Biology

Visualisierung von Replisom-Begegnungen mit einer Antigen-markierten blockierenden Läsion

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689

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Summary

Während Replikationsgabelkollisionen mit DNA-Addukten Doppelstrangbrüche induzieren können, ist über die Interaktion zwischen Replisomen und blockierenden Läsionen weniger bekannt. Wir haben den Proximity-Ligations-Assay verwendet, um diese Begegnungen zu visualisieren und die Konsequenzen für die Replisomenzusammensetzung zu charakterisieren.

Abstract

Es gibt einen beträchtlichen Einblick in die zelluläre Reaktion auf Doppelstrangbrüche (DSBs), die durch Nukleasen, Strahlung und andere DNA-Brecher induziert werden. Dies spiegelt zum Teil die Verfügbarkeit von Methoden zur Identifizierung von Bruchstellen und zur Charakterisierung von Faktoren wider, die an diesen Sequenzen an DSBs rekrutiert werden. DSBs treten jedoch auch als Zwischenprodukte bei der Verarbeitung von DNA-Addukten auf, die von Verbindungen gebildet werden, die keine direkten Brüche verursachen und nicht an bestimmten Sequenzstellen reagieren. Folglich sind für die meisten dieser Wirkstoffe Technologien, die die Analyse von Bindungsinteraktionen mit Reaktionsfaktoren und Reparaturproteinen ermöglichen, unbekannt. Zum Beispiel können DNA-Interstrangvernetzungen (ICLs) Brüche nach Begegnungen mit Replikationsgabeln hervorrufen. Obwohl sie aus Medikamenten bestehen, die häufig als Chemotherapeutika für Krebs verwendet werden, gibt es bisher keine Methodik zur Überwachung ihrer Wechselwirkungen mit Replikationsproteinen.

In dieser Arbeit beschreiben wir unsere Strategie, um die zelluläre Reaktion auf Gabelkollisionen mit diesen herausfordernden Addukten zu verfolgen. Wir haben ein Steroidantigen mit Psoralen verknüpft, das Photoaktivierungs-abhängige ICLs in Zellkernen lebender Zellen bildet. Die ICLs wurden mittels Immunfluoreszenz gegen den Antigen-Tag sichtbar gemacht. Der Tag kann auch ein Partner im Proximity-Ligation-Assay (PLA) sein, der die enge Assoziation zweier Antigene meldet. Die PLA wurde ausgenutzt, um Proteine, die eng mit den markierten ICLs assoziiert waren, von solchen zu unterscheiden, die dies nicht waren. Es war möglich, Replisome-Proteine zu definieren, die nach Begegnungen mit ICLs zurückblieben, und andere, die verloren gingen, zu identifizieren. Dieser Ansatz ist auf jede Struktur oder jedes DNA-Addukt anwendbar, das immunologisch nachgewiesen werden kann.

Introduction

Die zelluläre Reaktion auf Doppelstrangbrüche ist dank einer Reihe von immer leistungsfähigeren Methoden zur Lenkung von Brüchen an bestimmte genomische Stellen gut dokumentiert ^1,2,3. Die Lokalisationssicherheit ermöglicht eine eindeutige Charakterisierung von Proteinen und anderen Faktoren, die sich an der Stelle ansammeln und an der DNA-Schadensantwort (DDR) beteiligt sind, wodurch die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) angesteuert werden, die Brüche reparieren. Natürlich werden viele Brüche durch Agenzien wie Strahlung und chemische Spezies verursacht, die bestimmte Sequenzen nicht angreifen⁴. Für diese stehen jedoch Verfahren zur Verfügung, mit denen die Enden in Strukturen umgewandelt werden können, die für das Tagging und die Lokalisierung geeignet^sind ^5,6. Brüche werden auch durch biologische Prozesse, wie z. B. die Umlagerung von Immunglobulinen, eingeführt, und neuere Technologien ermöglichen ihre Lokalisierung sowie⁷. Die Beziehung zwischen den reagierenden Faktoren und diesen Stellen kann dann bestimmt werden.

