histopathology. פרוטוקולים מסוגים שונים של PCR והתחל פותחו עבור אבחון TiLV10,11. למשל, שיטת SYBR ירוק מבוססי הפוכה PCR כמותי (RT-qPCR) שיטה עם רגישות לזהות כמה כמו שני עותקים/μL של הווירוס פותחה ואומת עבור הזיהוי TiLV10. שיטות ה-PCR האחרות לזיהוי TiLV כוללות את ה-PCR הכמותי של TaqMan11, RT-pcr2, מקונן rt-pcr12, ומקונן למחצה, rt-pcr13. עם זאת, שיטות אלה דורשות ציוד מעבדה מתוחכם ופרקי זמן מורחבים יחסית כדי להניב תוצאות בשל מורכבות התגובות, מה שהופך אותם לאינם מתאימים ליישום שדה.
האיזותרמי לולאה בתיווך הגברה (מנורה) הוא יישום מהיר, פשוט ופרקטי לשדה14,15. הטכניקה מעסיקה את העיקרון של תגובת העתקה סטרנד, בעוד תגובת הגברה פועלת בתנאים איזותרמי ללא מתוחכם ויקר הציקלאה תרמית14,15. כתוצאה מכך, מוצרים מנורה מוגברת או RT-מנורה מוצרים מנותח בלהקות כמו הסולם באמצעות אגקום ג ' ל ג'ל עם כתם פלורסנט עבור או הדמיה בטוחה של DNA או RNA14 או התבוננות עם עין בעירום לנוכחות של עכירות או לבנים מעלה16,17,18. מסיבות אלה, טכניקה זו שימש לזיהוי באתר של פתוגנים דגים שונים17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. מטרת מחקר זה היה להקים מהירה, רגיש, מדויק RT-מנורה שיטת זיהוי TiLV. The RT-מנורה מציעה הקרנה של TiLV בדגימות דגים בתוך 30 דקות. ניתן ליישם את הטכניקה לאבחון ומעקב של TiLVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסוי זה, שהיה מעורב בשימוש ברקמת בעלי חיים, אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש בוועדה של אוניברסיטת Kasetsart, בנגקוק, תאילנד (פרוטוקול מספר ACKU61-VET-009).
1. אוסף רקמות
- המתת חסד דגים באמצעות מנת יתר של שמן הציפורן (כלומר, יותר מ 3 מ"ל/L). מתיונין טריקיין יכול לשמש כחלופה לשמן הציפורן.
- השתמש מספריים ומלקחיים סטרילי לחתוך לפתוח את הבטן של האמנון הנתיחה שלאחר המוות ואת הבלו כ 30-50 מ ג של רקמת הכבד, או באמצעות זכוכית לכסות מיקרוסקופ, לאסוף 100 μL של ריר על ידי גירוד שכבת העור דגים longitudinally (מאחורי לאחוריים) לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
- המשך לשלב החילוץ של ה-RNA מיד או שמור על המדגם שנאסף ב--80 ° c עד לניסוי. כמו רנ א שלם רגיש יותר מ-DNA, להשתמש RNase-חינם חומרים ריאגנטים במהלך חילוץ RNA.
2. הוצאת רנ א
- כדי לחלץ את ה-RNA מן רקמת הכבד, להוסיף 30-50 מ"ג של רקמת האמנון לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכיל 600 – 1000 μL של guanidinium-חומצה-להפקת פנול מגיב (שולחן החומרים), ו לרסק את המדגם עד הומוגנית באמצעות יד החזיק רקמות ההומובית. דגימות הרקמה דורשות בערך 10%. מהפקת חומצות החומצה-פנול עבור דגימות הריר, השתמש רק 300 μL של שאיבת החומצות-חומצה-פנול מגיב (3:1).
התראה: בריאנידיניום-חומצה-פנול מגיב החילוץ רעיל; לכן, הטיפול חייב להתבצע בזהירות. ציוד מגן, כגון משקפי בטיחות, שמלת מעבדה וכפפות בטיחות, חייב להיות שחוק. - צנטריפוגה את המדגם הומוגניים ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר, ולהעביר את supernatant לתוך צינור חדש סטרילי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
- הוסיפו נפח שווה של 95% אתנול לצינור וערבבו היטב.
- להעביר את הפתרון לתוך טור ספין (טבלה של חומרים) ממוקם בצינור אוסף וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר. השמט את הזרימה והעבר את עמודת הסחרור לצינור אוסף חדש.
