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Biology

Visualização de Encontros de Replisome com uma Lesão de Bloqueio com Antígeno Marcado

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Enquanto colisões de bifurcação de replicação com adutos de DNA podem induzir quebras de fita dupla, pouco se sabe sobre a interação entre replisomos e lesões de bloqueio. Empregamos o ensaio de ligadura de proximidade para visualizar esses encontros e caracterizar as consequências para a composição do replisome.

Abstract

Considerável conhecimento está presente na resposta celular a quebras de fita dupla (DSBs), induzidas por nucleases, radiação e outros quebradores de DNA. Em parte, isso reflete a disponibilidade de métodos para a identificação de locais de quebra e caracterização de fatores recrutados para DSBs nessas sequências. No entanto, os DSBs também aparecem como intermediários durante o processamento de adutos de DNA formados por compostos que não causam diretamente quebras e não reagem em locais específicos de sequência. Consequentemente, para a maioria desses agentes, tecnologias que permitem a análise de interações de ligação com fatores de resposta e proteínas de reparo são desconhecidas. Por exemplo, ligações cruzadas de DNA interstrand (ICLs) podem provocar quebras após encontros de bifurcação de replicação. Apesar de formados por fármacos amplamente utilizados como quimioterápicos do câncer, ainda não existe uma metodologia para monitorar suas interações com proteínas de replicação.

Aqui, descrevemos nossa estratégia para acompanhar a resposta celular a colisões de bifurcação com esses adutos desafiadores. Ligamos um antígeno esteroide ao psoraleno, que forma ICLs dependentes de fotoativação em núcleos de células vivas. As LCIs foram visualizadas por imunofluorescência contra o antígeno tag. A tag também pode ser parceira no Ensaio de Ligadura de Proximidade (PLA), que relata a associação próxima de dois antígenos. O PLA foi explorado para distinguir proteínas que estavam intimamente associadas com as ICLs marcadas daquelas que não estavam. Foi possível definir proteínas replisomes que foram retidas após encontros com ICLs e identificar outras que foram perdidas. Esta abordagem é aplicável a qualquer estrutura ou aduto de DNA que possa ser detectado imunologicamente.

Introduction

A resposta celular a quebras de fitas duplas está bem documentada devido a uma sucessão de métodos cada vez mais poderosos para direcionar quebras para sítios genômicos específicos 1,2,3. A certeza da localização permite a caracterização inequívoca de proteínas e outros fatores que se acumulam no local e participam da Resposta a Danos no DNA (DDR), conduzindo assim as vias de Junção Final Não Homóloga (NHEJ) e Recombinação Homóloga (HR) que reparam quebras. É claro que muitas quebras são introduzidas por agentes como radiação e espécies químicas que não atacam sequências específicas4. Entretanto, para estes existem procedimentos disponíveis que podem converter as extremidades em estruturas passíveis de marcação e localização 5,6. As quebras também são introduzidas por processos biológicos, como o rearranjo de imunoglobulinas, e tecnologia recente permite sua localização, assim como7. A relação entre os fatores de resposta e esses locais pode então ser determinada.

As quebras também aparecem como uma consequência indireta de adutos formados por compostos que não são disjuntores inerentes, mas interrompem transações de DNA, como transcrição e replicação. Eles podem ser formados como uma característica da resposta celular a essas obstruções, talvez durante o reparo ou porque provocam uma estrutura vulnerável ao ataque de nucleases. Tipicamente, a relação física entre o aduto, a quebra e a associação com fatores respondedores é inferencial. Por exemplo, as LCIs são formadas por quimioterápicos como cisplatina e mitomicina C8 e como produto reacional de sítios abásicos9. As ILPs são bem conhecidas como blocos potentes para bifurcações de replicação10, estancando assim garfos que podem ser clivados por nucleases11. A ligação covalente entre as fitas é frequentemente aliviada por vias que têm quebras obrigatórias como intermediários12,13, necessitando de recombinação homóloga para reconstruir a bifurcação de replicação 14. Na maioria dos experimentos, o investigador acompanha a resposta de fatores de interesse às quebras que se formam a jusante da colisão de uma bifurcação de replicação com uma ICL. Entretanto, como não há tecnologia para a localização de uma lesão provocativa, a proximidade do replisome, e de suas partes componentes, com a LCI só pode ser presumida.