Brüche treten auch als indirekte Folge von Addukten auf, die von Verbindungen gebildet werden, die keine inhärenten Brecher sind, aber DNA-Transaktionen wie Transkription und Replikation stören. Sie können als Merkmal der zellulären Reaktion auf diese Obstruktionen gebildet werden, vielleicht während der Reparatur oder weil sie eine Struktur provozieren, die anfällig für Nukleaseangriffe ist. Typischerweise ist die physikalische Beziehung zwischen dem Addukt, dem Bruch und der Assoziation mit antwortenden Faktoren inferenzlich. Zum Beispiel werden ICLs durch Chemotherapeutika wie Cisplatin und Mitomycin^C8 und als Reaktionsprodukt von abasischen Stellen⁹ gebildet. ICLs sind als potente Blöcke für Replikationsgabeln¹⁰ bekannt, wodurch Gabeln, die durch Nukleasen¹¹ gespalten werden können, blockiert werden. Die kovalente Bindung zwischen den Strängen wird oft durch Signalwege erleichtert, die obligate Brüche als Zwischenprodukte^{aufweisen 12,13}, was eine homologe Rekombination erfordert^, um die Replikationsgabel ¹⁴ wieder aufzubauen. In den meisten Experimenten verfolgt der Forscher die Reaktion von interessierenden Faktoren auf die Brüche, die stromabwärts der Kollision einer Replikationsgabel mit einer ICL gebildet werden. Da es jedoch keine Technologie zur Lokalisierung einer provokativen Läsion gibt, kann die Nähe des Replisoms und seiner Bestandteile zum ICL nur vermutet werden.

Wir haben eine Strategie entwickelt, die die Analyse von Proteinassoziationen mit nicht-sequenzspezifischen kovalenten Addukten ermöglicht, die hier anhand von ICLs dargestellt werden. In unser System werden diese durch Psoralen eingeführt, ein photoaktives Naturprodukt, das seit Tausenden von Jahren als Therapeutikum bei Hauterkrankungen verwendet^{wird 15}. Unser Ansatz basiert auf zwei wichtigen Merkmalen von Psoralens. Die erste ist ihre hohe Frequenz der Vernetzungsbildung, die 90 % der Addukte überschreiten kann, im Gegensatz zu den weniger als 10 %, die von beliebten Verbindungen wie Cisplatin oder Mitomycin C ^8,16 gebildet werden. Die zweite ist die Zugänglichkeit der Verbindung zur Konjugation ohne Verlust der Vernetzungskapazität. Wir haben Trimethylpsoralen kovalent mit Digoxigenin (Dig), einem seit langem etablierten Immuntag, verknüpft. Dies ermöglicht den Nachweis der Psoralen-Addukte in genomischer DNA durch Immunfärbung des Dig-Tags und die Visualisierung durch konventionelle Immunfluoreszenz¹⁷.

Dieses Reagenz wurde in unserer früheren Arbeit zur Analyse von Replikationsgabelbegegnungen mit ICLs unter Verwendung eines DNA-Faser-basierten Assays eingesetzt¹⁶. In dieser Arbeit fanden wir heraus, dass die Replikation über eine intakte ICL hinaus fortgesetzt werden kann. Dies war abhängig von der ATR-Kinase, die durch Replikationsstress aktiviert wird. Der Neustart der Replikation war angesichts der Struktur der replikativen CMG-Helikase unerwartet. Dieser besteht aus dem MCM-Hetero-Hexamer (M), das einen versetzten Gap-Ring um den Templat-Strang für die Leitstrangsynthese bildet, der von den Proteinen des GINS-Komplexes (G, bestehend aus PSF1, 2, 3 und SLD5) und CDC45 (C)¹⁸ eingeschlossen wird. Der Vorschlag, dass die Replikation auf der Seite der ICL distal zur Seite der Replisomkollision neu gestartet werden könnte, sprach für eine Änderung der Struktur des Replisoms. Um der Frage nachzugehen, welche Komponenten zum Zeitpunkt der Begegnung mit einer ICL im Replikom waren, haben wir den hier beschriebenen Ansatz entwickelt. Wir nutzten den Dig-Tag als Partner in Proximity-Ligation-Assays (PLA)¹⁹ , um die enge Assoziation der ICL mit Proteinen des Replisoms²⁰ zu untersuchen.