- הוסף 400 μL של מגיב טרום השטיפה של RNA (טבלה של חומרים) אל העמודה ואת צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר לפני מחיקת הזרימה-through. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת
הערה: כדי להכין את ה-RNA Pre-לשטוף, להוסיף 10 מ ל של 95% אתנול ל 40 מ ל של RNA לשטוף מראש לרחוץ. - הוסף 700 μL של מאגר שטיפת RNA (טבלת חומרים) אל העמודה ואת צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את העמודה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית 1.5 mL.
הערה: כדי להכין מאגר לשטוף RNA, להוסיף 52 mL של 95% אתנול ל 12 מ ל של RNA מאגר לשטוף להתרכז. - Elute לדוגמה RNA שנלכד במטריקס טור הספין עם 100 μL של nuclease-מים חינם וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
- למדוד את הריכוז של ה-RNA שחולצו באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume ולדלל את ה-RNA לריכוז הרצוי באמצעות מים בחינם nuclease.
הערה: ערך הספיגה המוסמך של OD260/OD280 נע בין 1.6 ל-1.9, ומציין את טוהר ה-RNA המקובל לצורך שיטת ה-RT-מנורה. - המשך לשלב הבא באופן מיידי, או השאר את המדגם בשעה 80 ° צ' עד השימוש.
3. פריימר עיצוב
- השתמש פריימר Explorer גירסה 4 כדי לעצב את צבעי היסוד הספציפיים עבור RT-מנורה. עבור אל אתר האינטרנט, הhttps://primerexplorer.jp/e/ולחץ על לחצן V4 של PrimerExplorer.
- בחר את הקובץ המכיל את רצפי קטע 3 של TiLV בפורמט FASTA ולאחר מכן לחץ על לחצן עיצוב פריימר .
הערה: לאחזר את הרצפים בפורמט FASTA מKX631923 מספר ההצטרפות של GenBank, המייצג וירוס אמנון לייק TV1 קטע 31. - כדי לעצב את התחל, הקלט את הפרמטרים הבסיסיים הבאים:
-תוכן GC של 40% – 60%
-אמפליקון של ≥ 280 זוגות בסיס (bp)
-טמפרטורת ההיתוך דומה (Tm) בין התחל עם הבדל מרבי של 5 ° c
הערה: אסור להתחל להשלים אחד את השני- הימנע מאזורי רצף הנוטים להרכיב מבנים משניים.
- בחרו את האנליזה הדיפית עם מינימום של 3.5 לקבלת עיצוב אופטימלי לΔG הגדול ביותר, ובחרו את קצות התחל בעיצוב מיטבי של הΔG הקטנים.
- לחץ על לחצן צור .
הערה: לאחר שהתוכנה מסתיימת בעיבוד נתוני הקלט, התוצאות התחל יוצגו (איור 1).
4. RT-שיטת מנורה
- להכין לערבב מנורות RT-מנורה המכיל 2.5 μL של 1 x SD II מאגר התגובה, 3 μL של 6 מ"מ MgSO4, 1.4 μl של 1.4 מ"מ מערכת dntp, 4 μl של 0.8 M בקובץ, 1.3 μl של 0.052 מילימטר calcein, 1 μl של 1.6 μm ליטר-F3, 1 μm, מתוך 1.6 Μv-B3 פריימר, 1 μl של 0.2 ΜM-bip-cp פריימר, 1 μl של 0.2 ΜV-FIP פריימר, 1 μl של 0.3 יו. אן. אנ. איי פולימראז, 1 μl של 0.1 U amv הפוכה הטרנססקריפט, ו 3.8 μl של nuclease-מים חינם לכל תגובה.
הערה: הכינו מיקס מאסטר עודף הכולל לפחות 10% מנפח התגובה הכולל. - לחלק 22 μL של שילוב מנורה מנורת RT-המנורה לצינור 1.5 מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
- הוסף 3 μL של ה-RNA שחולצו לצינור התגובה, ולערבב את המדגם על ידי vortexing. לשליטה השלילית, השתמשו במים מזוקקים במקום בחומרי RNA.
- דגירה התגובה ב 65 ° c עבור 60 דקות, ואחריו 80 ° צ' עבור 10 דקות כדי לסיים את התגובה.
- לאחר הדגירה, להתבונן באופן חזותי שינויים הצביעה בעין בעירום. תוצאה חיובית תופיע כצבע ירוק פלורסנט.
