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Behavior

Evaluación conductual de la función visual a través de la respuesta optomotora y la función cognitiva a través de Y-Maze en ratas diabéticas

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61806
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1, 1,2, 1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Neuroscience, Emory University, 4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

La degeneración neuronal tanto en los ojos como en el cerebro como resultado de la diabetes se puede observar a través de pruebas de comportamiento realizadas en roedores. El laberinto en Y, una medida de la cognición espacial, y la respuesta optomotora, una medida de la función visual, proporcionan información sobre posibles diagnósticos y tratamientos.

Abstract

La respuesta optomotora y el laberinto en Y son pruebas de comportamiento útiles para evaluar la función visual y cognitiva, respectivamente. La respuesta optomotora es una herramienta valiosa para rastrear los cambios en los umbrales de frecuencia espacial (SF) y sensibilidad al contraste (CS) a lo largo del tiempo en varios modelos de enfermedad de la retina, incluida la retinopatía diabética. Del mismo modo, el laberinto en Y se puede utilizar para monitorear la cognición espacial (medida por alternancia espontánea) y el comportamiento exploratorio (medido por una serie de entradas) en una serie de modelos de enfermedades que afectan el sistema nervioso central. Las ventajas de la respuesta optomotora y el laberinto en Y incluyen sensibilidad, velocidad de las pruebas, el uso de respuestas innatas (no se necesita entrenamiento) y la capacidad de realizarse en animales despiertos (no anestesiados). Aquí, se describen protocolos tanto para la respuesta optomotora como para el laberinto en Y y ejemplos de su uso que se muestran en modelos de diabetes tipo I y tipo II. Los métodos incluyen la preparación de roedores y equipos, el rendimiento de la respuesta optomotora y el laberinto en Y, y el análisis de datos posterior a la prueba.

Introduction

Más de 463 millones de personas viven con diabetes, lo que la convierte en una de las mayores epidemias mundiales de enfermedades1. Una de las complicaciones graves que surgen de la diabetes es la retinopatía diabética (RD), una de las principales causas de ceguera en los adultos estadounidenses en edad de trabajar2. En los próximos 30 años, se prevé que el porcentaje de la población en riesgo de RD se duplique, por lo que es crucial encontrar nuevas formas de diagnosticar la RD en sus primeras etapas para prevenir y mitigar el desarrollo de la DR3. Convencionalmente se ha pensado que la RD es una enfermedad vascular4,5,6. Sin embargo, ahora con evidencia de disfunción neuronal y apoptosis en la retina que precede a la patología vascular, la RD se define como tener componentes neuronales y vasculares4,5,6,7,8,9. Una forma de diagnosticar la RD sería examinar las anomalías neuronales en la retina, un tejido que puede ser más vulnerable al estrés oxidativo y la tensión metabólica de la diabetes que otros tejidos neurales10.

Las disminuciones en la función cognitiva y motora también ocurren con la diabetes y a menudo se correlacionan con cambios en la retina. Las personas mayores con diabetes tipo II presentan un peor rendimiento cognitivo basal y muestran un deterioro cognitivo más exacerbado que los participantes de control11. Adicionalmente, la retina se ha establecido como una extensión del sistema nervioso central y las patologías pueden manifestarse en la retina12. Clínicamente, la relación entre la retina y el cerebro se ha estudiado en el contexto del Alzheimer y otras enfermedades, pero no se explora comúnmente con la diabetes12,13,14,15,16. Los cambios en el cerebro y la retina durante la progresión de la diabetes se pueden explorar utilizando modelos animales, incluida la rata STZ (un modelo de diabetes tipo I en el que la toxina, estreptozotocina o STZ, se usa para dañar las células beta pancreáticas) y la rata Goto-Kakizaki (un modelo poligénico de diabetes tipo II en el que los animales desarrollan hiperglucemia espontáneamente alrededor de las 3 semanas de edad). En este protocolo, se proporciona una descripción del laberinto en Y y la respuesta optomotora para evaluar los cambios cognitivos y visuales en roedores diabéticos, respectivamente. La respuesta optomotora (OMR) evalúa la frecuencia espacial (similar a la agudeza visual) y la sensibilidad al contraste mediante el monitoreo de los movimientos característicos de seguimiento reflexivo de la cabeza para medir los umbrales visuales de cada ojo17. La frecuencia espacial se refiere al grosor o finura de las barras, y la sensibilidad al contraste se refiere a la cantidad de contraste que hay entre las barras y el fondo (Figura 1E). Mientras tanto, el laberinto en Y prueba la memoria espacial a corto plazo y la función exploratoria, observada a través de alternancias espontáneas y entradas a través de los brazos del laberinto.