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Protocol

1. Vorbereitung der Zellen

Tag 1
1. 35-mm-Kulturschalen mit Glasboden mit einer Zellkleberlösung vorbehandeln.
2. Legen Sie die Zellen einen Tag vor der Behandlung in die vorbehandelten Schalen. Die Zelle sollte sich am Tag des Experiments aktiv teilen und zu 50–70 % konfluent sein.
  HINWEIS: HeLa-Zellen wurden in diesem Experiment mit Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM verwendet, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 1x Penicillin / Streptomycin. Es gibt keine Beschränkung für adhärente Zelllinien. Nicht-adhärente Zellen müssen jedoch vor der Analyse mittels PLA auf Objektträger zentrifugiert und fixiert werden.
Tag 2
1. Herstellen einer Stammlösung von Digoxigenintrimethylpsoralen (Dig-TMP) durch Resuspendierung eines gefrorenen Aliquots von zuvor synthetisiertem Dig-TMP in 1:1 EtOH:_H2O. Bestimmung der Konzentration durch Messung von OD bei 250 nm einer 100-fachen Verdünnung (in_H2O) des gelösten Dig-TMP. Der Extinktionskoeffizient von Dig-TMP beträgt 25.000. Überprüfen Sie die Konzentration, indem Sie vor jedem Gebrauch OD bei 250 nm messen und die Stammkonzentration berechnen: Abs x 100 x 10⁶/25.000 = Konzentration (in μM). Im Allgemeinen beträgt die Stammlösung etwa 3 mM. Die Lösung kann bei –20 °C etwa einen Monat gelagert werden.
  HINWEIS: Dig-TMP muss im Voraus chemisch synthetisiert werden, wobei das hier beschriebene Verfahren befolgt wird. Rückfluss 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin in Toluol unter Stickstoff für 12 h. Entfernen Sie das Lösungsmittel und gewinnen Sie das 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)]aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Produkt durch Kieselgelchromatographie zurück. Das Produkt wird mit Digoxigenin-NHS-Ester in Dimethylformamid und Triethylamin bei 50 °C für 18 h konjugiert. Entfernen Sie das Lösungsmittel und reinigen Sie den Rückstand durch präparative Dünnschicht-Kieselgelchromatographie. Elute die Produktbande Chloroform: Methanol: 28%iges Ammoniumhydroxid (8:1:0,1)-Gemisch. Verdampfen Sie die Lösungsmittel und lösen Sie das Pellet in 50% EtOH:_H2Oauf.
2. Dig-TMP-Stamm in 50 % EtOH:_H2Obis zu einer Endkonzentration von 5 μM in das Zellkulturmedium geben und das Medium auf 37 °C bringen. Saugen Sie das Medium von den Platten ab, fügen Sie das vorgewärmte Dig-TMP-haltige Medium hinzu und legen Sie die Platten für 30 Minuten in einen Inkubator (37 °C, 5 %_{CO 2}), damit das Dig-TMP ausgleichen kann.
3. Während der Inkubation der Zellen wird die UV-Box (siehe Materialtabelle) auf 37 °C vorgewärmt.
4. Legen Sie die Platten in die vorgewärmte UV-Box und setzen Sie die Zellen für dieses Experiment 5 Minuten lang einer Dosis von 3 J/^cm2 UVA-Licht aus. Die Platten wurden während der Bestrahlung auf einen Thermoblock gelegt, der bei 37 °C gehalten wurde. Berechnen Sie die Zeit mit der Formel:
5. Saugen Sie das Medium mit einer Pipette an, geben Sie frisches, vorgewärmtes Medium hinzu und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator bei 37 °C, 5% CO₂ für 1 h.
6. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie das Geschirr einmal vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
7. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 0,1 % Formaldehyd (FA) für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) in PBS hinzu. Dadurch wird verhindert, dass sich die Zellen während der Vorbehandlung mit CSK-R (Cytoskeleton extraction buffer containing RNase, beschrieben in 1.2.9) ablösen, die zur Extraktion der zytoplasmatischen Elemente und zur Reduzierung des PLA-Hintergrunds erforderlich ist.
8. FA absaugen und einmal mit PBS spülen.
9. CSK-R-Puffer zugeben und 5 min bei RT inkubieren, um Zytoplasma zu entfernen [CSK-R-Puffer: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mM MgCl₂, 0,5%Triton X-100, 300 μg/mL RNase A]. Den Puffer absaugen, frisches CSK-R hinzufügen und 5 Minuten bei RT inkubieren.
  HINWEIS: Ein Vorrat an CSK-Puffer kann bei 4 °C gelagert und Triton X und RNaseA direkt vor der Verwendung hinzugefügt werden.
10. Dreimal mit PBS waschen.
11. Zellen mit 4% Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT fixieren.
12. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Führen Sie diesen Schritt dreimal aus.
13. 100%iges Methanol kalt zugeben und 20 min bei -20 °C inkubieren.
14. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen in PBS in einer feuchten Kammer bei 4 °C bis zu einer Woche gelagert werden.
15. Die Zellen werden in 80 μl 5 mM TritonX-100 für 10 min bei 4 °C inkubiert.
16. Inkubieren Sie Zellen mit 100 μl 5 mM EDTA in PBS, ergänzt mit 1 μl 100 mg/ml RNase A, für 30 min bei 37 °C.
17. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
18. Lagern Sie die Zellen in Blockierpuffer (5 % BSA und 10 % Ziegenserum in PBS) über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer.

