Summary
En alsidig mikrofluidisk enhed beskrives, der muliggør krystallisering af et enzym ved hjælp af modspredningsmetoden, indførelsen af et substrat i krystallerne ved iblødsætning og 3D-strukturbestemmelsen af enzymet:substratkomplekset ved en seriel analyse af krystaller inde i chippen ved stuetemperatur.
Abstract
Forberedelsen af godt spredende krystaller og deres håndtering før deres røntgenanalyse er to kritiske trin i biokrystallografiske undersøgelser. Vi beskriver en alsidig mikrofluidisk chip, der muliggør produktion af krystaller ved hjælp af den effektive metode til modspredning. Det konvektionsfrie miljø, der leveres af de mikrofluidiske kanaler, er ideelt til krystalvækst og nyttigt til at sprede et substrat i det krystallinske enzyms aktive sted. Her anvendte vi denne tilgang til det CCA-tilsatte enzym i den psykiske bakterie Planococcus halocryophilus i det præsenterede eksempel. Efter krystallisering og substratdiffusion/iblødsætning blev krystalstrukturen i enzymet:substratkomplekset bestemt ved stuetemperatur ved seriel krystallografi og analyse af flere krystaller direkte inde i chippen. Hele proceduren bevarer prøvernes ægte diffraktionsegenskaber, fordi det ikke kræver krystalhåndtering.
Introduction
Krystallografi er en metode til at dechifrere 3D-arkitekturen i biologiske makromolekyler. Sidstnævnte er vigtigt at forstå, hvordan et enzym vælger og behandler dets substrater. Bestemmelsen af en krystalstruktur kræver krystallisering af målmakromolekylet og konditionering af krystallerne til deres analyse ved røntgendiffraktion1. Både krystalforberedelse og håndtering er afgørende, men delikate trin, der kan påvirke krystalkvaliteten og diffraktionsegenskaberne, og dermed opløsningen (dvs. nøjagtigheden) af den resulterende 3D-struktur. For at lette forberedelsen af krystaller af høj kvalitet og eliminere unødvendig håndtering for at bevare deres diffraktionsegenskaber designede vi en brugervenlig og alsidig mikrofluidisk enhedkaldetChipX 2,3,4.
I denne artikel vil vi demonstrere, hvordan vi indlæser proteinopløsningen i ChipX-kanaler ved hjælp af konventionelt laboratoriemateriale til at forberede krystaller ved moddiffusion. Denne krystalliseringsmetode giver en effektiv screening af overmætning og potentielle nukleationsforhold langs de mikrofluidiske kanaler, der indeholder enzymopløsningen på grund af koncentrationsgradienten genereret ved diffusionen af krystalliseringsmidlet5,6.
Chipopsætningen er enkel, den bruger kun standardlaboratoriepipetter og kræver ikke noget dyrt udstyr. Når krystaller er vokset i ChipX, ligands af enzymet kan indføres ved diffusion. Diffraktionsdata indsamles derefter ved stuetemperatur på en række krystaller indeholdt i chippens kanaler ved hjælp af en synkrotron røntgenkilde. Den strukturundersøgelse, der er beskrevet her, førte til bestemmelse af strukturer af et tRNA-modningsenzym i dets apoform og i kompleks med en analog af dets CTP-substrat indført ved iblødsætning. Dette protein kaldet CCA-tilsættende enzym polymeriserer CCA trinucleotidhale i 3 ' slutningen af tRNA'er. Sammenligningen af de to 3D-billeder opnået ved seriel krystallografi afslører de lokale konformationsmæssige ændringer relateret til bindingen af liganden under forhold, der er mere fysiologiske end dem, der anvendes i kryo-krystallografi. Den protokol, der er beskrevet i denne video, gælder generelt for ethvert biomolekyle, det være sig et protein, en nukleinsyre eller et multikomponentkompleks.
Protocol
1. Opsætning af krystalliseringsanalyser i ChipX
BEMÆRK: ChipX mikrofluidic enheden kan fås ved henvendelse til forfatterne. En beskrivelse af chippen findes i figur 1. Opløsninger, der indeholder det krystallinske (eller krystalliserende middel), der anvendes til at udløse krystallisering, kan være af kommerciel oprindelse eller fremstillet af forsøgsviseren.