5. אגבה ג'ל
- הכינו 1.5% w/v agarose ג'ל על ידי השעיית 0.6 g של אבקת agarose ב 40 mL של 1 x טה מאגר. ממיסים את התערובת על ידי חימום אותו במיקרוגל במשך 3 – 5 דקות עד שהאגקם מומס לחלוטין, ומערבולת לערבב.
- הניחו לאגקם להתקרר עד שטמפרטורת הטמפרטורה תגיע ל-65 ° c. יוצקים 40 mL של הפתרון agarose על מגש ג'ל ולהוסיף מסרק לתבנית ג'ל.
- אפשר לג ג'ל להגדיר בטמפרטורת החדר במשך 20 – 30 דקות עד שהוא מתחזק לחלוטין. ואז להסיר את המסרק ולמקם את ג'ל במיכל ג'ל.
- הוסף מאגר פועל כדי לכסות את המשטח של ג'ל במיכל הג.
- הוסף 10 μL של הדגם RT-מנורה ו 2 μL של שישה x ג'ל טעינת מאגר לכל טוב. הוסף 5 μL של סולם DNA של 1 kb לנתיב ההתייחסות.
- חבר את המכסה המצורף לקתודה והאנדה המחובר לספק כוח. הפעל את ספק הכוח, להגדיר אותו קבוע 100 V, ולרוץ עבור 40 דקות.
- לאחר שסיימו את ההפרדה ג'ל, הסירו את הג ממגש הג. ואז להכתים את ג'ל סחוט באמצעות אתידיום ברומיד (EtBr) בריכוז של 10 מ"ג/mL עבור 7 דקות ו restain אותו מים מזוקקים עבור 5 דקות.
התראה: EtBr הוא רעיל ונחשב מסרטן; לכן, היזהר בעת השימוש סוכן זה. - לחשוף את ג'ל לאור UV באמצעות מערכת התיעוד ג'ל שבו מופיעים להקות, ולצלם את הג.
6. סינתזה של דנ א (cDNA) משלימה
- להכין מיקס cDNA שילוב מאסטר המכיל 2 μL של 5x RT מאגר, 0.5 μL של פריימר לערבב, 0.5 μL של האנזים RT, ו 2 μL של nuclease-מים חינם לכל תגובה.
הערה: הכינו מיקס מאסטר עודף הכולל 1 x את התגובה עקב אובדן פוטנציאלי במהלך הליטוף. - מערבבים 5 μL של המיקס הראשי לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי 1.5 mL.
- הוסף 100 ng של RNA המחולצים (שהושג משלב 2.8) לצינור התגובה, לערבב ספין למטה כדי להעביר את כל התערובת לתחתית הכלי.
- מודיית את התגובות ב 42 ° c עבור 60 דקות, ואחריו 98 ° צ' עבור 5 דקות במכונת ה-PCR. יש לאחסן את cDNA ב-20 ° צ' עד השימוש.
7. RT-qPCR
- להכין שילוב מאסטר TiLV qPCR המכיל 0.3 μL של 10 μM הפוכה פריימר, 0.3 μL של 10 μM קדימה פריימר, 5 μL של 2x SYBR ירוק DNA פולימראז, ו 0.4 μL של nuclease-מים ללא תשלום לכל תגובה. השתמש בבקרי התחל ובפקדים הבאים:
פריימר קדימה (TiLV-112F): 5 '-מסכת מעבר
פריימר הפוכה (TiLV-112R): 5 '-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3 ' - לחלק 6 μL של מיקס מאסטר TiLV qPCR לתוך כל טוב של רצועת qPCR תואם את הציקלייה תרמית בזמן אמת בשימוש.
- הוסף 4 μL של תבנית cDNA, שליטה שלילית (nuclease-מים ללא תשלום), בקרה חיובית (10 pg/μL), ו pTiLV (פלבאמצע)10 או מדולל באופן סדרתי tilv פלמיד לבאר, ולערבב כל מדגם על ידי מצליף. . לנהל כל דוגמא בטרילקטה
- הציבו את התגובות qPCR לתוך הציקלור התרמי בזמן אמת מתוכנת. הגדר את התוכנית qPCR כדי לבצע את הדגירה ב 95 ° c עבור 3 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 10 s ו60 ° c עבור 30 לפני השלב עקומת ההיתוך שבו הטמפרטורה צריך לעלות מ-65 ° c כדי 95 ° c במרווחים של ° צלזיוס/5.