2. Proximity-Ligations-Assay

HINWEIS: Führen Sie an Tag 3 einen Proximity-Ligationstest durch.

Antikörper-Färbung
1. Bereiten Sie 40 μl der primären Antikörperlösung pro Platte vor: Geben Sie das entsprechende Volumen der primären Antikörper hinzu, um die gewünschte Verdünnung zu erreichen (Maus-Anti-Digoxigenin und Kaninchen-Antikörper gegen eine Replisomkomponente wie MCM5, CDC45, PSF1 oder pMCM2, Verdünnungen, die in der Materialtabelle angegeben sind) in den Blockierungspuffer (um ein Endvolumen von 24 μl zu erreichen). Mischen Sie durch Klopfen und lassen Sie es 20 Minuten bei RT stehen. Bereiten Sie eine Mastermischung für mehrere Proben vor und mischen Sie durch Klopfen, bevor Sie sie auf die Vertiefungen auftragen.
2. Geben Sie 40 μl primäre Antikörperlösung in die Mitte der Vertiefung und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C in einer feuchten Kammer. Lassen Sie die PLA-Sonden und den Blockierpuffer während des Färbens auf Raumtemperatur erwärmen.
3. Waschen Sie die Zellen mit PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 in 1X PBS] bei RT. Führen Sie diesen Schritt dreimal durch.
4. Bereiten Sie während des Waschens 40 μl PLA-Sondenlösung pro Schale vor (PLA-Sonden bestehen aus einem sekundären Antikörper, der entweder Kaninchen- oder Maus-IgG erkennt und kovalent mit einem PLUS- oder MINUS-Oligonukleotid verknüpft ist): 8 μl PLA-Sonde Anti-Maus-PLUS + 8 μl PLA-Sonden-Anti-Kaninchen-MINUS-Antikörper + 24 μl Blockierungspuffer. Mischen Sie es und lassen Sie es 20 Minuten bei RT stehen. Bereiten Sie eine Mastermischung für mehrere Proben vor und mischen Sie sie gut, bevor Sie sie auf die Vertiefungen auftragen. Legen Sie die Lösung in die Mitte der Vertiefung in den Teller.
5. Entfernen Sie die letzte Wäsche, geben Sie 40 μl PLA-Sondenlösung in die Mitte der Vertiefung und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C in einer feuchten Kammer.
6. Im Puffer A dreimal für jeweils 10 min auf einer Kippplattform bei RT waschen. Bringen Sie die Ligaturmischung während des Waschens auf RT.
Ligation und Amplifikation
1. Bereiten Sie 40 μl Ligationsmischung pro Platte vor: 8 μl (5x) Ligationsmaterial + 31 μl destilliertes Wasser + 1 μl Ligase. Bereiten Sie die Mastermischung für mehrere Platten vor und mischen Sie sie gut, bevor Sie sie auf die Vertiefungen auftragen.
2. Geben Sie 40 μl Ligationslösung in jede Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einer feuchten Kammer bei 37 °C.
3. Zellen 3x mit Puffer A für je 2 min auf einer Kippplattform bei RT waschen.
4. Bereiten Sie 40 μl Amplifikationslösung pro Schale vor: 8 μl (5x) Amplifikationsmaterial + 31,5 μl destilliertes Wasser + 0,5 μl DNA-Polymerase. Bereiten Sie eine Mastermischung für mehrere Proben vor und mischen Sie sie gut, bevor Sie sie auf die Vertiefungen auftragen.
5. Geben Sie 40 μl Amplifikationslösung in jede Platte und inkubieren Sie sie 100 Minuten lang in einer feuchten Kammer bei 37 °C.
6. Die Amplifikationslösung absaugen und mit Puffer B waschen. Führen Sie 6 Waschgänge für jeweils 10 Minuten auf einer kippbaren Plattform bei RT durch.
7. Einmal mit 0,01x Puffer B für 1 min bei RT waschen.
8. Aspirieren Sie Puffer B und inkubieren Sie Platten mit sekundären Antikörpern, Alexa Fluor 488 Anti-Maus-IgG und Alexa Fluor 568 Anti-Kaninchen-IgG in Blockierlösung bei geeigneten Verdünnungen im Blockierungspuffer in einer feuchten Kammer für 30 min bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C.
9. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS-T, jeweils 10 Minuten lang auf einer Kippplattform bei RT.
10. PBS-T ansaugen und mit DAPI in Eindeckmedium einbauen. Die gemounteten Platten können sofort abgebildet oder vor der Bildgebung bei 4 °C im Dunkeln für nicht länger als 4 Tage gelagert werden.