- Indlæsning af biomolekyleprøven
BEMÆRK: Prøvevolumenet, der faktisk kræves for at udføre en individuel moddiffusionsanalyse i den lige del af hver kanal af ChipX, er 300 nL. Men for nemheds skyld foreslår vi at indlæse 5 μL for helt at fylde de otte kanaler under hensyntagen til den variable længde af deres buede sektion og indløb døde mængder.- Rør 5 μL enzymopløsninger ved hjælp af standard 10 μL pipet og spids.
- Spidsen hældes lodret i prøveindløbet, og opløsningen injiceres, indtil de otte kanaler er fyldt op til den modsatte ende (indgangen til det krystallinske reservoir).
- Der injiceres 1 μL paraffinolie i prøveindløbet for at koble kanalerne fra hinanden.
- Den ekstra opløsning genvindes i det krystallinske reservoir i ekstremiteten af hver kanal ved hjælp af en standardpipet på 10 μL.
- Prøveindløbet forsegles med et tape på 1 cm x 1 cm.
- Indlæsning af krystalliseringsløsningerne
- Rør 5 μL krystalliseringsopløsning ved hjælp af standard 10 μL pipet og spids. Reservoirvolumenet er 10 μL, men kun at laste halvdelen af det undgår overløb ved forsegling med tape og letter yderligere tilsætning af ligand til blødgøringsforsøg. Hvis de indledende krystalliseringsbetingelser blev opnået ved dampspredning, skal du øge krystallantkoncentrationen med en faktor på 1,5 - 2. Opløsninger kan være forskellige i hvert reservoir (i det præsenterede tilfælde blev der anvendt 1 M diammonium hydrogenphosphat, 100 mM natriumacetat, pH 4,5 blev brugt overalt).
- Orientere rørspidsen mod kanalens indtrængen i den tragtformede del af reservoiret for at undgå dannelse af en luftboble ved aflejring af opløsningen. Det ville forhindre kontakten mellem de to opløsninger og krystallant diffusion i kanalen.
- Indsprøjt den krystallinske opløsning i beholderen.
- Forsegl reservoirerne med et 2,5 cm x 1 cm stykke tape.
- Spånen inkuberes ved 20 °C (temperaturen kan justeres afhængigt af målet, typisk mellem 4 og 37 °C 4).
2. Proteinmærkning med carboxylrhodamin til fluorescensdetektion
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Den skal udføres inden prøvebelastningen for at lette påvisningen af krystaller i chippen ved hjælp af fluorescens. Den detaljerede metode til sporing af fluorescerende mærkning blev beskrevet af Pusey og kolleger7. Alle trin udføres ved stuetemperatur.
- 5 mg carboxyrhodaminesterpulver opløses i 1 mL vandfri dimethylformamid, opløsningen opdeles i 0,6 μL aliquots, som skal opbevares ved -20 °C.
- Forbered en 1 M Na-borate pH 8,75 lageropløsning.
- Fortynd bestanden for at forberede reaktionsbufferen ved 0,05 M Na-borate pH 8,75.
- Der skylles en afsaltningskolonne (7 kDa MWCO, 0,5 mL) med 800 μL reaktionsbuffer.
- Centrifuge kolonnen i 1 min ved 1400 x g, fjern filtrat.
- Gentag denne handling to gange (trin 2.4-2.5) for at vaske kolonnen.
- Der deponeres 80 μL protein i opbevaringsbufferen på kolonnen (proteinet kan fortyndes ned til 1 mg/mL for at øge volumenet, hvis det er nødvendigt).
- Centrifuge kolonnen i 1 min ved 1400 x g. Dette trin er beregnet til at overføre proteinet fra dets opbevaringsbuffer til reaktionsbufferen.
- Gennemstrømningen genvindes (proteinet i reaktionsbufferen) og blandes med 0,6 μL carboxylrhodaminopløsning.
- Inkuber 5 minutter ved stuetemperatur.
- I mellemtiden skylles kolonnen 3 x med opbevaringsbufferen, centrifuge kolonnen i 1 min ved 1400 x g og kassere filtrat.
- Indlejr reaktionsopløsningen på kolonnen.
- Kolonnen centrifuges i 1 min. ved 1400 x g, og gennemstrømningen genvindes (dvs. opløsning af mærket protein i opbevaringsbufferen).
- Suppler stamproteinopløsningen med 0,1-1 % (w/w) mærket protein.
- Opsæt ChipX-krystalliseringsanalyserne som beskrevet i afsnit 1.
- Kontroller for tilstedeværelsen af proteinkrystaller i assays ved spændende fluorescerende sonde med en 520 nm bølgelængde lyskilde.
3. Krystalobservation
BEMÆRK: ChipX-enheden kan håndteres uden særlig omhu, selv med krystaller indeni, undtagen hvis temperaturen skal styres.
- Brug ethvert stereomikroskop til at kontrollere resultatet af krystalliseringsanalyser i ChipX. Dens fodaftryk har standarddimensionerne af mikroskopdias og er kompatibel med ethvert system og diasholder.
- Kontroller indholdet af mikrofluidiske kanaler med udgangspunkt i reservoiret, hvor krystallantkoncentrationen er den højeste til prøveindløbet, hvor krystallantkoncentrationen er den laveste. ChipX-materialet er gennemsigtigt for synligt lys, kompatibelt med brugen af polarisatorer, samt med UV-belysning til identifikation af proteinkrystal ved iboende tryptophane fluorescens8.
- Optag krystalpositioner ved hjælp af etiketterne, der er præget langs kanalerne, eller marker krystalplaceringer med en permanent markør ved at tegne farve prikker ved siden af dem på spånoverfladen.
4. Krystalblødning med ligands
BEMÆRK: Denne procedure er valgfri. Det bruges til at introducere ligands, enzym substrater eller tunge atomer i krystallerne og bør udføres mindst 24-48 timer før røntgenanalyse for at tillade den sammensatte diffusion langs kanalerne og ind i krystallerne.
- Fjern forsigtigt forseglingstapen fra reservoirerne.
- Der tilsættes op til 5 μL ligandopløsning i et eller flere reservoirer ved hjælp af en mikropipet på 10 μL (i eksemplet blev der tilsat 3 μL 10 mM cytidin-5'-[(α,β)-methyleno] triphosphatopløsning (CMPcPP) for at opnå en endelig koncentration på 3,75 mM). CMPcPP er en ikke-hydrolizable analog af CTP, et naturligt substrat af enzymet.
- Forsegl reservoirerne med et 2,5 cm x 1 cm stykke tape.
- Inkubat chippen under kontrolleret temperatur i 24-48 timer for at tillade ligand diffusion langs chippens kanaler.
5. Krystalanalyse efter seriel krystallografi
BEMÆRK: Denne del af protokollen skal tilpasses afhængigt af bjælkelinjeopsætningen og krystallernes diffraktionsegenskaber. Der gives kun generelle indikationer for den krystallografiske analyse baseret på forsøg udført på X06DA beamline (SLS, Villigen, Schweiz).
- ChipX montering på beamline goniometer
BEMÆRK: Filen til 3D-udskrivning af ChipX-holderen findes i ref4.- Sluk for strålelinjens kryostråle. Analysen her udføres ved stuetemperatur.
- Monter ChipX på en dedikeret holder med den kanal, der indeholder de krystaller, der skal analyseres placeret i midten af holderen. ChipX holderen4 kræver ingen skrue eller yderligere del, da den er designet til at give en perfekt pasform til ChipX.
- Fastgør holderen til goniometeret.
- Dataindsamling
- Orientere det tykkeste lag (øverste lag, Figur 1) af ChipX (i denne retning etiketter langs kanalerne er direkte læsbar ved hjælp af centrering kameraet af strålelinjen), mod den direkte stråle og den tyndeste ansigt bag krystal for at minimere diffracted signal som beskrevet i ref3.
- For at undgå kollision af ChipX med det omgivende materiale (beamstop, collimator), skal du begrænse goniometerbevægelser i området ±30° (0° svarende til de kanaler, der er vinkelret på røntgenstrålen).
- Find krystaller position ved hjælp af etiketter præget langs kanalerne.
- Vælg en krystalposition.