- נהל את ניתוח הנתונים על-ידי הערכת עקומות הגברה והתכה ולאחר מכן חשב את מספר עותקי TiLV באמצעות העקומה הסטנדרטית שמתקבלת מהנתונים באמצעות הפלמידים המדולל באופן סדרתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, שיטת RT-המנורה פותחה כדי לזהות זיהום TiLV ב אמנון. דגימות נבדק נאספו 14 חוות ממוקם בחלקים שונים של תאילנד בין 2015 ו 2016. הדגים נגוע ולא נגוע היו מקובצים בעיקר בהתבסס על אבחנות פיזיות הופעות של TiLVD סימפטומים. זיהום TiLV אושר לאחר מכן באמצעות RT-PCR לאחר תהליך האיסוף. האלקטרופורזה בג ג'ל ואיתור צבע ירוק זורח נבחרו כשיטות הערכה של הגברה המנורה (איור 2). הכבד והריר של הדג האמנון הנגוע והלא נגוע התאפיין במראה הקליני של תסמיני מחלת TiLV, כולל שחיקת העור, אדמומיות בעור, האקפתלמוס ונפיחות בבטן. הדיווחים הקודמים הוכיחו את השימוש בדגימות הכבד של בחני אבחון מולקולרי כדי לקבוע את הנוכחות של tilv35. לחילופין, הריר עשוי להועיל באותה מידה כפי שהיא עשויה לסייע להימנע מהריגת החיות. התוצאות הראו דפוס הסולם כמו ה-DNA הלהקה וצבע ירוק פלורסנט בכבד נגוע דגימות ריר של דגים נגועים (איור 2), בעוד להקה DNA וצבע צהוב של calcein נצפו ב-RT-תערובות מנורה ברקמות בעלי חיים נגועים (איור 2). מעניין, מדגם האמנון הנגוע TiLV שנאסף מחווה במלזיה גם אובחן כחיובי באמצעות זה RT-מנורה שיטת; עם זאת, וריאציות בגודל המוצר של ה-PCR בהשוואה לדגימות שנאספו מחוות תאילנדיות מקומיות נצפו (איור 2).
כדי לאמת את הרגישות ואת הספציפיות של שיטת RT-מנורה, סך של 63 tilv-הרקמות הנגועות ו 63 רקמות נגוע שנותחו באמצעות המנורה rt ו-rt-qpcr בחני (שולחן 1). השוואה של rt-qpcr ו-rt-המנורה בחני של דגימות נגוע חשף תוצאה חיובית 63 (100%) ו 51 (80.95%) של הדגימות, בהתאמה. יתר על כן, ניתוח של דגימות נגוע הראו כי כל 63 רקמות נגוע הניבו תוצאות שליליות באמצעות השני RT-qpcr ו-rt-המנורה בחני (שולחן 1). ניתוח זה הפגין את המהימנות של הטיפול באמצעות המנורה RT-מנורה עבור זיהוי TiLV ראשוני. כדי לבדוק את הספציפיות של שיטת RT-המנורה, רקמה מן הדג נגוע בחיידקים פתוגניים אחרים ווירוסים, כולל סטרפטוקוקס agalactiae, פרנסיטיונלה noatunensis, כותרות של פלקובאנטריום, הידרופילומיה, ו IRIDOVIRUS שימשו תבניות עבור Rt-מנורה ו-rt-qpcr ניתוחים. הן מנורת ה-RT ו-RT-qPCR הניבו תוצאות שליליות ללא שינויים בצבעי הצביעה ואין אותות פלורסנט באף אחת מדגימות הבדיקה (טבלה 2). בנוסף, את הרגישות של שיטת RT-מנורה הוערך באמצעות דילול 10-קיפול סדרתי של תבניות RNA שחולצו מ-TiLV הנגועים דגים. יחסית, השיטה RT-qPCR היה רגיש יותר מאשר מקרה RT-המנורה כמו הדרישה RT-qPCR היה מגבלת גילוי של 10-8 בעוד השיטה rt-המנורה נדרש דילול 10-7-קיפול לזהות את הגנום Tilv (שולחן 2).