3. Bildgebung und Quantifizierung

Führen Sie die Bildgebung in einem epifluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop durch (wenn eine 3D-Bildgebung wünschenswert ist, decken Sie mindestens 3 μm in 15 Stapeln ab). Führen Sie Experimente in dreifacher Ausführung durch und bilden Sie eine ausreichende Anzahl von Feldern ab, um mindestens 100 Beobachtungen pro Probe oder Bedingung durchzuführen. Bilde alle Halbbilder und Proben, einschließlich der Bedienelemente, mit den gleichen Belichtungseinstellungen.
Quantifizieren Sie mit einer geeigneten Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle für Open-Source- und kommerzielle Software, die diese Analyse in einzelnen oder mehreren ebenen Bildern durchführen kann).
1. Segmentieren Sie Zellkerne basierend auf der DAPI-Färbung. Führen Sie die Detektion von nuklearen PLA-Punkten durch. Ordnen Sie die PLA-Punkte dem entsprechenden Kern zu. Exportieren Sie PLA-Punkte pro Kernergebnisse als csv-Datei (siehe Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2).
Statistische Analyse (siehe Materialtabelle für vorgeschlagene Open-Source- und kommerzielle Software).
1. Überprüfen Sie mit einem Shapiro-Wilk-Test, ob die Stichproben einer Normalverteilung folgen.
2. Bestimmen Sie, ob es einen signifikanten Unterschied zwischen zwei Stichproben gibt, indem Sie einen Student-t-Test (wenn die Normalverteilungsannahme erfüllt ist) oder einen Wilcoxon-Rangsummentest (wenn die Normalverteilungsannahme für eine Stichprobe verletzt wird) verwenden.
Datenvisualisierung: Generieren Sie Punktdiagramme in Kombination mit Boxplots, um die Datenverteilung, den Median (Q₂),^{das 25}^. (Q₁) und das 75. Perzentil für die verschiedenen Stichproben zu visualisieren (siehe Materialtabelle für vorgeschlagene Open-Source- und kommerzielle Software).