Ambas pruebas se pueden realizar en animales despiertos y no anestesiados y tienen la ventaja de capitalizar las respuestas innatas de los animales, lo que significa que no requieren entrenamiento. Ambos son relativamente sensibles, ya que pueden usarse para detectar déficits temprano en la progresión de la diabetes en roedores, y confiables, ya que producen resultados que se correlacionan con otras pruebas visuales, retinianas o de comportamiento. Además, el uso de OMR y el laberinto en Y junto con pruebas como el electrorretinograma y las tomografías de coherencia óptica puede proporcionar información sobre cuándo se desarrollan cambios retinianos, estructurales y cognitivos en relación entre sí en modelos de enfermedad. Estas investigaciones podrían ser útiles para identificar las degeneraciones neuronales que ocurren debido a la diabetes. En última instancia, esto podría conducir a nuevos métodos de diagnóstico que identifiquen eficazmente la DR en las primeras etapas de la progresión.

Los sistemas OMR y Y-maze utilizados para desarrollar este protocolo se describen en la Tabla de Materiales. Investigaciones previas sobre el OMR, de Prusky et al.18, y el laberinto en Y, de Maurice et al.19, se utilizaron como punto de partida para desarrollar este protocolo.

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Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Asuntos de Veteranos de Atlanta y se ajustaron a la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Publicaciones de los NIH, 8ª edición, actualizada en 2011).

1. La respuesta optomotora (OMR)

  1. Configurar el aparato OMR (detalles sobre el aparato y el software en la Tabla de materiales)
    1. Elija la plataforma del tamaño adecuado para el roedor: ratón, rata o rata grande/deteriorada (Figura 1A).
    2. Abra el software OMR, que debería abrirse a una ventana con varias pestañas de opciones y una transmisión de video en vivo del interior del OMR / tambor virtual (Figura 1B). Acerque o aleje con la cámara de video según sea necesario para que la plataforma y sus alrededores sean visibles.
    3. Observe los iconos a lo largo del lado izquierdo de la imagen en vivo (Figura 1C). Haga clic en el icono del asterisco y en el icono de las rayas giratorias para que tanto el asterisco verde como las franjas giratorias verdes desaparezcan de la transmisión en vivo.
    4. Haga clic en el icono de la brújula para que aparezca un círculo verde y dos líneas perpendiculares. Estira el círculo verde para que se alinee perfectamente con el círculo negro de la plataforma, lo que asegurará que el OMR esté perfectamente alineado.
    5. Haga clic en el icono de la brújula porque no es necesario ver el círculo durante la prueba. Haga clic en el icono de asterisco verde y en el icono de rayas giratorias verdes para que vuelvan a aparecer. Tenga en cuenta que las rayas verdes giran en la misma dirección que las rayas en el tambor, lo que permite al investigador conocer la dirección de las rayas.
    6. Haga clic en la pestaña Pruebas . En Pruebas, haga clic en la pestaña Psicofísica . En Umbral, seleccione Frecuencia para medir la frecuencia espacial.
      NOTA: El software OMR utiliza un paradigma de escalera para calcular automáticamente la frecuencia espacial (SF). El contraste se mantendrá al 100%.
    7. En Pruebas, haga clic en la pestaña Ajustes preestablecidos . Seleccione la configuración predeterminada para Mouse18 o Rat20.
    8. En Pruebas, haga clic en la pestaña Blanking . Marque la casilla Espacio en blanco en el seguimiento , que pausará las rayas / dejará en blanco las pantallas de la computadora en el tambor cada vez que se haga clic con el botón derecho del mouse.
    9. Haga clic en la pestaña Resultados , que es donde se mostrarán los resultados de la prueba.
  2. Evaluar la frecuencia espacial
    1. Coloque al roedor en la plataforma circular en el centro de la cámara de realidad virtual que comprende cuatro monitores de computadora que muestran rejillas verticales de onda sinusoidal que rodean la cámara a una velocidad de 12 ° / s (Figura 1D).
    2. Tenga en cuenta que la cámara de video colocada en la parte superior de la cámara está proyectando el comportamiento del roedor en vivo en el monitor de la computadora.
    3. Busque la presencia o ausencia de acciones reflexivas por parte de la cabeza del roedor a medida que las rejillas se mueven en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj. Asegúrese de que las barras ilustradas sean visibles en el programa, ya que mostrarán la dirección del movimiento de la rejilla.
      1. Esté atento a que la cabeza del roedor se mueva en la misma dirección que las rejillas. Espere hasta que haya una persecución suave, no ráfagas erráticas de movimiento de la cabeza, para contarlo como seguimiento.
      2. Haga clic en Sí o No según corresponda. Tenga en cuenta que SF comenzará con 0.042 cyc/deg y se ajustará con cada sí y no para que sea más fácil o más difícil (Figura 1E). Haga clic en Restablecer si la prueba debe restablecerse debido a un clic accidental o incorrecto de sí y no.
    4. A medida que se prueba el roedor, asegúrese de mantener el asterisco colocado sobre la cabeza del roedor.
      NOTA: Esto tiene dos efectos: 1) Mantiene la frecuencia espacial correcta. Si el asterisco se coloca entre los hombros, por ejemplo, la frecuencia espacial será menor y las barras serán más fáciles de ver, lo que resultará en una puntuación falsamente alta. 2) Para roedores con ligeros movimientos de cabeza, el asterisco hace que sea más fácil medir si la cabeza realmente se está moviendo.
    5. Esté atento a que el sistema diga "Hecho" cuando se alcanza la frecuencia espacial del roedor. Tenga en cuenta que los botones Sí y No ya no podrán hacer clic.
    6. Haga clic en la pestaña Resultados , que mostrará la frecuencia espacial para el ojo izquierdo, el ojo derecho y los ojos combinados.
      NOTA: A veces, el software se configura de tal manera que los resultados se invierten, es decir, el ojo derecho se informa como el ojo izquierdo y el ojo izquierdo se informa como el ojo derecho. Esto se descubrió al evaluar roedores que tenían solo una lesión ocular en un modelo de glaucoma.
  3. Evaluar la sensibilidad al contraste
    NOTA: Las pruebas de sensibilidad al contraste se pueden realizar inmediatamente después del paso de medición de frecuencia espacial o por sí solas en el mismo día o un día diferente si el roedor parece fatigado después de la prueba de frecuencia espacial (siga los pasos 1-2.2 si solo prueba la sensibilidad al contraste).
    1. Haga clic en la pestaña Pruebas y luego en la pestaña Psicofísica . En Umbral, seleccione Contraste (único) para medir la sensibilidad al contraste.
    2. También utilizando un paradigma de escalera, comience las rejillas con la constante SF en el pico de la curva de sensibilidad al contraste (CS). Para hacer esto, haga clic en la pestaña Estímulo y luego en la pestaña Rejillas . En el cuadro Frecuencia espacial , escriba 0,064 para ratas y 0,103 para ratones.
    3. Comience el contraste al 100% y busque los mismos movimientos reflexivos de la cabeza que se ven durante las pruebas de frecuencia espacial. Tenga en cuenta que el contraste disminuirá a medida que avancen las pruebas hasta que el roedor ya no tenga movimientos reflexivos de la cabeza en respuesta al estímulo (Figura 1E).
    4. Esté atento a que el sistema diga "Listo" y los botones Sí y No ya no se puedan hacer clic una vez que el roedor ya no responda al estímulo visual y se haya alcanzado el umbral de sensibilidad al contraste. Haga clic en la pestaña Resultados , donde se mostrará la sensibilidad al contraste para el ojo izquierdo, el ojo derecho y los ojos combinados.
  4. Realizar análisis posteriores a la prueba
    1. Para los estudios de retinopatía diabética, donde se espera que ambos ojos tengan déficits similares, use la puntuación combinada (promedio de los ojos derecho e izquierdo) para el análisis. Para los modelos que causan daño diferencial a los ojos (es decir, lesión por explosión o glaucoma), mantenga separados los datos del ojo izquierdo y derecho.
    2. Para la frecuencia espacial, use puntajes sin procesar (los datos de la pestaña Resultados ) para el análisis y promedie estos puntajes juntos por grupo (es decir, diabético, control, etc.).
    3. Para sensibilidad al contraste, utilice el valor bruto para calcular la sensibilidad al contraste informada por el contraste michelson a partir de una medición anterior de la luminancia de la pantalla.