איור 1. רצפי נוקלאוטיד של ששת RT-המנורה התחל המשמש מחקר זה היה ספציפי לזיהוי של TiLV. המיקום של כל פריימר היה מיושר על קטע 3 של הגנום TiLV (מספר ההצטרפות KX631923). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. ניתוח של מנורות ה-RT-מנורה שהתקבלו מדגימות tilv-נגוע ו נגוע (A) ב 1.5% agarose ג'ל אלקטרופורזה ו (ב) על ידי הדמיית פלורסנט. M = 1 kb סולם ה-DNA, 1 – 2 = רנ א מן הכבדים של TiLV-נגוע דגים, 3 – 4 = cDNA של הדגים הנגועים tilv, 5 – 6 = RNA מן הריר של הדגים נגועים TiLV, 7 – 8 = שורות התא של הדגים הנגועים TiLV, 9 = רנ א מן הכבדים של TiLV-הנגועים דגים (מלזיה), 10 = RNA מן הכבדים של הדגים הנגועים שאינם TiLV, 11 = cDNA של לא-TiLV הנגועים דגים, 12 = RNA מן הריר של שאינם TiLV-הדגים נגוע, 13 = אין בקרת תבנית נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של
| סוגי דגימות | מספרי דגימות | תוקף זיהוי (%) | |
| RT-qPCR | מנורות-מנורה | ||
| דגימות נגועות | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| דגימות לא נגוע | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
. שולחן 1 אימות של RT-מנורה לאיתור TiLV בדגימות של דגים נגועים ובלא נגועים באמצעות RT-qPCR ו-RT-מנורה
| ספציפיות | דרום אמריקה | F.n. | יונייטד | A.h. | עירוי | |||||
| טרינריה | מנורה | טרינריה | מנורה | טרינריה | מנורה | טרינריה | מנורה | טרינריה | מנורה | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| רגישות | שיטה | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| דילול | ||||||||||
| טרינריה | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| מנורה | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
. שולחן 2 ספציפיות ורגישות של שיטת RT-מנורה לעומת RT-qPCR. להערכת הספציפיות, RNA שהושג מרקמת הדג נגוע בחיידקים או וירוסים אחרים, כולל סטרפטוקוקס agalactiae (דרום אמריקה), הפרנסיטאלה noatunensis (F.n.), כותרות של פלקוביום (מועדון ), aeromonas Hydrophila (A.h.), ו iridovirus (האינפוזיה), שימש תבניות עבור rt-qpcr ו-rt עבור הערכת רגישות, RNA שהתקבלו מדגים נגועים TiLV היה 10-קיפול מדולל מ 100 ng ל 1 fg ומשמש תבניות עבור RT-qPCR ו-RT-מנורה. השילוט + ו-מתכוון לתוצאות חיוביות ושליליות, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תעשיית מידגה מאוימת ברציפות על ידי זיהומים נגיפי הגורמים הפסדים כלכליים ניכרים9,23,28. למשל, tilv המתעוררים מהווה איום גדול למדינות מניבות אמנון בחלקים רבים של העולם1,6,9. עד עכשיו, לא היו therapeutics מסוימים זמינים כדי למנוע TiLVD. בעוד התפתחות של החיסון מתמשך, חיסון יעיל ידרוש זמן משמעותי לפני שהוא זמין למטרות מסחריות. בהינתן נסיבות אלה, מדידות biosecurity קפדנית, כגון יישום של חומרי חיטוי, נחוצים חוות דגים כדי למנוע את התפשטות של tilvd29,30. כיום, אחד מאמצעי השליטה היעילים ביותר להפחתת שידור TiLV הוא הקרנת דגי נעורים ומבוגרים לנוכחות או העדר TiLV31. למטרות סינון, כלי האבחון צריך להיות מהיר, רגיש וספציפי, כך שהוא יכול לסייע בסילוק אוכלוסיות נגועות ולמנוע התפשטות נוספת של המחלה. עם זאת, הדבר המולקולרי הנוכחי עבור TiLV קשה ליישום באתר. במקרה הראשון, הם דורשים חוקרים מיומנים וציוד יקר. שנית, זה יכול להימשך מספר ימים כדי להשיג את תוצאות המעבדה, מה שמקשה על השליטה ולמנוע את התפשטות המחלה מיד15,16.