4.3D Darstellung von pMCM2: ICL-Wechselwirkungen

Bildgeben Sie PLA-Platten auf einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop mit einem Plan Fluor 60x/1,25 Ölobjektiv mit numerischer Apertur. Erfassen Sie 16 Stapel mit einer Fläche von 1,6 mm und erstellen Sie die 3D-Rekonstruktion mit der entsprechenden Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle).

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Representative Results

PLA von Dig-TMP mit Replisomproteinen
Der Aufbau des Dig-TMP ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Details der Synthese, bei der Trimethylpsoralen durch einen Glykollinker an Digoxigenin konjugiert wurde, wurden bereits diskutiert^17,21. Die Inkubation von Zellen mit der Verbindung und anschließende Bestrahlung mit 365 nm Licht (UVA) photoaktiviert die Verbindung und treibt die Vernetzungsreaktion an. Etwas mehr als 90% der Addukte sind ICLs¹⁶. Der Dig-Tag kann durch Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden, die das Vorhandensein von ICLs im gesamten Zellkern zeigt (Abbildung 2). Die Immunfluoreszenz eines Replisomproteins wie MCM2 deutet ebenfalls auf eine Verteilung im gesamten Zellkern hin, eine Verteilung, die durch die Einführung von ICLs nicht beeinflusst wird. Diese Ergebnisse zeigten, dass das fokale Erscheinungsbild von antwortenden Proteinen, wie es in der DNA-Schadensantwort (DDR) auf DSBs zu sehen ist, kein Merkmal von Replisom-ICL-Interaktionen ist.

Um die Interaktion von Replisomen mit ICLs in dem in Abb. 2 gezeigten Experiment zu visualisieren, wurde das PLA verwendet, das die Nähe zweier Antigene anzeigt (Abbildung 3a). Wir haben die Häufigkeit der Assoziation von MCM5 und dem Dig-Tag 1 h nach Einführung der ICLs gemessen (Abbildung 3b). Die PLA-Signale zeigten die Nähe von Replisomen zu ICLs.

Replikationsstress, auch durch ICLs, aktiviert die ATR-Kinase²². Zu den vielen Substraten von ATR gehören MCM-Proteine, darunter MCM2 an Serin 108²³. Es ist zu erwarten, dass eine erneute Begegnung mit dem ICL zur Phosphorylierung von MCM2 und vielen anderen Substraten führt. In Übereinstimmung mit dieser Erwartung war die PLA zwischen pMCM2Ser108 und dem Dig-Tag positiv (Abbildung 3c). In anderen Experimenten fanden wir heraus, dass die Plateaufrequenz bei 1 h²⁰ erreicht wurde. Wir interpretierten diese Ergebnisse als Hinweis darauf, dass Replisomen, die unterschiedlich im Genom lokalisiert sind und unterschiedlich weit von einer ICL entfernt sind, schließlich auf den Block treffen, was die ATR-Aktivierung und die MCM2-Phosphorylierung auslöst.

Die PLA-Ergebnisse in den obigen Abbildungen werden als komprimierte Summe mehrerer optischer Ebenen dargestellt. Die Ergebnisse einzelner Kerne können aber auch in einer dreidimensionalen Rekonstruktion dargestellt werden, wie für das pMCM2: Dig-TMP PLA in Video 1 gezeigt. Diese Analyse deutete darauf hin, dass Replisom-Begegnungen mit den ICLs im gesamten Zellkern beobachtet werden konnten.