Desenvolvemos uma estratégia para permitir a análise de associações de proteínas com adutos covalentes não sequenciais específicos, ilustrada aqui por ILPs. Em nosso sistema, estes são introduzidos pelo psoraleno, um produto natural fotoativo utilizado há milhares de anos como terapêutico para doenças de pele15. Nossa abordagem é baseada em duas características importantes dos psoralens. O primeiro é a alta frequência de formação de ligações cruzadas, que pode ultrapassar 90% dos adutos, em contraste com os menos de 10% formados por compostos populares como a cisplatina ou a mitomicina C 8,16. A segunda é a acessibilidade do composto à conjugação sem perda da capacidade de reticulação. Nós ligamos covalentemente o trimetil psoraleno à digoxigenina (Dig), um imunotag há muito estabelecido. Isso permite a detecção dos adutos psoralenos no DNA genômico por imunomarcação do tag Dig e visualização por imunofluorescênciaconvencional17.

Este reagente foi aplicado, em nosso trabalho anterior, na análise de encontros de bifurcação de replicação com ILCs usando um ensaio baseado em fibras de DNA16. Nesse trabalho, descobrimos que a replicação poderia continuar após uma ICL intacta. Isso foi dependente da quinase ATR, que é ativada pelo estresse de replicação. O reinício da replicação foi inesperado, dada a estrutura da helicase replicativa da CMG. Este consiste no hetero-hexâmero MCM (M) que forma um anel deslocado ao redor da fita molde para a síntese da fita principal que é bloqueada pelas proteínas do complexo GINS (G, consistindo de PSF1, 2, 3 e SLD5) e CDC45 (C)18. A proposta de que a replicação poderia ser reiniciada no lado da LCI distal ao lado da colisão do replisome defendia uma mudança na estrutura do replisome. Para abordar a questão de quais componentes estavam no replisome no momento do encontro com uma ICL, desenvolvemos a abordagem aqui descrita. Exploramos o tag Dig como parceiro em Ensaios de Ligadura de Proximidade (PLA)19 para interrogar a estreita associação da LCI com proteínas do replisome20.

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Protocol

1. Preparação celular

  1. Dia 1
    1. Pré-trate pratos de cultura com fundo de vidro de 35 mm com uma solução adesiva celular.
    2. Células em placa nos pratos pré-tratados um dia antes do tratamento. A célula deve estar se dividindo ativamente e 50-70% confluente no dia do experimento.
      OBS: Células HeLa foram utilizadas neste experimento com Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1x penicilina/estreptomicina. Não há restrição para linhagens celulares aderentes. No entanto, células não aderentes devem ser centrifugadas em lâminas e fixadas antes da análise por PLA.
  2. Dia 2
    1. Preparar uma solução-mãe de Digoxigenina Trimetil psoraleno (Dig-TMP) ressuspendendo uma alíquota congelada de Dig-TMP previamente sintetizada em 1:1 EtOH:H 2 O. Determinar aconcentração medindo OD a 250 nm de uma diluição de 100x (em H2O) do Dig-TMP dissolvido. O coeficiente de extinção do Dig-TMP é de 25.000. Verificar a concentração medindo OD a 250 nm antes de cada utilização e calcular a concentração de existência: Abs x 100 x 106/25.000 = Concentração (em μM). Geralmente, a solução estoque é em torno de 3 mM. A solução pode ser armazenada em –20 °C por cerca de um mês.
      NOTA: Dig-TMP deve ser sintetizado quimicamente com antecedência, seguindo o procedimento descrito aqui. Refluxo 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno com 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodi-amina em tolueno sob nitrogênio por 12 h. Remover o solvente e recuperar o produto 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno por cromatografia de sílica gel. Conjugar o produto ao éster NHS de digoxigenina em dimetilformamida e trietilamina a 50 °C durante 18 horas. Remova o solvente e purifice o resíduo por cromatografia preparativa em camada delgada de sílica gel. Eluir a banda do produto clorofórmio: metanol: mistura de hidróxido de amónio a 28% (8:1:0.1). Evaporar os solventes e dissolver o pellet em 50% de EtOH:H2O.
    2. Adicionar o estoque de Dig-TMP em 50% de EtOH:H2O ao meio de cultura celular até uma concentração final de 5 μM. Levar o meio a 37 °C. Aspirar o meio das placas, adicionar o meio contendo Dig-TMP pré-aquecido e colocar as placas em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) por 30 min para permitir que o Dig-TMP se equilibre.
    3. Enquanto as células estão incubando, pré-aqueça a caixa UV (ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
    4. Colocar as placas na caixa UV pré-aquecida e expor as células a uma dose de 3 J/cm2 de luz UVA por 5 min para este experimento. As placas foram colocadas sobre um termobloco mantido a 37 °C, durante a irradiação. Calcule o tempo usando a fórmula:
      Equation 1
    5. Aspirar o meio com uma pipeta, adicionar o meio pré-aquecido fresco e colocar as placas de volta na incubadora a 37 °C, 5% CO2 por 1 h.
    6. Retire o meio e lave a louça uma vez suavemente com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    7. Remover PBS e adicionar 0,1% de formaldeído (FA) em PBS por 5 min à temperatura ambiente (TR). Isso evita o desprendimento celular durante o pré-tratamento do CSK-R (tampão de extração do citoesqueleto contendo RNase, descrito em 1.2.9.) necessário para extrair os elementos citoplasmáticos e reduzir o fundo do PLA.
    8. Aspirar FA e lavar a louça com PBS uma vez.
    9. Adicionar tampão CSK-R e incubar por 5 min em RT para remover o citoplasma [tampão CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM sacarose, 3 mM MgCl2, 0,5%Triton X-100, 300 μg/mL RNase A]. Aspirar o tampão, adicionar CSK-R fresco e incubar por 5 min no TR.
      NOTA: Um estoque de buffer CSK pode ser armazenado a 4 °C, e Triton X e RNaseA adicionados logo antes do uso.
    10. Lave com PBS três vezes.
    11. Fixar as células com formaldeído a 4% em PBS por 10 min em TR.
    12. Lave as células com PBS. Execute esta etapa três vezes.
    13. Adicionar metanol 100% frio e incubar por 20 min a -20 °C.
    14. Lave as células com PBS três vezes. Neste ponto, as células podem ser armazenadas em PBS em uma câmara úmida a 4 °C por até uma semana.
    15. Incubar as células em 80 μL de TritonX-100 5 mM durante 10 min a 4 °C.
    16. Incubar células com 100 μL de EDTA 5 mM em PBS suplementado com 1 μL de 100 mg/mL RNase A por 30 min a 37 °C.
    17. Lave as células com PBS três vezes.
    18. Armazenar células em tampão de bloqueio (5% de BSA e 10% de soro de cabra em PBS) em uma câmara úmida durante a noite a 4 °C.

2. Ensaio de ligadura de proximidade

OBS: Realizar ensaio de ligadura de proximidade no dia 3.

  1. Coloração de anticorpos
    1. Preparar 40 μL da solução de anticorpos primários por placa: Adicionar o volume apropriado de anticorpos primários para alcançar a diluição desejada (antidigoxigenina de camundongo e anticorpo de coelho contra um componente de replisome como MCM5, CDC45, PSF1 ou pMCM2, diluições especificadas na Tabela de Materiais) no tampão de bloqueio (para atingir um volume final de 24 μL). Misture batendo e deixe descansar por 20 minutos no RT. Prepare uma mistura mestre para várias amostras e misture tocando antes de aplicar nos poços.
    2. Adicionar 40 μL de solução de anticorpos primários ao centro do poço e incubar numa câmara húmida durante 1 h a 37 °C. Durante a coloração, deixe as sondas de PLA e o tampão de bloqueio aquecerem até a temperatura ambiente.
    3. Lave as células com PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 em 1X PBS] no RT. Execute esta etapa três vezes.
    4. Durante a lavagem, prepare 40 μL de solução de sonda de PLA por prato (as sondas de PLA consistem em um anticorpo secundário que reconhece IgG de coelho ou camundongo, ligada covalentemente a um oligonucleotídeo PLUS ou MINUS): 8 μL de sonda PLA anti mouse-PLUS + 8 μL de sonda PLA anticorpo anticoelho-MENOS + 24 μL de tampão de bloqueio. Misture e deixe descansar por 20 min no RT. Prepare uma mistura mestre para várias amostras e misture bem antes de aplicar nos poços. Coloque a solução no meio do poço no prato.
    5. Remover a última lavagem, adicionar 40 μL de solução de sonda de PLA ao centro do poço e incubar em uma câmara úmida por 1 h a 37 °C.
    6. Lavar em tampão A três vezes, por 10 min cada, em uma plataforma basculante em RT. Durante a lavagem, leve a mistura de ligadura para RT.
  2. Ligadura e amplificação
    1. Preparar 40 μL de mistura de ligadura por placa: 8 μL (5x) de caldo de ligadura + 31 μL de água destilada + 1 μL de ligase. Prepare a mistura mestra para várias placas e misture bem antes de aplicar nos poços.
    2. Adicionar 40 μL de solução de ligadura a cada placa e incubar numa câmara húmida durante 30 minutos a 37 °C.
    3. Lave as células 3x com tampão A, cada uma por 2 min, em uma plataforma basculante em RT.
    4. Preparar 40 μL de solução de amplificação por prato: 8 μL (5x) de estoque de amplificação + 31,5 μL de água destilada + 0,5 μL de DNA Polimerase. Prepare uma mistura mestra para várias amostras e misture bem antes de aplicar nos poços.
    5. Adicionar 40 μL de solução de amplificação a cada placa e incubar numa câmara húmida a 37 °C durante 100 min.
    6. Aspirar a solução de amplificação e lavar com tampão B. Realizar 6 lavagens cada por 10 min, em uma plataforma basculante em RT.
    7. Lavar uma vez com 0,01x tampão B por 1 min no TR.
    8. Aspirar o tampão B e incubar placas com anticorpos secundários, Alexa Fluor 488 anti-ratinho IgG e Alexa Fluor 568 anti-coelho IgG em solução de bloqueio em diluições apropriadas em tampão de bloqueio, numa câmara húmida, durante 30 minutos a 37 °C ou durante a noite a 4 °C.
    9. Lave as células três vezes com PBS-T, por 10 min cada, em uma plataforma basculante em RT.
    10. Aspirar PBS-T e montar em meio de montagem com DAPI. As placas montadas podem ser fotografadas imediatamente ou armazenadas a 4 °C no escuro por no máximo 4 dias antes da obtenção de imagens.

3. Imagem e quantificação

  1. Realizar imagens em um microscópio epifluorescente ou confocal (se a imagem 3D for desejável, cubra pelo menos 3 μm em 15 pilhas). Realizar experimentos em triplicata e obter imagens de um número suficiente de campos para fazer pelo menos 100 observações por amostra ou condição. Crie imagens de todos os campos e amostras, incluindo controles, usando as mesmas configurações de exposição.
  2. Quantifique com um software de análise de imagem apropriado (consulte Tabela de Materiais para software de código aberto e comercial capaz de realizar essa análise em imagens de plano único ou múltiplo).
    1. Núcleos celulares segmentados com base na coloração DAPI. Realizar detecção de pontos nucleares do PLA. Atribua pontos PLA ao seu núcleo correspondente. Exporte pontos PLA por resultados de núcleo como um arquivo csv (consulte Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2).
  3. Análise estatística (ver Tabela de Materiais para software comercial e de código aberto sugerido).
    1. Verifique se as amostras seguem uma distribuição normal com um teste de Shapiro-Wilk.
    2. Determine se há uma diferença significativa entre duas amostras usando um teste t de Student (se a suposição de distribuição normal for atendida) ou um teste de Wilcoxon-Rank Sum (se a suposição de distribuição normal for violada para uma amostra).
  4. Visualização de dados: Gere gráficos de pontos combinados com gráficos de caixa para visualizar a distribuição dos dados, mediana (Q2), 25º (Q1) e percentil 75 para as diferentesamostras (Veja Tabela de Materiais para software comercial e de código aberto sugerido).

4.3D exibição de pMCM2: interações ICL

  1. Imagem de placas PLA em microscópio confocal de disco giratório, usando uma objetiva de óleo de abertura numérica Plan Fluor 60x/1.25. Adquira 16 pilhas cobrindo 1,6 mm e gere a reconstrução 3D com o software de análise de imagem apropriado (consulte a Tabela de Materiais).

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Representative Results

PLA de Dig-TMP com proteínas replisome
A estrutura do Dig-TMP é mostrada na Figura 1. Os detalhes da síntese, na qual o trimetilpsoraleno foi conjugado através de um ligante glicol à digoxigenina, foram discutidos anteriormente17,21. A incubação das células com o composto seguida de exposição à luz de 365 nm (UVA) fotoativa o composto e conduz a reação de reticulação. Pouco mais de 90% dos adutos são LCIs16. O Dig tag pode ser visualizado por imunofluorescência que revela a presença de LCIs em todo o núcleo (Figura 2). A imunofluorescência de uma proteína replisome como MCM2 também indica uma distribuição por todo o núcleo, uma distribuição que não é afetada pela introdução de ICLs. Esses resultados demonstraram que o aparecimento focal de proteínas respondentes, como visto na resposta a danos no DNA (DDR) a DSBs, não é uma característica das interações replisome: ICL.

Para visualizar a interação dos replissomos com as LCIs no experimento mostrado na Fig. 2 foi aplicado o PLA, que relata a proximidade de dois antígenos (Figura 3a). Medimos a frequência de associação da MCM5 e do tag Dig 1 h após a introdução das LCIs (Figura 3b). Os sinais de PLA demonstraram a proximidade dos replisomos às ILPs.

O estresse de replicação, incluindo o apresentado pelas LCIs, ativa a ATR quinase22. Entre os muitos substratos da ATR estão as proteínas MCM, incluindo MCM2 na serina108 23. Espera-se que um encontro replisome com a ICL resulte na fosforilação de MCM2, entre muitos outros substratos. De acordo com essa expectativa, o PLA entre o pMCM2Ser108 e o tag Dig foi positivo (Figura 3c). Em outros experimentos verificamos que a frequência de platô foi atingida em 1 h20. Interpretamos esses resultados como indicando que os replisomos localizados variadamente ao longo do genoma, e variavelmente distantes de uma ICL, eventualmente encontram o bloco, desencadeando a ativação de ATR e a fosforilação de MCM2.

Os resultados do PLA nas figuras anteriores são apresentados como uma soma comprimida de múltiplos planos ópticos. No entanto, os resultados de núcleos individuais também podem ser apresentados em uma reconstrução tridimensional, como mostrado para o pMCM2: Dig-TMP PLA no Vídeo 1. Essa análise indicou que encontros replisome com as ILCs puderam ser observados em todo o núcleo.

Nosso estudo da bifurcação de replicação mostrou que os encontros com a LCI revelaram um fenômeno inesperado de reinicialização da replicação16. Considerando a estrutura do anel bloqueado de um replissoma funcional, foi de considerável interesse perguntar se a composição do aparelho de replicação mudou ao colidir com um LCI. Como menos de 10% dos garfos de replicação entram em contato com uma ICL, simplesmente avaliar a composição proteica de todos os replisomos não teria sido produtivo. No entanto, o PLA entre o Dig e vários componentes nos permitiu abordar essa questão. Em contraste com os resultados positivos com pMCM2, descobrimos que as proteínas do complexo GINS falharam em dar sinal de PLA com as ILPs. Por outro lado, o ensaio com CDC45 foi positivo, indicando que a outra proteína de bloqueio estava retida (Figura 4a,b). Quando as células foram incubadas com um inibidor de ATR, o reinício foi completamente suprimido e o GINS: Dig PLA foi fortemente positivo (Figura 4c). Nossa interpretação desses resultados foi que, na ausência de atividade ATR, as proteínas GINS foram mantidas, a helicase CMG permaneceu em uma configuração bloqueada e não houve reinicialização da replicação após a LCI20.

Figure 1
Figura 1: Estrutura do trimetilpsoraleno ligado ao tag do antígeno da digoxigenina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A imunofluorescência da proteína replisome MCM5 e DIG TMP não mostra focos discretos. As células foram tratadas com Dig-TMP e UVA e após 1 h imunomarcadas para MCM5 e Dig. A barra branca representa 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: PLA entre Dig-TMP e MCM5. (a) Esquema do Ensaio de Ligadura de Proximidade aplicado à interação entre a proteína replisome MCM5 e o tag Dig no ICL. O esquema é simplificado. Na prática, os anticorpos primários foram ligados por anticorpos secundários acoplados covalentemente aos oligonucleotídeos. (b) PLA entre MCM5 e Dig-TMP. Observe os sinais discretos que indicam locais de interação. Gráficos de pontos e caixas mostrando a distribuição do sinal (gráfico de pontos), bem como a mediana (barra vermelha do gráfico de caixa), os percentis 25e 75 (finais de caixa) e os maiores e menores valores excluindo outliers( linhas extremas). O teste da soma de Wilcoxon-Rank confirmou que há diferença significativa entre as duas condições (p<0,001). As barras brancas representam 5 μm. (c) PLA entre pMCM2 e Dig-TMP. Esses sinais representam o encontro do replisome com a LCI, que desencadeia uma fosforilação dependente de ATR da MCM2. O PLA relata a variabilidade da frequência de encontro em diferentes células. A barra branca representa 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: PLA entre o Dig-TMP e as proteínas bloqueadoras do replisome. a) CDC45: Dig-TMP. A barra branca representa 5 μm. (b) PSF1: Dig-TMP. A frequência mínima de sinal é grandemente aumentada pelo tratamento com um inibidor de ATR, que bloqueia a via transversal e a liberação do complexo GINS que inclui PSF1. As barras brancas representam 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Reconstrução tridimensional do pMCM2: Os sinais Dig PLA demonstram a distribuição por todo o núcleo. PCNA é corado em verde, PLA em vermelho, DAPI em azul. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo Suplementar 1: Pipeline Cellprofiler para quantificação de PLA. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Parâmetros de lote do módulo celular IMARIS para quantificação de PLA. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Embora o PLA seja uma técnica muito poderosa, existem preocupações técnicas que devem ser resolvidas para a obtenção de resultados claros e reprodutíveis. Os anticorpos devem ser de alta afinidade e especificidade. Além disso, é importante reduzir ao máximo os sinais de fundo não específicos. Descobrimos que membranas e detritos celulares contribuem para o fundo e os removemos o máximo possível. As lavagens com detergente contendo tampões antes da fixação, e a lavagem com metanol após a fixação ajudam a reduzir a ligação inespecífica. A ressalva é que o tratamento com detergente antes da fixação pode resultar em descolamento celular. Verificamos que tratar as placas com adesivo celular e prefixar com AG 0,1% antes do tratamento com CSK alivia esse problema.

Também é útil identificar células de fase não-S ao monitorar eventos específicos da fase S. Isso pode ser feito pela coloração pós-PLA com marcadores do ciclo celular, como PCNA ouNPAT24,25. Esses marcadores não apenas confirmam os fenômenos da fase S, mas também fornecem um controle biológico interno para interações não específicas. Sinais positivos em células da fase G1, em ensaios que medem eventos que deveriam ser exclusivos da fase S, são uma indicação de que é necessário um esforço adicional para reduzir interações não específicas.

Estratégias de imagem unicelular têm vantagens não disponíveis com outras abordagens para monitorar interações moleculares. Técnicas de homogeneização, como as empregadas em experimentos de imunoprecipitação, eliminam qualquer conexão com eventos em células individuais. Consequentemente, perde-se a percepção sobre a influência do status do ciclo celular, ou a variabilidade ao longo de uma população celular. No entanto, como o PLA relata frequências de eventos em células individuais, esses insights podem ser recuperados.

Uma limitação frequente do PLA é a falta de reagentes de detecção imunológica para alvos de interesse. Esta é uma preocupação quando se abordam questões relativas à resposta celular a perturbações do DNA introduzidas por outros agentes que não os disjuntores diretos. Superamos essa limitação com o uso de um reagente reativo de DNA imunomarcado. Embora tenhamos focado nossos estudos em ligações cruzadas interstrand, existem muitos compostos genotóxicos, incluindo drogas quimioterápicas, que se prestariam a essa abordagem. Adicionalmente, interações entre proteínas e estruturas de DNA, como os quadruplexos G, também poderiam ser examinadas com essa estratégia.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada, em parte, pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, National Institute on Aging, Estados Unidos (Z01-AG000746–08). J.H. é apoiado pela National Natural Science Foundations of China (21708007 e 31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
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References

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Biologia Edição 173 replisome lesão de bloqueio PLA ensaio de ligadura de proximidade ligações cruzadas de DNA interstrand ligações cruzadas marcadas com antígeno

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Visualização de Encontros de Replisome com uma Lesão de Bloqueio com Antígeno Marcado
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Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

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