- Centrer krystallen enten ved standard lavdosis gitter / raster screening eller 1-klik procedure (videoen viser et eksempel på gitter screening).
- Indsaml diffraktionsdata inden for området -30° / +30°.
- Genstart proceduren ved trin 5.2.4-5.2.6 på en anden krystal i samme kanal efter oversættelse af chippen.
- Juster manuelt en anden ChipX-kanal i midten af holderen, og fortsæt dataindsamlingen på krystaller, der findes i denne kanal.
- Brug standard krystallografiske pakker og procedurer til at behandle og flette dataene, og derefter til at løse og forfine strukturen.
Representative Results
Den mikrofluidiske chip, der er beskrevet her, er designet til at muliggøre nem opsætning af krystalliseringsanalyser og krystalanalyse ved stuetemperatur. Den ovenfor beskrevne procedure og i videoen blev anvendt i rammen af den strukturelle karakterisering af det CCA-tilsatte enzym fra den koldtilpassede bakterie Planococcus halocryophilus. Dette enzym tilhører en essentiel polymerasefamilie, der katalyserer den sekventielle tilsætning af 3' CCA-sekvensen på tRNA'er ved hjælp af CTP og ATP9,10.
Chippen blev først brugt til at forberede krystaller af enzymet til strukturel analyse ved hjælp af moddiffusionsmetoden. Med henblik herpå blev enzymopløsningen lastet i de otte mikrofluidiske kanaler (krystalliseringskamre) ved en enkelt injektion i chippens prøveindløb (se figur 1). Enzymet blev anvendt ved 5,5 mg/mL i opbevaringsbufferen indeholdende 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl og 5 mM MgCl2. Dette trin blev udført manuelt med en standard mikropipet på 10 μL. Krystalliseringsopløsninger (100 mM natriumacetat pH 4,5,1 M diammonium hydrogenphosphat) blev derefter deponeret i reservoirerne ved kanalernes øvrige ekstremitet.
Indlæsningsproceduren er ligetil og tager ikke længere end fem minutter (figur 2). Den krystallant derefter diffunderer i kanalerne, skaber en gradient af koncentration, der udløser krystal kernedannelse og vækst. Denne gradient udvikler sig dynamisk og udforsker et kontinuum af overmætningstilstande5,6, indtil det når en ligevægt af krystallantkoncentration mellem kanalerne og reservoiret. Krystalliseringsanalyser kontrolleres typisk under micoscopeet over en periode på 2 - 4 uger for at spore væksten af krystaller. Bipyramidale krystaller af CCA-tilsættende enzym dukkede op i kanalerne efter et par dages inkubation ved 20 °C (figur 3). Den valgfrie fluorescerende mærkningaf 7 af proteinet letter i høj grad identifikationen af proteinkrystaller og deres forskelsbehandling af saltkrystaller (figur 4).
Vi udnyttede det diffusive miljø i chipkanaler til at levere et substrat til det enzym, der opbygger krystallerne. I det foreliggende tilfælde blev CMPcPP, en CTP-analog, føjet til reservoiropløsningerne ved en endelig koncentration på 3,75 mM (figur 5). Denne tilføjelse blev udført to dage før den krystallografiske analyse for at gøre det muligt for CMPcPP at nå og besætte enzymets katalytiske sted, som senere bekræftet af krystalstrukturen (se nedenfor).
Vi fremstillede en chipholder (Figur 6) i polylaktisk syre ved hjælp af en 3D-printer. Holderen muliggør chipmontering på goniometre ved hjælp af standard magnetiske hoveder. Derfor kan chippen let placeres og oversættes i røntgenstrålen for at bringe krystallerne i diffraktionsposition. Dataindsamlingsstrategien skal tilpasses afhængigt af stråleegenskaber og krystalegenskaber. For CCA-tilsætningsenzymet blev der indsamlet data ved X06DA- og X10SA-strålelinjer, swiss light source (SLS) med en røntgenbølgelængde på henholdsvis 1,0 Å og Pilatus 2M-F- og 6M pixeldetektorer. Der blev indsamlet 30-60° rotation på hver krystal ved stuetemperatur med billeder af eksponering på 0,1° eller 0,2° og 0,1 s (se tabel 1). Delvise datasæt blev behandlet individuelt og skåret, når opløsningen af diffraktion mønstre begyndte at henfalde på grund af stråling skader (opdaget af faldet i signal-til-støj-forholdet 
og CC1/2, og en stigning på Rmeas i høj opløsning shell). Fuldstændige datasæt blev rekonstitueret ved sammenlægning af data fra 5 krystaller (tabel 1). Krystalstrukturerne blev udledt ved molekylær udskiftning ved hjælp af standardkrystallografiske pakker og procedurer for databehandling11 og raffinement12. Sammenligningen af enzymets strukturer og dets kompleks med CMPcPP afslører den lokale kropsbygningstilpasning, der ledsager substratbinding på det aktive sted for det CCA-tilsættende enzym (Figur 7).
Figur 1: ChipX-design. Chippen består af et øverste lag lavet af COC (tykkelse: 1 mm), hvor otte mikrofluidiske kanaler og reservoirer er præget. Hele chippen er forseglet med et LAG COC (tykkelse: 0,1 mm). Alle kanaler er forbundet til et enkelt indløb på venstre side til samtidig prøveindsprøjtning og til individuelle reservoirer på højre side, hvor krystalliseringsopløsninger deponeres. Kanalerne, som udgør chippens faktiske krystalliseringskamre, er 4 cm lange og har et tværsnit på 80 μm x 80 μm. Etiketter (A1, A2, A3 osv.) præget langs kanalerne letter krystalpositionering under mikroskopet og udarbejdelse af en prøveliste til dataindsamling. ChipX har størrelsen på en standard mikroskop dias (7,5 cm x 2,5 cm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opstilling af krystalliseringsanalyser i ChipX. 1) Aflejring 5-6 μL enzymopløsninger ved hjælp af standard 10 μL pipet og spids. 2) Hæld spidsen lodret i prøveindløbet, og indsprøjt opløsningen i de otte kanaler. 3) Rør 1 μL paraffinolie. 4) Hæld spidsen lodret i prøveindløbet, og indsprøjt olien for at koble kanalerne fra hinanden. 5) Forsegl indløbet med et stykke tape. 6) Rør 5 μL krystalliseringsopløsning ved hjælp af standard 10 μL pipet og spids. Løsninger kan være forskellige i alle reservoirer (f.eks. fra et screeningssæt). 7) Orientere rørspidsen mod indføring af kanalen i den tragtformede del af reservoiret (for at undgå dannelse af en luftboble ved opløsningsaflejring) og injicere den krystallinske opløsning i reservoiret. 8) Luk reservoirerne med et stykke tape og inkuber chippen ved kontrolleret temperatur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Krystaller af CCA-tilsættende enzym dyrket ved moddiffusion i chipx' mikrofluidiske kanaler. Skalalinjen er 0,1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Krystalblødningsprocedure. 1) Tag forsigtigt båndet ud af reservoirerne. 2) Der deponeres op til 5 μL ligandopløsning ved hjælp af en mikropipet på 10 μL. 3) Tilsæt ligand til et eller flere reservoirer. 4) Luk igen reservoirerne med et stykke tape og inkuber chippen under kontrolleret temperatur i 24-48 timer før dataindsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Sporstofrøret diskriminerer protein (til venstre) fra saltkrystaller (højre). Den CCA-tilsatte enzymopløsning indeholdt 0,4 % (w/w) protein mærket med carboxrhodamin. Til højre belyses krystaller med en 520 nm bølgelængdelyskilde, og billedet tages med et lavpasfilter ved 550 nm (LP550); (indsat) struktur af carboxyrhodamine-succinimidylester. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: (Venstre) Tegning af ChipX holderen og (højre) ChipX monteret på goniometeret af beamline X06DA på SLS (Villigen, Schweiz) for seriel krystal analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Sammenligning af CCA-tilsættende enzymaktivt sted i apoformen (i pink) og i komplekset med en CTP-analog (i grøn). Selv om enzymets samlede kropsbygning ikke påvirkes, ledsages bindingen af CMPcPP ligand af en mindre reorganisering af sidekæder på det aktive sted. Den 2Fo-Fc elektron tæthed kort (i blåt) er kontureret på 1,2 sigma. Forskellen elektrontæthed kort kontureret ved 4 sigma (i grøn) bekræfter tilstedeværelsen af ligand i det aktive sted. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Krystalliseret prøve | CCA-tilsættende enzym | CCA-tilsættende enzym + CMPcPP |
| Krystalanalyse | ||
| Røntgenstrålelinje | SLS – X06DA | SLS – X10SA |
| Bølgelængde (Å) | 1.000 | 1.000 |
| Temperatur (K) | 293 | 293 |
| Detektor | Pilatus 2M-F | Pilatus 6M |
| Krystaldetektorafstand (mm) | 300 | 400 |
| Krystaller indsamlet | 6 | 14 |
| Markerede krystaller | 5 | 5 |
| Rotationsområde pr. billede (°) | 0.1 | 0.2 |
| Eksponeringstid pr. billede (r) | 0.1 | 0.1 |
| Nej. af de markerede billeder | 1000 | 540 |
| Samlet rotationsområde (°) | 100 | 108 |
| Områdegruppe | P43212 | P43212 |
| a, c (Å) | 71.5, 293.8 | 71.4, 293.6 |
| Gennemsnitlig mosaik (°) | 0.04 | 0.04 |
| Opløsningsområde (Å) | 46 – 2.54 (2.6 – 2.54) | 48 – 2.3 (2.4 – 2.3) |
| Antal i alt nr. af refleksioner | 176105 (9374) | 232642 (32937) |
| Nej. af unikke refleksioner | 23922 (1598) | 34862 (4066) |
| Fuldstændighed (%) | 90.6 (84.6) | 99.5 (100.0) |
| Redundans | 7.5 (6.0) | 6.7 (8.1) |
|
8.1 (1.3) | 6.9 (0.7) |
| Rmeas (%) § | 18.6 (126.0) | 18.0 (231.2) |
| CC1/2 (%) | 98.7 (55.0) | 98.7 (46.9) |
| Samlet B-faktor fra Wilson-plottet (Å2) | 57.4 | 60.6 |
| Krystallografisk finjustering | ||
| Nej. refleksioner, arbejdssæt/testsæt | 23583 / 1180 | 34840 / 3405 |
| Endelig Rcryst (%) / Rgratis (%) | 18.8 / 21.4 | 20.0 / 22.9 |
| Nej. af ikke-H atomer: samlet / protein / ligand / opløsningsmiddel | 2998 / 2989 / 0 / 9 | 3057 / 2989 / 29 / 10 |
| R.m.s. afvigelser for bindinger (Å) / vinkler (°) | 0.009 / 1.23 | 0.010 / 1.22 |
| Gennemsnitlige B-faktorer (Å2):samlet / protein / ligand / opløsningsmiddel | 60.1 / 60.1 / 0 / 52.7 | 62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5 |
| Ramachandran plot: mest begunstigede (%) / tilladt (%) | 98.1 / 1.9 | 97.2 / 2.8 |
| FBF-id | 6IBP | 6Q52 |
Tabel 1: Statistik over dataindsamling og -finjustering
§ Redundans-uafhængige Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Ii(hkl)-
£ Data med lav i ydre skal (<2.0) blev medtaget på grundlag af CC1/2-kriteriet (korrelation mellem to tilfældige halvdele af datasættet > 50%) som foreslået af Karplus & Diederichs 18.
Discussion
Nuværende protokoller i biokrystallografi indebærer fremstilling af krystaller ved hjælp af metoder som dampspredning eller batch13,14, og deres overførsel til en mikroloop til kryokøling15,16, før de udfører diffraktionsanalysen i en nitrogenstråle ved kryogene forhold. I modsætning hertil er direkte krystal kryokøling ikke mulig i ChipX3, og krystaller kan ikke udvindes fra deres mikrofluidiske kanal, hvilket kan ses som begrænsninger i denne opsætning. Den protokol, der er beskrevet i artiklen, giver imidlertid en fuldt integreret rørledning til bestemmelse af krystalstrukturer ved stuetemperatur (dvs. under mere fysiologiske forhold). Selv om dataindsamling ved stuetemperatur medfører en stigning i strålingsskader19, opvejes denne effekt af hurtig dataindsamlingstid (der indsamles maksimalt 60° rotation på hver krystal) og ved sammenlægning af flere delvise datasæt. Både ChipX-design og materiale blev optimeret til at reducere baggrundsspredning og diffraktionssignaldæmpning3, og dataindsamling kan udføres på krystaller med dimensioner svarende til halvdelen af kanalernes størrelse (40 μm)4.
Sammenfattende kan det siges, at de vigtigste fordele ved protokollen er følgende: Krystallerne produceres i et konvektionsfrit miljø (mikrofluidiske kanaler), hvilket er meget gunstigt for væksten af krystaller af høj kvalitet. Den modspredningsmetode, der implementeres i ChipX, er meget effektiv til at screene overmætningslandskabet; diffusionen af krystallanter i spånkanalen skaber en koncentrations- og overmætningsbølge, der hjælper med at bestemme passende kerne- og vækstbetingelser5. Krystaller håndteres aldrig direkte, men analyseres in situ, inde i chippen, som bevarer deres ægte diffraktionsegenskaber (dvs. ændrer ikke krystalmosaik ved fysisk interaktion eller cryocooling)20. Diffraktionsanalysen udføres på en række krystaller fordelt langs chipkanalerne med lav dosiseksponering for at minimere strålingsskader, og et komplet datasæt samles ved at fusionere delvise data fra serien. ChipX's standardfodaftryk og enkle design vil i fremtiden muliggøre en komplet automatisering af in situ-dataindsamling ved hjælp af synkrotron- eller XFEL-faciliteter. Alle trin i protokollen udføres i ChipX. Fra eksperimentatorens synspunkt er chipopsætning enkel og nem at udføre med standardpipetter og kræver ikke ekstra udstyr. Den trælignende kanalforbindelse ved prøveindløbet minimerer døde mængder i systemet, hvilket er vigtigt, når du arbejder med prøver, der er vanskelige at rense, eller som kun er tilgængelige i begrænset mængde.
Afslutningsvis forenkler og effektivt miniaturiserer lab-on-a-chip-tilgangen implementeret i ChipX processen med krystallisering ved at modvirke diffusion og krystalstrukturbestemmelse, hvilket gør det muligt at gå fra prøven til dens 3D-struktur i en enkelt enhed. Det er bredt anvendeligt og tilbyder en brugervenlig, omkostningseffektiv løsning til rutinemæssige serielle biokrystallografiundersøgelser ved stuetemperatur.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender den schweiziske lyskilde (Villigen, Schweiz) for beamtime tildeling til projektet på beamlines X10SA (PXII) og X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm for hendes bidrag til struktur raffinement, Clarissa Worsdale til optagelse af voiceover og François Schnell (Université de Strasbourg) for hans hjælp i videoredigering og SFX. Dette arbejde blev støttet af det franske center National de la Recherche Scientifique (CNRS), Universitetet i Strasbourg, LabEx-konsortiet "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), en ph.d.-finansiering til R.dW fra Excellence-initiativet (IdEx) fra Universitetet i Strasbourg inden for rammerne af det franske nationale program "Investissements d'Avenir", en ph.d.-finansiering til K.R. fra det fransk-tyske universitet (UFA-DFH, giv nr. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskud nr. Mo 634/10-1). Forfatterne nød godt af PROCOPE Hubert Curien samarbejdsprogram (det franske udenrigsministerium og Deutscher Akademischer Austauschdienst).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
| Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
| CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
| Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
| Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
| Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer - Representative results | |
| UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
| Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |
References
- Giegé, R., Sauter, C.
- Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).
- Pinker, F., et al. ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature. Crystal Growth & Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).
- de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).
- García-Ruiz, J. M.
- Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
- Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. Trace fluorescent labeling for protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).
- Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).
- Betat, H., Rammelt, C., Mörl, M. tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).
- Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., Jühling, F., Betat, H., Mörl, M. Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity. RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).
- Kabsch, W.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
- Dessau, M. A., Modis, Y.
- Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Giegé, R. Crystallization - General Methods. International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. , 99-120 (2012).
- Garman, E. "Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage. Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).
- Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -P., Weik, M. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).
- Nave, C. A.