Unsere Untersuchung der Replikationsgabel zeigte, dass ICL-Begegnungen ein unerwartetes Phänomen des Replikationsneustarts zeigten¹⁶. Unter Berücksichtigung der Locked-Ring-Struktur eines funktionellen Replisoms war es von erheblichem Interesse zu fragen, ob sich die Zusammensetzung der Replikationsapparatur bei der Kollision mit einer ICL ändert. Da weniger als 10% der Replikationsgabeln mit einer ICL in Kontakt kommen, wäre es nicht zielführend gewesen, einfach die Proteinzusammensetzung aller Replisomen zu bestimmen. Das PLA zwischen Dig und verschiedenen Komponenten ermöglichte es uns jedoch, diese Frage zu beantworten. Im Gegensatz zu den positiven Ergebnissen mit pMCM2 stellten wir fest, dass die Proteine des GINS-Komplexes kein PLA-Signal mit den ICLs lieferten. Andererseits war der Assay mit CDC45 positiv, was darauf hindeutet, dass das andere Locking-Protein erhalten blieb (Abbildung 4a,b). Wenn Zellen mit einem ATR-Inhibitor inkubiert wurden, wurde der Neustart vollständig unterdrückt und der GINS: Dig PLA war stark positiv (Abbildung 4c). Unsere Interpretation dieser Ergebnisse war, dass in Abwesenheit von ATR-Aktivität die GINS-Proteine erhalten blieben, die CMG-Helikase in einer gesperrten Konfiguration blieb und es keinen Replikationsneustart nach dem ICL²⁰ gab.

Abbildung 1: Struktur von Trimethylpsoralen, das mit dem Digoxigenin-Antigen-Tag verknüpft ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Die Immunfluoreszenz des Replisomproteins MCM5 und des DIG TMP zeigt keine diskreten Foci. Die Zellen wurden mit Dig-TMP und UVA behandelt und nach 1 h auf MCM5 und Dig immungefärbt. Der weiße Balken steht für 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: PLA zwischen Dig-TMP und MCM5. (a) Schematische Darstellung des Proximity-Ligations-Assays, der auf die Wechselwirkung zwischen dem MCM5-Replisomprotein und dem Dig-Tag auf der ICL angewendet wird. Das Schema ist vereinfacht. In der Praxis wurden primäre Antikörper durch sekundäre Antikörper gebunden, die kovalent an die Oligonukleotide gekoppelt waren. b) PLA zwischen MCM5 und Dig-TMP. Beachten Sie die diskreten Signale, die Interaktionsorte anzeigen. Punkt- und Boxplots, die die Signalverteilung (Dotplot) sowie den Median (roter Balken des Boxplots), das 25. und 75. Perzentil (Boxenden) und die höchsten und niedrigsten Werte ohne Ausreißer (Extremlinien) zeigen^. Der Wilcoxon-Rank-Sum-Test bestätigte, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Bedingungen gibt (p<0,001). Die weißen Balken repräsentieren 5 μm. (c) PLA zwischen pMCM2 und Dig-TMP. Diese Signale repräsentieren die Begegnung des Replisoms mit dem ICL, was eine ATR-abhängige Phosphorylierung von MCM2 auslöst. Die PLA gibt die Variabilität der Begegnungshäufigkeit in verschiedenen Zellen an. Der weiße Balken steht für 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: PLA zwischen Dig-TMP und den Replisom-Locking-Proteinen. a) CDC45: Dig-TMP. Der weiße Balken steht für 5 μm. (b) PSF1: Dig-TMP. Die minimale Signalfrequenz wird durch die Behandlung mit einem ATR-Inhibitor, der den Traversenweg und die Freisetzung des GINS-Komplexes, der PSF1 enthält, blockiert, stark erhöht. Die weißen Balken repräsentieren 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 1: Dreidimensionale Rekonstruktion von pMCM2: Dig PLA-Signale zeigen die Verteilung im gesamten Zellkern. PCNA ist grün gefärbt, PLA rot, DAPI blau. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 1: Cellprofiler-Pipeline für die PLA-Quantifizierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: IMARIS-Zellmodul-Chargenparameter für die PLA-Quantifizierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Obwohl die PLA eine sehr leistungsfähige Technik ist, gibt es technische Bedenken, die gelöst werden müssen, um klare und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die Antikörper müssen eine hohe Affinität und Spezifität aufweisen. Darüber hinaus ist es wichtig, die unspezifischen Hintergrundsignale so weit wie möglich zu reduzieren. Wir haben festgestellt, dass Membranen und Zelltrümmer zum Hintergrund beitragen, und wir haben sie so weit wie möglich entfernt. Das Waschen mit Waschmittel, das Puffer enthält, vor dem Fixieren und das Waschen mit Methanol nach dem Fixieren tragen dazu bei, die unspezifische Bindung zu reduzieren. Der Nachteil ist, dass eine Waschmittelbehandlung vor der Fixierung zu einer Zellablösung führen kann. Wir stellen fest, dass die Behandlung der Platten mit einem Zellkleber und die Vorfixierung mit 0,1% FA vor der CSK-Behandlung dieses Problem lindern.