כדי להתגבר על בעיות אלה, Notomi ואח '14 הקים הרומן גרעין הספר מבוססי חומצות הגברה שנקרא לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (מנורה) ב 2000. תגובת המנורה מאז הוחל בהצלחה כדי לזהות וירוסים דגים שונים16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,32,33,34. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול המנורה RT כדי לזהות TiLV בדגימות דגים אמנון. למרות הרגישות של השיטה RT-המנורה היא פי 10 פחות יעיל מזו של RT-qPCR, האפשרות RT-המנורה יכול לזהות את נוכחותו של הגנום RNA TiLV נמוך כמו 100 fg, אשר מספיק לזיהוי TiLV של דגים חולים קלינית34. בעיקר, שיטת RT-מנורה מניב תוצאה בתוך 60 דקות ודורש רק אמבטיה מים פשוטה או מכשירים בלוק חום34, בעוד הטיפול RT-qpcr לוקח זמן רב יותר ודורש יקר יותר בזמן אמת ציוד PCR עבור ניתוח15,34. יתר על כן, התוצר הסופי של המנורה RT-מנורה נצפתה באמצעות שינוי בצבע של צבע פלורסנט מצהוב בהיר לירוק פלורסנט, מה שהופך אותו גלוי לעין בלתי ללא כל דרישה עבור ציוד מתוחכם34. יתרונות אלה להפוך RT-מנורה מתאים לאבחון שדה. יתר על כן, ממצאי המחקר הציע כי הן הכבד והריר יכול לשמש לאיתור TiLV באמצעות RT-מנורה. בדומה למחקרים קודמים, דוגמה לא קטלנית באמצעות ריר מותר את האבחנה של TiLV מבלי להרוג דגים או יקר broodstock35. לאחרונה, שיטת RT-מנורה פותחה כדי לזהות מבודד סינית ותאילנדית של הסדרה נוקלאוטיד של TiLV במקטע 1 (S1 אזור) באמצעות סט של שישה התחל36. המחקר הנוכחי הראה כי מפותחים RT-מנורה מאובחן האות שלילית-שלילי של זיהום TiLV ב 27.78% לעומת RT-PCR בעת שימוש באותו מערכת תחל. בהשוואה נוספת, התוצאה השלילית היה פחות יחסית ב 19.05% כאשר מזהה קטע 3 של TiLV לעומת RT-PCR. בעת השוואת היעילות של שיטת איתור נגיפי עם דוחות אחרים, הצלחנו לזהות את הזיהום TiLV ב 80.95%, בעוד יצירות אחרות זיהה את הווירוס ב 72.22%36 ו 82.89%37. בסך הכל, זה יכול להיות שיערו כי הרכיבים השונים של הצורך המנורה RT-מנורה, למשל, מערכות פריימר שונים מקטעים ייעודיים שונים של הגנום TiLV הם גורמים חשובים המשפיעים על תוקפו של הצורך.
למרות הונאה RT-המנורה הוא כלי רב עוצמה להקרנה המחלה ויש לו כמה יתרונות, מחקר זה לא היה ללא הגבלות. אחת הנקודות הקריטיות לקביעת מנורת ה-RT הייתה העיצוב של הסדרה המתאימה המורכבת מארבע עד שש התחל. כדי לקדם את היווצרות הגזע לולאה מבנים של מוצרי ה-PCR, את האורכים המתאימים של גנים ממוקדות או הרצפים נוקלאוטיד צריך להיות ארוך יותר מאשר על 500 bp, בעוד הגנים המיועדים של שיטת RT-PCR היה צריך להיות קצר יחסית, בטווח של 50 – 150 bp14,38,39.
לסיכום, הפיתוח הפותח RT-המנורה הוא מהיר, חסכוני, רגיש, ספציפי לאיתור TiLV. ניתן להשלים את הניתוח בתוך 1 שעות לעומת 4 – 5 h עבור שיטת RT-qPCR. בעיקר, שיטת RT-מנורה מעשית עבור תנאי שדה כמו תוצאות חיוביות ניתן לצפות בעין בעירום ללא צורך בשימוש בציוד מתוחכם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
הפרויקט ממומן כלכלית על ידי קרן תאילנד מחקר (trf) מענק מספר RDG6050078 והמרכז ללימודים מתקדמים לחקלאות ומזון, המכון ללימודים מתקדמים, אוניברסיטת kasetsart, בנגקוק, תאילנד תחת קידום מחקר ההשכלה הגבוהה ופרויקט המחקר הלאומי של תאילנד, משרד ועדת ההשכלה הגבוהה, משרד ה המחקר נתמך בחלקו על ידי מלגת הלימודים לתואר שני מבית הספר לתארים מוסמכים, אוניברסיטת קאסטסארט. המחברים רוצים להודות לד ר Kwanrawee Sirikanchana לגבי הנרטיב העלילתי של וידאו ופייוואווצ סיקרין לעריכת הווידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