2. El laberinto en Y

  1. Preparar roedores para las pruebas
    1. Adapte los roedores a la habitación durante 30 minutos antes de la prueba.
      NOTA: El investigador puede permanecer en la habitación con las luces encendidas, pero debe permanecer en silencio durante este tiempo.
    2. Limpie el laberinto en Y con una solución desinfectante segura para los animales y limpie toda la solución desinfectante con toallas de papel. Asegúrese de que el laberinto esté seco.
  2. Conduce el laberinto en Y
    1. Etiquete el brazo inicial del laberinto en Y como B y los otros 2 brazos como A y C (Figura 2A). Coloque un roedor en el brazo más cercano al investigador (brazo B) cerca del centro del laberinto en Y. Una vez que se haya colocado el roedor, inicie el temporizador (detalles sobre el laberinto y el temporizador en la Tabla de materiales).
      1. Permita que cada roedor explore el laberinto en Y durante 8 minutos. Tome grabaciones durante este tiempo y anote cualquier observación. Siéntese a varios pies de distancia del laberinto mientras lo mantiene a la vista y evite hacer ruido.
      2. Registre la ubicación inicial como A, y cada vez que el roedor haga una entrada en un nuevo brazo, registre la nueva ubicación del roedor (Figura 2B). Defina una entrada como las cuatro extremidades del roedor que están en uno de los brazos.
      3. Esté atento a que los roedores se escondan y permanezcan estacionarios en un brazo del laberinto. Si el roedor permanece en el mismo lugar durante más de 60 s y no parece mostrar un comportamiento exploratorio, mueva al roedor hacia el centro del laberinto en Y y continúe la prueba.
    2. Después de cada roedor, retire las heces y limpie el laberinto con una solución desinfectante.
      1. Asegúrese de que toda la solución desinfectante se limpie con toallas de papel y que el laberinto esté completamente seco antes de colocar al siguiente roedor en el laberinto.
  3. Calcular la alternancia espontánea y el comportamiento exploratorio
    1. Calcular el comportamiento exploratorio como el número total de entradas realizadas durante 8 min.
    2. Calcular la cognición espacial medida por alternancia espontánea:
      el número de alternancias exitosas/(el número total de entradas - 2)
      1. Defina una alternancia exitosa a medida que el roedor se mueve en tres ubicaciones diferentes secuencialmente (Ejemplo: ABC, CAB, BCA, etc.). Anote cada alternancia exitosa (Figura 2B).
      2. Si los movimientos se registraron como ACABCABABCABC, no tenga en cuenta las dos ubicaciones iniciales de partida al calcular la alternancia espontánea (de modo que haya 11 movimientos en el denominador). Cuente el número de movimientos precisos (movimientos precisos = 8). Calcule el porcentaje de precisión como: 8/(13 - 2) = 72.7%.

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Representative Results

El OMR se considera exitoso si se pueden obtener umbrales de sensibilidad de frecuencia espacial y contraste de un roedor. Aquí, el uso del OMR para evaluar la frecuencia espacial se ilustra en ratas Brown-Norway y Long-Evans de control ingenuo, tanto jóvenes (3-6 meses) como envejecidas (9-12 meses). Las ratas brown-noruegas suelen mostrar una frecuencia espacial basal más alta que las ratas Long-Evans. Además, se observó un efecto de envejecimiento sobre la frecuencia espacial en las ratas Long-Evans (Figura 3A). Los datos se analizaron mediante un ANOVA unidireccional seguido de comparaciones post-hoc de Holms-Sidak, ya que los resultados de jóvenes y ancianos provenían de diferentes cohortes.

El uso de la OMR para evaluar la sensibilidad al contraste se ilustra en el modelo STZ de diabetes tipo I que recibió tratamiento de intervención con ejercicios. Las ratas Long-Evans fueron asignadas a uno de los cuatro grupos: control, control + activo, diabético y diabético + activo. Las ratas diabéticas recibieron inyecciones intravenosas de la toxina STZ para dañar las células beta pancreáticas e inducir hiperglucemia. Las ratas activas recibieron 30 minutos de ejercicio en cinta, 5 días a la semana. Las ratas inactivas tenían una cinta de correr cerrada. Se observaron déficits significativos en la sensibilidad al contraste (Figura 3B) en ratas diabéticas. El tratamiento con ejercicios redujo estos déficits (Figura 3B). Estos resultados demuestran que la OMR es útil tanto para detectar y rastrear los déficits retinianos a lo largo del tiempo como para evaluar los efectos de los tratamientos e intervenciones sobre la enfermedad retiniana22. Los datos se analizaron mediante una ANOVA de medidas repetidas bidireccionales seguida de comparaciones post-hoc de Holms-Sidak. Tenga en cuenta que los resultados pueden presentarse como datos normalizados para controlar (Figura 3B) o como valores brutos (Figura 3A; para frecuencia espacial: en ciclos/grado o c/d; para sensibilidad al contraste: unidades arbitrarias o u.a.). Por lo general, se necesitan de 6 a 10 animales, dependiendo de la gravedad de la lesión, para encontrar una diferencia significativa con el OMR.

El laberinto en Y se considera exitoso si el roedor ingresa al menos 5 brazos del laberinto en 8 minutos. Aquí, la capacidad del laberinto en Y para evaluar la función cognitiva y el comportamiento exploratorio se ilustra en la rata Goto-Kakizaki, un modelo poligénico y no obeso de diabetes tipo II que desarrolla hiperglucemia moderada a partir de las 2-3 semanas de edad y no requiere suplementos de insulina. Se observaron déficits significativos en la cognición espacial, medida por alternancia espontánea (Figura 4A), y el comportamiento exploratorio, medido por el número de entradas (Figura 4B), en ratas Goto-Kakizaki en comparación con los controles Wistar a partir de las 7 semanas de edad. Las ratas de control parecen mostrar una disminución en el comportamiento exploratorio de 4 a 8 semanas. Esta tendencia también se observa en estudios a largo plazo (más de 8 meses de edad). La disminución del movimiento podría deberse a la falta de novedad con la exposición repetida al laberinto o a una disminución general del movimiento con la edad. Las ratas de control parecen mostrar un aumento en la cognición espacial de 4 a 8 semanas. Esta tendencia no se observa en estudios a largo plazo en los que los animales se ejecutan mensualmente en lugar de semanalmente (de hecho, a menudo se observa una disminución con el envejecimiento), y por lo tanto, este aumento en la cognición espacial puede deberse a un efecto de aprendizaje de correr el laberinto una vez a la semana. Los datos se analizaron mediante una ANOVA de medidas repetidas bidireccionales seguida de comparaciones post-hoc de Holms-Sidak. Por lo general, se necesita un mínimo de 10 animales, dependiendo de la gravedad de la lesión, para encontrar una diferencia significativa con el laberinto en Y.

Este protocolo generó datos de función visual y función cognitiva en modelos de diabetes tipo I y tipo II. Las puntuaciones de los animales individuales se promediaron juntas y se utilizaron para detectar diferencias significativas entre los grupos de tratamiento al principio de la progresión de la diabetes. La realización de evaluaciones tanto retinianas como cognitivas a lo largo del tiempo en modelos de enfermedades sistémicas como la diabetes permite monitorizar la aparición temporal de déficits a lo largo del tiempo. Por ejemplo, en el modelo de Goto-Kakizaki, se demostró que los déficits de función retiniana preceden a los déficits cognitivos y exploratorios de comportamiento23 (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Configuración del equipo OMR. (A) Imagen de plataformas de ratón, rata y ratas grandes o deterioradas. (B) Imagen de la pantalla de la computadora durante la prueba. (C) Panel de botones durante la prueba. (D) Esquema de rata en plataforma en cámara. (E) Gradientes de ejemplo que muestran el aumento de la frecuencia espacial y la sensibilidad al contraste. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuración del equipo del laberinto en Y. (A) Imagen del laberinto en Y con los brazos etiquetados. (B) Imagen de un cuaderno de laboratorio con ejemplo de la grabación del laberinto en Y. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Uso del OMR para realizar un seguimiento de la función visual. (A) Umbrales de frecuencia espacial para ratas jóvenes (n = 11) y envejecidas (n = 15) marrón-noruegas (BN) y jóvenes (n = 20) y envejecidas (n = 13) Long-Evans (LE). Esta figura presenta datos de Brown-Norway de Feola et al., 201921. (B) Uso del OMR para rastrear la función retiniana reducida a lo largo del tiempo y los efectos protectores del ejercicio en un modelo de rata STZ de diabetes tipo I. Umbrales de sensibilidad al contraste para ratas diabéticas inactivas frente a ratas diabéticas activas y ratas de control. Los asteriscos gris oscuro representan diferencias entre ambos grupos de control y ambos grupos diabéticos. Los asteriscos naranjas representan diferencias entre las ratas diabéticas inactivas y las ratas diabéticas activas. Esta figura presenta datos de un subconjunto de ratas de Allen et al., 201822. Promedio ± SEM. ** p < 0.01, *** p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Uso del laberinto en Y para rastrear la función cognitiva y el comportamiento exploratorio a lo largo del tiempo en el modelo Goto-Kakizaki de diabetes tipo II en comparación con los controles de Wistar. (A) Función cognitiva (alternancia espontánea) para ratas Goto-Kakizaki (diabéticas) y Wistar (control) de 4 a 8 semanas de edad. (B) Comportamiento exploratorio (número de entradas) de 4 a 8 semanas de edad. Promedio ± SEM. ** p < 0.01, *** p < 0.001. Los asteriscos representan las diferencias entre las ratas Goto-Kakizaki y Wistar en cada punto de tiempo. Solo una cohorte de ratas se ejecutó de 4 semanas a 8 semanas (GK: n = 7; Wistar: n = 10). Todas las demás cohortes se ejecutaron de 5 semanas a 8 semanas (GK: n = 22; Wistar: n = 23) para un total de n de 29 (GK) y 33 (Wistar) en las semanas 5 a 8. Esta cifra ha sido modificada a partir de Allen et al., 201923. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cronología de los cambios funcionales en el modelo goto-kakizaki de la diabetes tipo II. Tras la aparición de hiperglucemia, los primeros cambios observados en la rata Goto-Kakizaki fueron en la función retiniana, medida por electrorretinograma (ERG), apareciendo a las 4 semanas de edad. Los cambios cognitivos y exploratorios de comportamiento aparecieron después de las 6 semanas de edad. Esta cifra ha sido modificada a partir de Allen et al., 201923. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El OMR y el laberinto en Y permiten la evaluación no invasiva de la función visual y los déficits de la función cognitiva en roedores a lo largo del tiempo. En este protocolo, se demostró que el OMR y el laberinto en Y rastrean los déficits visuales y cognitivos en modelos de roedores de diabetes.

Pasos críticos en el protocolo

La OMR

Algunos puntos importantes a considerar al realizar el OMR para evaluar la función visual son los parámetros de prueba utilizados, el diseño experimental y el momento de las pruebas, y la experiencia del investigador que realiza las mediciones. Uno de los pasos más críticos en el protocolo es asegurarse de que los parámetros estén configurados correctamente. Además, como parte de la configuración, la cámara OMR debe limpiarse con una solución desinfectante u otro desinfectante aprobado antes y después de cada roedor. También es importante que el investigador que realiza las medidas haya sido capacitado y tenga experiencia en la realización de las medidas. Los mejores resultados se ven cuando los roedores están tranquilos y aclimatados a la habitación dejándolos en sus jaulas durante 30 minutos antes de comenzar el experimento. También es importante determinar la frecuencia espacial basal y la sensibilidad al contraste cuando se comienza a trabajar con una nueva cepa y tener en cuenta que no todas las cepas exhibirán los mismos niveles de referencia. Las ratas brown-noruegas tienen una mayor frecuencia espacial basal que las ratas Long-Evans. Mientras tanto, algunas cepas de ratas albinas parecen haber comprometido la frecuencia espacial24, mientras que otras cepas de ratas albinas no exhiben ningún comportamiento de seguimiento. Muchos factores pueden contribuir a la respuesta limitada de los animales albinos en el OMR: binocularidad alterada debido a la decusación diferencial de las fibras del nervio óptico, falta de melanina en la parte posterior del ojo y una gran proporción de conos de opsina dual. En cualquier caso, las ratas albinas pueden no ser sujetos apropiados para las pruebas OMR, ya que su rendimiento podría estar demasiado cerca del límite de detección.

El laberinto en Y

Un componente crítico de la realización del laberinto en Y implica minimizar las perturbaciones durante el período de grabación. La colocación inicial del roedor en el laberinto solo debe hacerse después de permitir que el roedor se aclimate a la habitación durante 30 minutos. Esto permite que el roedor se adapte al nuevo entorno y evita que cualquier factor de confusión afecte el comportamiento normal del roedor. Minimizar las perturbaciones durante cada ensayo es muy importante. Esto incluye evitar ruidos fuertes y asegurarse de que el investigador esté fuera de la vista del roedor. Estas distracciones pueden causar estrés al roedor. También es importante tener en cuenta que las paredes de la habitación deben permanecer lo más desnudas posible con un color neutro. Cualquier color brillante en las paredes o carteles puede distraer al roedor y puede afectar su patrón de comportamiento exploratorio.

Limitaciones del método y modificaciones y solución de problemas del método

La OMR

Una limitación potencial del OMR es que puede verse afectado por el sesgo del experimentador, y diferentes experimentadores pueden tener resultados ligeramente diferentes, ya que la puntuación OMR es subjetiva. Puede ser fácil pasar por alto un movimiento de la cabeza que es demasiado sutil o clasificar el comportamiento exploratorio como un movimiento de la cabeza. Debido a que el sesgo puede afectar los resultados de OMR, es mejor si el experimentador está enmascarado para el grupo de tratamiento y el diseño del estudio cuando sea posible. El desarrollo de un OMR automático o la comparación de los resultados de dos probadores también podría ayudar a disminuir el sesgo del experimentador.

Un problema común que puede ocurrir durante las pruebas OMR es cuando el roedor salta repetidamente de la plataforma, lo que dificulta la obtención de un umbral visual. Si esto sucede, tome nota de ello y coloque suavemente la rata de nuevo en la plataforma; también puede ser necesario medir la rata nuevamente al día siguiente. Además, las ratas que nunca se han medido antes pueden participar en comportamientos exploratorios cuando se colocan en el OMR. Si esto es un problema, tener una medida de referencia adicional una semana más o menos después de la primera medición puede ayudar a mejorar la precisión. Las pruebas con cantidades excesivas de estos comportamientos deben descartarse.

Otros factores como la edad o las señales olfativas también podrían contribuir a la actividad no deseada. Por lo tanto, es importante diseñar experimentos de acuerdo con la línea de tiempo del desarrollo del sistema visual en ratas y limpiar a fondo la plataforma y la cámara antes y después de probar cada roedor. También se debe considerar la hora del día en que se realizan las mediciones de OMR, ya que estudios previos han demostrado que existen ritmos circadianos en frecuencia espacial25. Correr a las ratas antes del mediodía parece ser lo mejor para su enfoque (el laboratorio de Rachael Allen, observaciones personales). Si las ratas se distraen demasiado, puede ayudar tocar suavemente el exterior del OMR.

La velocidad con la que se realiza la prueba también puede afectar los resultados. Las medidas pueden volverse menos precisas después de 30 minutos más o menos si los roedores pierden interés en el estímulo. Por lo tanto, se pueden obtener resultados más precisos cuando las mediciones se toman en aproximadamente ≤20 min. La duración de una sola prueba (para SF o CS) es de 5 a 10 minutos para un experto y de 30 minutos para un principiante. Si un roedor muestra poco movimiento, pasa la mayor parte de su tiempo acicalándose o no mira en la dirección de las barras, puede estar fatigado. El roedor puede volver a correr en un día diferente. Además, las pruebas de SF y CS se pueden realizar en días diferentes, particularmente para los probadores más nuevos que pueden ser más lentos. La frecuencia con la que se realiza la prueba también puede afectar los resultados: realizarla semanalmente o cada dos semanas ayuda a los animales a aclimatarse a la prueba, pero realizarla todos los días o cada dos días puede causar hiperagudeza26. No realizamos más de una prueba por día, aunque a menudo ejecutamos SF y CS el mismo día o incluso en la misma sesión. El tiempo diario acumulado para ejecutar una cohorte de ratas (n = 10) es de 2 h para un experto.

El OMR mide cada ojo de forma independiente, lo que resulta en puntuaciones visuales separadas para cada ojo. En los modelos de glaucoma de Morrison y microperlas y en un modelo de aplastamiento del nervio óptico, nuestro laboratorio no ha observado ningún impacto del ojo dañado en el ojo no dañado27. En un modelo de blast, con el blast dirigido a un ojo, el ojo contralateral sí mostró daño, pero esto también podría deberse a un efecto de blasteo parcial28. En las ratas de control, no debe haber diferencias en los resultados entre las direcciones en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj, pero algunos roedores podrían tener un sesgo; por lo tanto, sería mejor alternar las direcciones29, si el sistema OMR no se alterna automáticamente.

Dependiendo del modelo de la enfermedad, las diferencias del grupo de tratamiento en la función visual pueden variar en función de los parámetros utilizados. Por ejemplo, al probar la sensibilidad al contraste, si la frecuencia espacial se establece en un nivel que está por encima del umbral de frecuencia espacial normal y es difícil de resolver, las diferencias en la sensibilidad al contraste entre los grupos serán pequeñas. Sin embargo, si la frecuencia espacial se establece en un nivel que normalmente es fácil de ver para las ratas, las diferencias en la sensibilidad al contraste entre los grupos serán mayores30. Por lo tanto, es importante considerar el diseño del estudio y los umbrales de frecuencia espacial normal de los roedores al establecer los parámetros para realizar el OMR.

El laberinto en Y

Si un animal está asustado, puede congelarse en una esquina del laberinto. Además, si ocurre un ruido fuerte fuera de la habitación, un animal puede asustarse y no moverse en el laberinto. Para tener en cuenta estos problemas, los investigadores pueden aclimatar a las ratas a la habitación primero, mover a un animal congelado a un punto de elección, correr a un animal nuevamente en un día diferente o ejecutar a los animales en luz roja, lo que se cree que los hace menos nerviosos, ya que normalmente están activos en la oscuridad (Laboratorio de Rachael Allen: comunicación personal). También se recomienda ejecutar el laberinto en Y a la misma hora todos los días para tener en cuenta los cambios en los niveles de actividad a lo largo del día debido a los ritmos circadianos. Por lo general, corremos las ratas antes del mediodía (laboratorio de Rachael Allen, observaciones personales). La duración de una sola prueba es de 8 min (10 min, con limpieza). Nunca realizamos más de una prueba por día. Si se necesita un ensayo adicional, el ensayo se realiza en otro día. El tiempo diario acumulado para ejecutar una cohorte de ratas (n = 10) es de 2 a 3 h. Se observaron disminuciones relacionadas con la edad en la alternancia espacial en ratas a los 9-12 meses de edad y en el comportamiento exploratorio a los 12 meses de edad28.

Si bien tanto el comportamiento exploratorio como la cognición espacial disminuyen en roedores diabéticos, los dos no parecen estar estrechamente correlacionados y, por lo tanto, no evaluamos de forma independiente la actividad locomotora antes de la prueba del laberinto en Y.

La importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos

La OMR

Otros métodos de prueba de función visual, como el seguimiento optocinético, se basan en fijar la cabeza del animal en su lugar y rastrear los movimientos oculares. Las pruebas de respuesta optomotora sin restricciones (OMR) permiten la medición longitudinal, no invasiva y confiable de la función visual en roedores. En este protocolo, se describió cómo se puede utilizar el OMR para cuantificar tanto la frecuencia espacial como los umbrales de sensibilidad al contraste para cada ojo. Este método puede ser muy útil para detectar la disfunción neuronal en etapa temprana en enfermedades como la diabetes. Otras pruebas, como la tarea visual del agua, también se pueden usar para medir la frecuencia espacial31, pero como esto implica entrenar a los roedores para nadar hacia un gradiente en un laberinto en Y modificado, la tarea lleva mucho tiempo e implica mucho entrenamiento. Además, el OMR mide los valores de cada ojo de forma independiente, lo que es útil en modelos donde la lesión se dirige a un ojo y el otro ojo sirve como control contralateral (por ejemplo, muchos modelos de glaucoma). Además, OMR es una evaluación sensible, capaz de detectar cambios tan pronto como 3-4 semanas después de la diabetes, que es más temprano que otras evaluaciones visuales. Los ensayos electrofisiológicos son una alternativa a las pruebas visuales conductuales. La electrorretinografía (ERG) está más disponible que la OMR y puede determinar déficits en tipos de células precisas utilizando diferentes componentes de la onda ERG32 (las ondas a representan la función de la célula fotorreceptora, las ondas b representan la función de la célula bipolar). Mientras tanto, el OMR se puede utilizar para determinar un déficit en la función visual, sin revelar el punto preciso de ruptura a lo largo de la vía. Sin embargo, el OMR es una medida más sensible de la RD que el ERG, con los déficits de OMR típicamente observados entre 2-4 semanas después de la hiperglucemia y los déficits de ERG típicamente observados de 4 a 8 semanas después de la hiperglucemia en roedores. Las cataratas diabéticas graves pueden afectar la OMR. Sin embargo, las cataratas diabéticas en roedores aparecen y/o empeoran bajo anestesia, y así, pruebas como el ERG y la tomografía de coherencia óptica que requieren anestesia se ven afectadas con mucha más frecuencia que la OMR, que se realiza en animales despiertos.

El laberinto en Y

El laberinto en Y se basa en la cognición espacial como el laberinto de agua de Morris, pero no utiliza un fuerte estímulo negativo (es decir, agua) para motivar al animal a realizar la tarea. Por lo tanto, el laberinto en Y es menos estresante para los animales y también es más fácil de realizar. Sin embargo, es posible que el laberinto en Y no sea tan sensible como el laberinto de agua de Morris o el laberinto de Barnes. A diferencia del laberinto de agua de Morris, el laberinto en Y es un comportamiento automático y no requiere entrenamiento. Por lo tanto, la carga de tiempo involucrada en la realización del laberinto en Y es mucho menor.

Conclusiones y futuras aplicaciones o direcciones del método

La OMR

El OMR es útil para tomar medidas de la función visual en roedores mediante el seguimiento de los movimientos de la cabeza. Es un método efectivo, pero hay actualizaciones y adiciones que se hacen continuamente para mejorar el protocolo. Algunos métodos novedosos utilizan el roedor que detiene su cabeza como un indicador OMR negativo combinado con el seguimiento de la cabeza como un indicador positivo33. Esto permite mediciones más rápidas y precisas de la función visual34. Otra forma en que se ha modificado este proceso es desarrollar un sistema que rastreará automáticamente la cabeza sin marcadores artificiales para reducir las inconsistencias que podrían resultar de los probadores humanos35. A partir de 2016, un sistema OMR automatizado o cuantitativo llamado qOMR ha sido bien desarrollado y está disponible comercialmente. En el protocolo anterior, el OMR fue capaz de detectar déficits en frecuencia espacial y sensibilidad al contraste en ratas diabéticas, así como protección contra déficits con un tratamiento (ejercicio).

El laberinto en Y

El laberinto en Y revela información sobre el comportamiento exploratorio y la cognición espacial y se utilizó aquí para detectar déficits de comportamiento en roedores diabéticos a las 7 semanas. Existen otras pruebas para observar la función cognitiva (es decir, el laberinto de agua de Morris, el laberinto de Barnes, el reconocimiento de objetos novedosos), y es posible que estas pruebas puedan revelar el deterioro cognitivo antes o proporcionar información sobre diferentes aspectos de la cognición. Las direcciones futuras para el laberinto en Y incluyen colocar un nuevo objeto o estímulo alimentario en uno de los brazos y observar el patrón exploratorio del roedor36. Una variación de esto implica bloquear uno de los brazos del laberinto en Y, permitir que el roedor explore los dos brazos restantes, y luego reabrir el acceso al tercer brazo y evaluar cuánto tiempo pasa el roedor en el tercer brazo novedoso. Otra mejora valiosa que se podría hacer con respecto al laberinto en Y es desarrollar el seguimiento automático de los roedores para registrar sus movimientos. Esto eliminaría la necesidad de registrar manualmente los movimientos de los roedores y haría que los cálculos de las alternancias espontáneas fueran más precisos y eficientes.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Asuntos de Veteranos Rehabilitación I + D Servicio de Desarrollo profesional Premios (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) a RSA y (CDA-2, RX002342) a AJF y los Institutos Nacionales de Salud (NIH-NICHD F31 HD097918 a DACT y NIH-NIEHS T32 ES012870 a DACT) y NEI Core Grant P30EY006360.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OptoMotry HD CerebralMechanics Inc. OMR apparatus & software
Timer Thomas Scientific 810029AR
Y-Maze apparatus San Diego Instruments 7001-043 Available specifically for rats

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Comportamiento Número 164 retinopatía diabética retina laberinto en Y respuesta optomotora comportamiento exploratorio frecuencia espacial sensibilidad al contraste memoria espacial alternancia espontánea

Erratum

Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.

The author list was updated from:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

to:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

Evaluación conductual de la función visual a través de la respuesta optomotora y la función cognitiva a través de Y-Maze en ratas diabéticas
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Gudapati, K., Singh, A., Clarkson-Townsend, D., Phillips, S. Q., Douglass, A., Feola, A. J., Allen, R. S. Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. J. Vis. Exp. (164), e61806, doi:10.3791/61806 (2020).

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