Es ist auch hilfreich, Nicht-S-Phasen-Zellen zu identifizieren, wenn S-Phasen-spezifische Ereignisse überwacht werden. Dies kann durch eine Post-PLA-Färbung mit Zellzyklusmarkern wie PCNA oder NPAT^24,25 erfolgen. Diese Marker bestätigen nicht nur S-Phasen-Phänomene, sondern bieten auch eine interne biologische Kontrolle für unspezifische Interaktionen. Positive Signale in G1-Phasenzellen in Assays, die Ereignisse messen, die ausschließlich der S-Phase vorbehalten sein sollten, sind ein Hinweis darauf, dass zusätzliche Anstrengungen erforderlich sind, um unspezifische Wechselwirkungen zu reduzieren.

Einzelzell-Bildgebungsstrategien haben Vorteile, die mit anderen Ansätzen zur Überwachung molekularer Wechselwirkungen nicht verfügbar sind. Homogenisierungstechniken, wie sie in Immunpräzipitationsexperimenten eingesetzt werden, eliminieren jede Verbindung zu Ereignissen in einzelnen Zellen. Folglich gehen Erkenntnisse über den Einfluss des Zellzyklusstatus oder der Variabilität innerhalb einer Zellpopulation verloren. Da die PLA jedoch Ereignishäufigkeiten in einzelnen Zellen meldet, können diese Erkenntnisse wiedergewonnen werden.

Eine häufige Einschränkung der PLA ist das Fehlen immunologischer Nachweisreagenzien für Ziele. Dies ist ein Problem, wenn es darum geht, Fragen zur zellulären Reaktion auf DNA-Störungen zu beantworten, die durch andere Wirkstoffe als direkte Brecher verursacht werden. Wir haben diese Einschränkung durch die Verwendung eines immunmarkierten DNA-reaktiven Reagenzes überwunden. Obwohl wir uns in unseren Studien auf die Vernetzung zwischen den Strängen konzentriert haben, gibt es viele genotoxische Verbindungen, einschließlich Chemotherapeutika, die sich für diesen Ansatz eignen würden. Darüber hinaus könnten mit dieser Strategie auch Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA-Strukturen, wie z.B. G-Quadruplexen, untersucht werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde zum Teil durch das Intramural Research Program des NIH, National Institute on Aging, USA, unterstützt (Z01-AG000746–08). J.H. wird von den National Natural Science Foundations of China (21708007 und 31871365 unterstützt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10011	1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip	MatTek	P35-1.5-14-C	Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10001	1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit)	Abcam	ab126762	1 in 200
Cell adhesive	Life Science	354240	for cell-TAK solution
Confocal microscope	Nikkon	Nikon TE2000 spinning disk microscope	equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)	Abcam	ab420	1 in 200
Dig-TMP	synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents	Sigma-Aldrich	DUO92007	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope	Zeiss	Axiovert 200M microscope	Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16%	Fisher Scientific	PI28906	for fix solution
Goat serum	Thermo	31873	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software	open source	Cell profiler	works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required	Bitplane	Imaris	Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82029	reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82009	reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit)	Abcam	ab4461	1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal)	Abcam	Ab75975	1 in 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)	Abcam	ab109271	1 in 200
Polymerase (10 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82030	reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 antibody (rabbit)	Abcam	ab181112	1 in 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software	open source	R studio	ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Southern New England Ultraviolet		Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	final concentrtion is 1µM

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally